Phân lập và nghiên cứu đặc tính nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân Lignocellulose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




Hàn Thị Thu Hương



PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU
NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014













n









LỜI CẢM ƠN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




Hàn Thị Thu Hương


PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU
NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Vũ Nguyên Thành
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội, 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Vũ Nguyên Thành, Giám đốc
Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm và PGS. TS. Bùi
Thị Việt Hà, Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, Khoa sinh học, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực hiện luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ Trung tâm Vi sinh vật công
nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm đã tạo điều kiện và chỉ bảo cho tôi để tôi có
thể hoàn thành luận văn này.
Để có được ngày hôm nay tôi không thể quên được sự dìu dắt tận tình cùng
những kiến thức quý báu mà các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật học và các thầy
cô trong khoa Sinh học đã truyền dạy cho tôi trong suốt hai năm học tập tại trường.
Tôi cũng xin dành tình cảm cho gia đình,bạn bè những người đã ở bên động
viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua.


Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên


Hàn Thị Thu Hương



MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 2
1.1.1. Lignocellulose 2
1.1.1.1. Cellulose 3
1.1.1.2. Hemicellulose 4
1.1.1.3. Lignin 6
1.1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose 7
1.1.2.1. Cellullase 7
1.1.2.2. Hemicellulase 10
1.1.2.3. Ligninase 12
1.2. Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose 13
1.2.1. Nấm mốc chịu nhiệt 13
1.2.1.1. Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt 13
1.2.1.2. Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến 14
1.2.2. Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệt 17
1.2.2.1. Hoạt tính cellulase 17
1.2.2.2. Hoạt tính xylanase 19
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Đối tượng 21
2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 21
2.2.1. Hóa chất 21
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 22
2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 22
2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol 22
2.3.2. Môi trường PDA 22

2.3.3. Môi trường lên men lỏng 23
2.3.4. Môi trường YM 23
2.4. Phương pháp nghiên cứu 24
2.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt 24
2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 24

2.4.3. Tách chiết enzyme 24
2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS 24
2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS 26
2.4.6. Điện di protein 27
2.4.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE 27
2.4.6.2. Phương pháp điện di Zymogram 28
2.4.7. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc 29
2.4.8. Phương pháp tinh chế ADN 29
2.4.9. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing 30
2.4.10. Phương pháp điện di ADN 30
2.4.11. Nhuộm gel và đọc kết quả 31
2.4.12. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA 31
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt 33
3.1.1. Kết quả phân lập 33
3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào 34
3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 37
3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA 38
3.2. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập 40
3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose 40
3.2.2. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocelulose 50
3.2.3. Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhau 52
3.2.4. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme 58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64
KẾT LUẬN 64
KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông
nghiệp phổ biến và rác thải
Bảng 1.2. Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của
chúng
Bảng 1.3.

Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE
Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR fingerprinting
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS
Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được
Bảng 3.2. Ký hiệu các chủng trong phổ fingerprinting
Bảng 3.3. Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.5. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.6. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.7. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0
Bảng 3.8. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0
Bảng 3.9. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng
và 70˚C 20 phút
Bảng 3.10. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng
và 70˚C 20 phút



DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cellulose

Hình 1.3. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm
Hình 1.4. Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng
Hình 1.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus
Hình 1.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus
Hình 1.7. Khuẩn lạc và tế bào chủng Thermomyces lanuginosus
Hình 1.8. Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum
Hình 3.1. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.1
Hình 3.2. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.3
Hình 3.3. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.5
Hình 3.4. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 10.4
Hình 3.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 112.2
Hình 3.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 23.1
Hình 3.7. Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Hình 3.8. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Hình 3.9. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Hình 3.10. Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan của 46 chủng nấm
mốc chịu nhiệt



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp: Base pair (cặp bazơ)
CBH: Cellobiohydrolase
CBM: Carbohydrate-binding module
CE: Carbohydrate esterase
CMC: Carboxymethyl cellulose
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
DNS: Dinitrosalicylic acid
EG: Endoglucanase
FPU: Filter paper unit

GH: Glycoside hydrolase
ITS: Internal transcribed spacer
PCR: Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase)
PDA: Potato Dextrose Agar
SDS- PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
1
MỞ ĐẦU
Sự gia tăng tiêu thụ năng lượng, cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch và ô nhiễm
môi trường đã chuyển trọng tâm của thế hệ năng lượng theo hướng sử dụng nhiên
liệu sinh học với nguyên liệu là chất thải giàu lignocellulose của các ngành lâm
nghiệp, công nghiệp giấy và bột giấy, nông nghiệp và thực phẩm, rác thải đô thị rắn
và chất thải động vật. Sản xuất nhiên liệu từ sinh khối lignocellulose, với thành
phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose sẽ tạo tiền đề cho sự phát triển bền vững.
Mặc dù mang nhiều hứa hẹn, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học từ
lignocellulose hiện nay vẫn chưa khả thi trong sản xuất thương mại. Vấn đề cốt lõi
nằm ở tính bền vững của lignocellulose. Với hầu hết các công nghệ hiện hành,
lignocellulose trước tiên cần được thủy phân thành các monomer để tạo tiền chất
cho chuyển hóa sinh học hoặc hóa học. Trong công đoạn này, enzyme thủy phân
lignocellulose thường được sử dụng. Tuy nhiên, với các hệ enzyme hiện có, quá
trình thủy phân chưa thực sự hiệu quả về mặt kinh tế. Việc tìm kiếm các hệ enzyme
hiệu quả hơn đang được quan tâm đặc biệt.
Ngoài ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme thủy phân
lignocellulose còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chế biến nông sản, thực phẩm,
trong chăn nuôi, công nghiệp giấy, trong sản xuất hóa chất, xử lý môi trường. Nội
dung của đề tài nằm trong nỗ lực dài hạn nhằm khai thác đa dạng vi sinh vật nhiệt
đới cho các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau, trong trường hợp này là tìm
kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mới từ nấm mốc chịu nhiệt, nhóm vi

sinh vật rất ít được nghiên cứu tại Việt Nam.





Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
2
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose
1.1.1. Lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực
vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó
để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose,
hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose
được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1.1)

[41].

Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010).
Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác
nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền
phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau
giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
3

khác nhau trong cùng một cây. Thành phần của lignocellulose trong các loài thực
vật khác nhau được trình bày ở Bảng 1.1 [41].
Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông
nghiệp phổ biến.
Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)
Thân gỗ cứng 40–55 24–40 18–25
Thân gỗ mềm 45–50 25–35 25–35
Vỏ lạc 25–30 25–30 30–40
Lõi ngô 45 35 15
Giấy 85–99 0 0–15
Rơm lúa mì 30 50 15
Lá cây 15–20 80–85 0
Hạt bông 80–95 5–20 0
Cỏ ven biển Bermuda 25 35.7 6.4
Cỏ mềm 45 31.4 12.0
1.1.1.1. Cellulose
Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật và là một trong
những hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trong sinh quyển. Cellulose là polyme mạch
thẳng có công thức hóa học (C
6
H
10
O
5
)
n
(trong đó n khoảng 10 000 - 15 000 tùy
thuộc từng loại vật liệu). Một đơn vị lặp lại bao gồm 2 phân tử glucose liên kết với
nhau bằng liên kết cộng hóa trị giữa C1 của một phân tử glucose với C4 của phân tử
glucose kế tiếp, được gọi là liên kết -1,4 glycoside [63], [59]. Các phân tử

cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hydro. Các liên
kết hydro nội bộ và liên chuỗi mạng làm cho cellulose trở thành một polymer tương
đối ổn định, và mang lại độ cứng cho các sợi cellulose.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cellulose (Christiane Laine 2005).
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
4
Trong hệ sợi cellulose hình thành hai vùng: vùng tinh thể và vùng vô định
hình. Trong vùng tinh thể các sợi cellulose kết hợp với nhau theo một trật tự nhờ
liên kết hydro nối nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch kế
tiếp. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài.
Ngược lại các sợi cellulose trong vùng vô định hình liên kết với nhau khá lỏng lẻo
bởi lực Van der Waals do đó dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài [2]. Vùng vô
định hình cũng dễ bị tác nhân thủy phân tấn công hơn so với vùng tinh thể vì sự
thay đổi góc liên kết của các liên kết -1,4-glycoside làm giảm độ bền của liên kết
đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro. Chiều dài phân tử cellulose trong
vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose
tinh thể. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose tinh thể nhiều và ngược
lại các cây thảo mộc chứa nhiều cellulose vô định hình.
Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do,
hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc
acetyl tạo nên dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được
ứng dụng nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay
thế bằng gốc -OCH

COOH [1].
1.1.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose là polyme sinh học phong phú thứ hai trên trái đất, là

heteropolymer của đường 5 carbon (xylose và arabinose), đường 6 carbon (glucose,
galactose, mannose) và các acid (acetic). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và
đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung như mạch
chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-1,4, xylose là thành phần chủ
yếu, nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3, mạch
nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc
trisaccharide.
Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào
thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
5
xylopyranoside. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên.
Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl
và glucoronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không
cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Xylan đa dạng về cấu trúc và
khối lượng phân tử tùy thuộc vào loại thực vật, vị trí của nó ở các mô, tế bào. [41]

Hình 1.3. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm
(Christiane Laine 2005).

Hình 1.4. Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng
(Christiane Laine 2005).
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
6
Xylan tồn tại ở dạng arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm
(Hình 1.3) hay ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng

(Hình 1.4), hay thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có ete
4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc. [29], [63]
1.1.1.3. Lignin
Lignin là một trong những thành phần của tế bào thực vật bao bọc xung
quanh các sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose. Hàm lượng
lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loại cây mà còn phụ thuộc vào
tuổi cây, điều kiện địa lý. Trong thực vật lignin đóng vai trò chất kết nối, liên kết
các tế bào làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn
chặn độc tố đồng thời giúp thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Thực
vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn [1].
Lignin được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, và một vài đơn vị cấu
trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl
alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol [63]. Cấu trúc của lignin
rất đa dạng tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ. Ngoài
việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân
loại thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringy lignin. Lignin hoàn toàn
không đồng nhất trong cấu trúc, bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc
hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô
dịnh hình. Các vòng phenyl trong lignin gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt
phẳng thành tế bào. Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh
hưởng bởi mạng polysaccharide.
Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và
pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản
ứng cao hơn 200˚C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi
cellulose. Trong dinh dưỡng động vật lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu
hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ. Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
7

protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm
rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên
kết giữa lignin với các cacbonhydrate khác bị bẻ gẫy.
1.1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose
Để phân hủy một hợp chất polymer phức tạp như lignocellulose cần có sự
phối hợp hoạt động của nhiều enzyme ngoại bào của vi sinh vật. Các enzyme này
được phân loại là enzyme phân hủy carbohydrate (CAZymes) và enzyme oxy hóa
lignin (FOLymes) [6], [18]. Cellulase và hầu hết hemicellulase thuộc về một họ các
enzyme được gọi là Glycoside Hydrolase (GH). Sự phân loại Glycoside Hydrolase
vào các họ khác nhau dựa trên cơ sở tương đồng về trình tự axit, các protein trong
một họ nhất định sẽ có nếp gấp tương tự nhau cho phép mô hình hóa tương đồng
[10], [11], [12]. Vì vậy các enzyme đặc trưng với các cơ chất khác nhau đôi khi
được tìm thấy trong cùng một họ, cho thấy một sự phân kỳ tiến hóa để có được đặc
trưng mới. Hiện nay hơn 2500 GH đã được xác định và phân thành 133 họ bao gồm
các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật với các cơ chất khác nhau [9], [53], [61].
1.1.2.1. Cellullase
Cellulase là hệ enzym xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản
phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vị glucose.
Cellulase từ nấm mốc chủ yếu được tìm thấy trong một vài họ GH bao gồm GH 5,
6, 7, 8, 9, 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Cellulase sử dụng hai cơ chế xúc tác khác nhau
để thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong cellulose là cơ chế giữ và nghịch đảo.
Hầu như tất cả các cellulase GH thủy phân liên kết glycoside bởi cơ chế giữ trừ GH
6 sử dụng cơ chế nghịch đảo. Hầu hết các cellulase có một mô-đun liên kết
carbohydrate (CBM), các CBM có trách nhiệm liên kết các enzyme với vùng
cellulose tinh thể để tăng cường hoạt động của enzyme. Hiện nay nhiều CBM đã
được xác định và phân loại thành 54 họ, tuy nhiên chỉ có một số họ (1, 13, 14, 18-
21, 24, 29, 32, 35, 38, 39, 40, 42, 43, 47, 48, 50 và 52) được tìm thấy trong nấm
mốc [9], [18], [61]. Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên gồm 3 nhóm chủ yếu:
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
8
endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase. Mặc dù β-glucosidase không phân
hủy trực tiếp cellulose, nhưng nó vẫn được coi là một thành phần của hệ thống
cellulase vì nó kích thích quá trình thủy phân cellulose.
Bảng 1.2. Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của
chúng.
Enzyme
Cơ chất tối
ưu
Trọng lượng
phân tử
(kDa)
Nhiệt
độ tối
ưu
pH tối
ưu
Glycosyl
hóa
Endo-1,4-β-
glucanase
Cellulose vô
định hình
Monomer
(22-45)
50-70
Chủ yếu
4-5
Không có

hoặc rất thấp

Cellobiohydrola
se
Cellulose tinh
thể
Monomer
(50-65)
37-60
Chủ yếu
4-5
Không có
hoặc rất thấp

β-glucosidase
Cellobiose,
cellodextrin
Monomer,
dimer, trimer
(35-450)
45-75
Khác
nhau
Thường rất
cao
 Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4, endocellulase)
Endoglucanase (EG) hay còn được gọi là carboxymethylcellulase (CMCase)
thủy phân cellulose bằng cách tấn công các vùng vô định hình của cellulose, giải
phóng các chuỗi có chiều dài khác nhau, tạo điều kiện cho cellobiohydrolase dễ
dàng tiếp cận hơn. Nhóm enzyme này có pH tối ưu khoảng 4.0-5.0 và nhiệt độ tối

ưu 50-70ºC (Bảng 1.2) [53]. Các nghiên cứu đều cho thấy nấm mốc sản xuất rất
nhiều EG. Ví dụ, T. reesei sản xuất ít nhất 5 loại EG (EGI/Cel7B, EGII/Cel5A,
EGIII/Cel12A, EGIV/Cel61A và EGV/Cel45A), P. chrysosporium sản xuất 3 loại
(EG28, EG34 và EG44). [8], [31]
 Cellobiohydrolase (EC 3.3.1.91, exocellulase)
Cellobiohydrolase (CBH) là enzym phong phú nhất trong secretome của nấm
cellulolytic ưu tiên thủy phân liên kết β-1,4-glycoside từ đầu chuỗi giải phóng
cellobiose là sản phẩm chính và các saccharide nhỏ như cellotriose và cellotetraose
từ chuỗi cellulose. Tương tự như các EG, CBH là monomer hầu như không hoặc bị
glycosyl hóa thấp với pH tối ưu khoảng 4.0-5.0, nhưng phổ nhiệt độ tối ưu rộng
hơn, 37-60˚C (Bảng 1.2). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số CBH có thể hoạt
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
9
động từ đầu không khử và một số khác từ đầu khử trong những chuỗi cellulose, làm
tăng sức mạnh hoạt động giữa các enzyme có tính năng trái ngược. Ví dụ, T. reesei
có hai CBH phân cắt một từ đầu khử (CBHII/Cel6A) và một từ đầu không khử
(CBHI/Cel7A) [8], [26], [61]. Tuy nhiên đã có một cuộc tranh luận rằng CBH có
thể được gọi là exocellulase hay không, kể từ khi các phương pháp phân tích hoạt
tính gần đây chỉ ra rằng các CBH có thể thực hiện phân cắt nội chuỗi cellulose, tạo
ra hai đầu chuỗi mới mà từ đó chúng có thể tiến hành hoạt động dễ dàng hơn [7],
[17].
 β-glucosidase (EC 3.2.1.21)
β-glucosidase thủy phân cellobiose hòa tan và cellodextrins thành glucose. β-
glucosidase được đặt trong họ GH 1 và GH 3 dựa trên trình tự axit amin. Họ GH 3
bao gồm β-glucosidase từ nấm, vi khuẩn và thực vật trong khi họ GH 1 bao gồm β-
glucosidase từ vi khuẩn, thực vật và động vật có vú có hoạt động galactosidase. β-
glucosidase của cả 2 họ thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic bằng cơ chế giữ [24]. β-
glucosidase là enzyme thay đổi nhiều nhất trong số các enzyme thủy phân

lignocellulose do cấu trúc và sự phân bố không gian. Một số β-glucosidase có cấu
trúc monomer đơn giản với khối lượng phân tử khoảng 35 kDa (từ Pleurotus
ostreatus) [54], một số khác lại có cấu trúc dimer (từ Sporobolomyces singularis với
146 kDa) [42], thậm chí cấu trúc trimer với khối lượng hơn 450 kDa (từ Pisolithus
tinctorius) [20]. Hầu hết các β-glucosidase bị glycosyl hóa và trong một số trường
hợp, chẳng hạn như β-glucosidase monomer 300 kDa từ Trametes versicolor, mức
độ glycosyl hóa lên đến 90% [21]. pH tối ưu cho các enzym khác nhau dựa trên vị
trí không gian, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu chỉ dao động khoảng 45-75°C (Bảng 1.2).
Liên quan đến vị trí không gian, β-glucosidase có thể được nhóm lại thành ba loại
khác nhau bao gồm β-glucosidase nội bào, liên kết thành tế bào và ngoại bào [19].
Trong nấm mốc T. reesei, có hai β-glucosidases (BGLI/Cel3A & BGLII/Cel1A)
được tách chiết từ môi trường nuôi cấy, nhưng các enzyme được tìm thấy chủ yếu
được liên kết với thành tế bào. [47]
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
10
1.1.2.2. Hemicellulase
Hemicellulose chứa liên kết đường xương sống β-1,4 có thể được acetyl hóa
hoặc thay thế bằng đường mạch nhánh [62]. Với sự đa dạng của hemicellulose, phải
cần rất nhiều hydrolase glycoside, cũng như esterase carbohydrate tham gia phân
hủy chúng. Ví dụ, để phân cắt xylan yêu cầu hoạt động tổng hợp của xylanase,
xylosidase, arabinofuranosidase, galactosidase, deacetylase, glucuronidase, esterase
glucuronyl, và esterase feruloyl. Cũng giống như cellulase, rất nhiều các enzyme
hoạt động và được liên kết với các module carbohydrate để thúc đẩy hoạt động của
enzym trên cơ chất [25], [40]. Cho đến nay, hemicellulase nấm mốc đã được xác
định trong 19 họ GH: 1, 2, 3, 5, 10, 11, 26, 27, 36, 39, 43, 51, 53, 54, 62, 67, 74,
115 và 116 và 9 họ CE (carbohydrate esterase): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 15 và 16.
Bảng 1.3. Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE.
Enzyme Cơ chất EC Họ

Endo-β-1,4-xylanase β-1,4-xylan 3.2.1.8
GH 5, 8, 10, 11,
43
Exo-b-1,4-xylosidase
β-1,4-xylooligomers
Xylobiose
3.2.1.37
GH 3, 39, 43,
52, 54
α-L-
Arabinofuranosidase
α-Arabinofuranosyl
Xylooligomer
α-1,5-arabinan
3.2.1.55
GH 3, 43, 51,
54, 62
Endo-α-1,5-arabinanase α-1,5-arabinan 3.2.1.99 GH 43
α-Glucuronidase
4-O-methyl-α-glucuronic
acid Xylooligomer
3.2.1.139

GH 67
Endo-β-1,4-mannanase β-1,4-mannan 3.2.1.78 GH 5, 26
Exo-β-1,4-mannosidase

β-1,4-mannooligomer
Mannobiose
3.2.1.25 GH 1, 2, 5

α-galactosidase
α-galactopyranose
Mannooligomer
3.2.1.22 GH 4, 27, 36, 57
β-glucosidase
β-glucopyranose
Mannopyranose
3.2.1.21 GH 1, 3
Endo-galactanase β-1,4-galactan 3.2.1.89 GH 53
Acetyl xylan esterase 2- hoặc 3-O-acetyl xylan 3.1.1.72
CE 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7
Acetyl mannan esterase 2- or 3-O-acetyl mannan 3.1.1.6
Ferulic and p-cumaric
acid esterase
3.1.1.73 CE 1
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
11
 Xylanase/Xylosidase
Xylanase (EC 3.2.1.8) thủy phân liên kết β-1,4 xylan mạch chính, tạo ra các
xylooligomer ngắn. Hầu hết các xylanase được biết đến thuộc họ GH 10 và 11 (trên
300 trình tự gen được phát hiện), và khoảng 20 gen xylanase được phân bố giữa các
họ GH 5, 8 và 43. Xylanase GH 10 đặc hiệu cơ chất ít hơn so với họ enzym GH 11
và có thể thủy phân xylan có chứa mạch nhánh, trong khi xylanase họ GH 11 chỉ có
thể thủy phân xylan khi các mạch nhánh bị loại bỏ. Liên quan đến cơ chất đặc trưng
của xylanase, thông thường sự hiện diện 4-O-methyl-glucuronic acid và
arabinofuranose chuỗi bên cản trở sự liên kết và thủy phân của xylanase [5], [23].
β-Xylosidase (EC 3.2.1.37) là exo-glycosidase thủy phân các xylo-

oligosaccharide và xylobiose hòa tan thành xylose được tìm thấy trong các họ GH
3, 39, 43 , 52 và 54 (Bảng 1.3). Hầu hết các β-xylosidase được nghiên cứu cho đến
nay đều bị ức chế bởi xylose, sản phẩm thủy phân của chúng. Các enzyme này đóng
một vai trò quan trọng trong sư thủy phân xylan bằng cách giảm bớt sự ức chế sản
phẩm cuối cùng của endoxylanase [5], [23].
 β-Mannanase
β-Mannanase (EC 3.2.1.78) thủy phân mannan trên hemicellulose và giải
phóng chuỗi ngắn β-1,4-mannooligomer, hợp chất này có thể được tiếp tục thủy
phân thành mannose bởi β-mannosidase (EC 3.2.1.25). Hiện tại có khoảng 50 trình
tự gen β-mannanase trong họ GH 5 và 26 và khoảng 15 trình tự gen β- mannosidase
trong GH 1, 2 và 5. Điều thú vị là β-mannosidase cũng được tìm thấy trong động
vật bậc cao và có liên quan đến sự suy thoái glycoprotein lysosome [23].
 α-L-Arabinofuranosidase
L-Arabinose được tìm thấy trong các thành phần sinh khối hemicellulosic
khác nhau, chủ yếu là arabinoxylan, trong đó trục chính β-1,4-D-xylopyranosyl
được liên kết chuỗi bên với arabinose. α-L-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) và α-
L-arabinanase (EC 3.2.1.99) thủy phân liên kết arabinofuranosyl trên
hemicelluloses và được phân loại vào các họ GH 3, 43, 51, 54, 62. Cấu trúc tinh thể
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
12
của một α-L-arabinanase từ Cellvibrio japonicus là cấu trúc ba chiều đầu tiên được
biết đến của họ GH 43. Enzyme này có nếp gấp β năm cánh, và là enzym đầu tiên
được biết đến có cấu trúc liên kết này [5], [23].
 α-D-Glucuronidase
α-D-Glucuronidase phân cắt liên kết α-1,2-glycoside trong chuỗi bên 4-O-
methyl-D-glucuronic acid của xylan và chỉ được phân loại vào họ GH 67. Tính đặc
hiệu của α-D-glucuronidase khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme. Cấu trúc
tinh thể đầu tiên của một glycosidase GH67 được biết đến là một α-glucuronidase từ

Cellvibrio japonicus [23].
 Hemicellulolytic esterase
Hemicellulolytic esterases bao gồm acetyl xylan esterases (EC 3.1.1.72) thủy
phân nhóm thế acetyl trên nửa phân tử xylose, và feruloyl esterases (EC 3.1.1.73)
thủy phân liên kết este giữa nhóm thế arabinose và ferulic acid. Đây là liên kết este
cuối cùng kết nối xylan với lignin [23].
1.1.2.3. Ligninase
Hệ thống enzyme của sự phân hủy đại phân tử ligin hoạt động trong điều
kiện rất khó khăn. Cơ chất là những polymer lớn không đồng nhất đòi hỏi phải được
tấn công bằng những tác nhân enzyme ngoại bào. Lignin không chứa những liên kết
có thể thủy phân, tức là các enzyme phải là enzyme oxi hóa.
Năm 1938, Davidson phát hiện ra loại enzyme có khả năng thủy phân lignin
có tên là: phenoloxydase. Enzyme này được sinh tổng hợp bởi 1 số chủng nấm mốc.
Hiện nay các nhà khoa học đã chứng minh có 15 loại enzyme phenoloxydase và
được gọi chung là ligninase. Khi nghiên cứu về cơ chế tác dụng thì hệ enzyme này
hoàn toàn khác với các hệ enzyme khác. Ligninase không thủy phân lignin thành
các tiểu phần hòa tan như các hệ enzyme khác. Do cấu trúc của lignin rất chặt chẽ,
số liên kết yếu không nhiều nên enzyme rất khó tác động vào cơ chất. Mặt khác
enzyme ligninase lại rất khó hòa tan khiến phản ứng diễn ra rất hạn chế. Hệ thống
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
13
các enzyme liên quan tới quá trình phân hủy lignin khá đa dạng và không được đề
cập trong trong khuôn khổ của bản luận văn này.
1.2. Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose
1.2.1. Nấm mốc chịu nhiệt
1.2.1.1. Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt
Khái niệm “ưa nhiệt” được sử dụng với vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt
trong điều kiện nhiệt độ cao, thường khoảng 45-122°C. Khái niệm này thường chỉ

được sử dụng đối với vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn cổ (vi khuẩn ở miệng phun núi
lửa, suối nước nóng…). Trong giới nấm cũng có một nhóm nhỏ có thể sinh trưởng
trong điều kiện nhiệt độ lên đến 45-62°C. Tuy nhiên, dải nhiệt độ này đôi khi không
tối thích cho sinh trưởng của nấm mà chỉ là giới hạn nhiệt độ phát triển. Vì vậy,
khái niệm ưa nhiệt có vẻ sẽ không được sử dụng chính xác trong trường hợp này.
Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi sẽ sử dụng khái niệm “chịu nhiệt” thay cho
khái niệm “ưa nhiệt” khi đề cập tới nhóm nấm có khả năng phát triển ở nhiệt độ
cao.
Trong hơn bốn thập kỷ qua, nhiều loài nấm chịu nhiệt đã được phát hiện và
nghiên cứu [56]. Nấm mốc chịu nhiệt có mặt trong các loại đất và bên trong khối
thực vật đang phân hủy. Nấm mốc chịu nhiệt có thể tìm thấy trong phân ủ, đống cỏ
khô, ngũ cốc được lưu trữ, vật liệu làm tổ của các loài chim và động vật, rác thải
thành phố. Các chất hữu cơ khi được tích lũy trong môi trường ấm áp, ẩm ướt và
hiếu khí cung cấp điều kiện sinh lý cơ bản cho phát triển của nấm mốc chịu nhiệt.
Nấm mốc chịu nhiệt phổ biến trong môi trường axit hơn nhiều hơn so với môi
trường trung tính hoặc kiềm. Chúng thuộc các nhóm phân loại không đồng nhất của
các chi của Zygomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes và Mycelia Sterilia (nhóm
nấm không tạo bào tử). [56]
Khả năng chịu nhiệt của nấm không phải quá cao như với vi khuẩn thật hoặc
vi khuẩn cổ khi mà một số loài trong số đó có thể phát triển gần hoặc trên 100ºC
trong suối nước nóng, các miệng núi lửa phun khí sunfua đioxit, hoặc miệng phun
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
14
thủy nhiệt. Có lẽ vì mức độ chịu nhiệt vừa phải và môi trường sống không quá đặc
biệt nên nhóm nấm chịu nhiệt đã không nhận được nhiều sự chú ý. Khác với vi
khuẩn, sự thật là phần lớn các sinh vật nhân chuẩn không thể tồn tại lâu dài ở nhiệt
độ 40-45°C. Chỉ có khoảng 30 loài trong số khoảng 50.000 loài nấm được biết có
thể sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ nêu trên. Trong số đó, một số loài nấm cũng

có thể phát triển được ở nhiệt độ 60-62°C.
1.2.1.2. Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến
 Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus là một loại nấm nguy hiểm nhưng khá thú vị và rất
phổ biến bởi khả năng dinh dưỡng đa dạng. Aspergillus fumigatus có khả năng thủy
phân cellulose mạnh, có thể phát triển trên hydrocacbon dầu hỏa. Bào tử của loại
nấm này khi hít vào phổi có thể gây dị ứng. Chúng cũng có thể phát triển trong các
hốc phổi, gây bệnh aspergillomas. A. fumigatus được tìm thấy trong đất, các chất
hữu cơ được ủ đống Loại nấm này có thể phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, từ
12°C đến khoảng 52-55°C. Khuẩn lạc nấm được tạo nên từ rất nhiều hạt mốc có
màu xám xanh mọc trên đĩa thạch.

Hình 1.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus (Bộ sưu tập giống -
Viện Công nghiệp Thực phẩm)
 Rhizomucor pusillus
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
15
Rhizomucor pusillus là loài nấm mốc chịu nhiệt đầu tiên được tìm thấy. Loài
này được phân lập từ bánh mì và được Lindt mô tả từ khoảng hơn một thế kỷ trước.
49. Rhizomucor pusillus thường được tìm thấy trong đất và cát, mỏ than, đống cỏ
khô, lúa mạch lưu trữ hoặc đống phân ủ…[56].


Khuẩn lạc Rhizomucor pusillus lúc đầu trắng, sau chuyển sang màu xám nâu.
Loại nấm này tạo ra nhiều "lông tơ" sợi nấm trên không, thân có chứa bào tử (bào tử
nang) được phân nhánh và có túi bào tử nằm trên đầu nhánh. Các túi bào tử dễ vỡ
và giải phóng rất nhiều bào tử, để lại chỉ có một khu vực trung tâm phình ra (trụ
giữa) và còn sót lại thành của túi bào tử [56]. Với phạm vi nhiệt độ hoạt động từ 20-

55°C, Rhizomucor pusillus xuất hiện sớm trong đống ủ compost, sử dụng các loại
đường đơn giản, axit amin có mặt ban đầu trong nguyên liệu thực vật.

Hình 1.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus (Bộ sưu tập giống - Viện
Công nghiệp Thực phẩm)
 Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosus)
Thermomyces lanuginosus là loài nấm chịu nhiệt thứ hai được tìm thấy ngay
sau Rhizomucor pusillus. Thermomyces lanuginosus rất phổ biến và là đại diện điển
hình cho cộng đồng vi sinh vật chịu nhiệt. Loại nấm này phân bố rộng rãi trong đất,
hạt ngũ cốc, các loại đất mỏ than, phân ủ trồng nấm, cỏ khô, phân bón, lá cây mục,
đống ủ vườn, phân trâu bò, không khí và đống ủ cá thực vật khác nhau.
Thermomyces lanuginosus phát triển trong dải nhiệt từ 30C tới 52-55°C [56].
Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
16
Khuẩn lạc nấm ban đầu màu trắng, sau đó chuyển sang màu xám đến tím nâu,
bắt đầu từ trung tâm khuẩn lạc, tiết sắc tố đỏ thẫm vào môi trường. Sợi nấm
không màu, có vách ngăn, đường kính từ 1.5-4 m. Loại nấm này tạo bào tử hình
cầu ở đầu các nhánh. Lúc trưởng thành các bào tử có màu nâu, có lớp thành bọc
ngoài, đường kính khoảng 6-10 µm. [56]


Hình 1.7. Khuẩn lạc và tế bào chủng Thermomyces lanuginosus (Bộ sưu tập giống -
Viện Công nghiệp Thực phẩm).
 Scytalidium thermophilum
Các loài nấm được mô tả với khả năng thủy phân polysaccharide và trehalose
như Humicola insolens, H. grisea var. thermoidea hay Torula thermophila, thường
được tìm thấy trong compost nấm hoặc đất. Tất cả chúng ngày nay đều được biết
đến với tên duy nhất là Scytalidium thermophilum [34], [58]. Trong khuôn khổ luận

văn khi xem xét các bài báo, tên của các loại nấm này như báo cáo trong các bài báo
ban đầu được giữ lại.
Khuẩn lạc nấm có màu trắng lúc đầu nhưng ngay sau đó chuyển sang xám và
đen tuyền như bào tử trưởng thành. Sợi nấm không màu, phủ phục, phân nhánh, có
vách ngăn rộng 2-5 m. Bào tử màu nâu sẫm, có thành nhẵn bao quanh, mờ, thường
hình cầu, đường kính 7-12,5 m, hoặc hình bầu dục 11,2-14,6 x 7,5-10 m [56]
.

Luận văn thạc sĩ

Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học
17

Hình 1.8. Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum (Bộ sưu tập giống -
Viện Công nghiệp Thực phẩm).
1.2.2. Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệt
1.2.2.1. Hoạt tính cellulase
Hệ thống cellulase của nấm mốc chịu nhiệt cũng bao gồm ba enzym thủy
phân: endo-(1,4)–β-D-glucanase, cellobiohydrolase và β-glucosidase [13]. Một số
loài nấm chịu nhiệt phân hủy cellulose mạnh nhưng cellulase tách chiết từ canh
trường lại có hoạt tính rất thấp do sự phân hủy cellulose liên quan mật thiết tới hệ
sợi [51]. Cellulase của nấm mốc chịu nhiệt tác động ưu tiên lên cellulose tinh thể
hơn là cellulose vô định hình. Trừ một số trường hợp ngoại lệ như Thermoascus
aurantiacus [44], Humicola insolens [39], và H. grisea var. thermoidea [69], các
chủng nấm mốc này sản sinh cellulase và xylanase mạnh ngay cả trên cơ chất
hemicellulose không chứa cellulose. Với một số chủng Spothermophile rotrichum,
các disaccharide, cellobiose và lactose cũng cảm ứng quá trình sinh tổng hợp
cellulase, mặc dù hiệu quả thấp [37].
Thời điểm xuất hiện của các thành phần cellulase khác nhau thay đổi tùy vào
loài. Ở Humicola insolens [38] và Thermoascus aurantiacus [45], cả ba enzyme

cellulase xuất hiện đồng thời, trong khi đó với Chaetomium thermophile var.
coprophile [33], β-glucosidases được sản sinh trước, sau đó mới đến endo- và