Nghiên cứu vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô phân lập từ giếng khoan dầu khí vũng tàu

i



LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh
học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy
nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập
tại trường.
Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Văn Duy, Viện Công
nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang và TS. Nguyễn Thị Thu
Huyền, Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian
tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lại Thúy Hiền cùng toàn thể cán bộ
nghiên cứu Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt
nghiệp này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng tới Phòng Kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch
tễ đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp vừa qua.
Cuối cùng tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người
luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn
thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua.
Nha Trang, tháng 6 năm 2010
Sinh viên


Nguyễn Hoài Thu

ii



MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Thành phần, tính chất của dầu thô Việt Nam - Vũng Tàu 3
1.1.1. Thành phần nguyên tố của dầu thô 3
1.1.2. Tính chất vật lý của dầu thô 4
1.1.3. Thành phần hóa học của dầu thô 4
1.2. Khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí 6
1.3. Vi khuẩn khử sunphat 8
1.3. 1. Môi trƣờng sống 8
1.3.2. Phân loại vi khuẩn khử sunphat 9
1.3.3. Quá trình trao đổi chất và năng lƣợng 11
1.3.4. Khả năng sử dụng dầu thô là nguồn cơ chất 14
1.3.5. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của vi khuẩn khử sunphat 16
1.4. Vai trò của vi khuẩn khử sunphat trong thực tiễn cuộc sống 18
1.4.1 Ảnh hƣởng đến sinh thái và môi trƣờng 18
1.4.2. Ảnh hƣởng đến kinh tế và con ngƣời 19
Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. Vật liệu 22
2.1.1. Nguyên liệu 22

2.1. 2. Môi trƣờng nuôi cấy 22
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.2.1. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 23
iii



2.2.2. Đánh giá hàm lƣợng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ƣa
nhiệt 24
2.2.3. Phân lập đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng
dầu thô 24
2.2.4. Nghiên cứu hình thái tế bào, nhuộm Gram và khả năng hình thành bào tử
của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 25
2.2.5. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử
sunphat ƣa nhiệt 26
2.2.6. Nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử
sunphat ƣa nhiệt 26
2.2.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl đến quá trình sinh trƣởng
của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 27
2.2.8. Nghiên cứu ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh trƣởng của các đơn
chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 27
2.2.9. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trƣởng của các đơn
chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô 28
Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt lấy từ giếng
khoan dầu khí Vũng Tàu 29
3.2. Đánh giá hàm lƣợng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ƣa
nhiệt 31
3.3. Đặc điểm hình thái của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt có khả
năng sử dụng dầu thô 32

3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 33
3.3.2. Đặc điểm nhuộm Gram 34
3.3.3. Khả năng tạo bào tử 34
3.3.4. Đặc điểm hình thái tế bào 35
3.4. Khả năng chuyển hóa cơ chất của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 39
3.5. Khả năng sử dụng dầu thô của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 40
iv



3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến quá trình sinh trƣởng của các đơn chủng
vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 44
3.7. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh trƣởng của đơn chủng vi khuẩn khử
sunphat ƣa nhiệt 48
3.8. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trƣởng của các đơn chủng vi
khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 52
3.9. Đặc điểm phân loại 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
PHỤ LỤC




v



DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 1.1. Các cơ chất vi khuẩn khử sunphat sử dụng trong quá trình sinh trƣởng 13
Bảng 3.1. Khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt phân lập
từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu 29
Bảng 3.2. Hàm lƣợng dầu tổng số bị sử dụng bởi vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 32
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat
ƣa nhiệt 33
Bảng 3.4. Kết quả nhuộm Gram của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 34
Bảng 3.5. Khả năng chuyển hóa cơ chất lactat và axetat của đơn chủng vi khuẩn
khử sunphat ƣa nhiệt 40
Bảng 3.6. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành các của đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa
nhiệt trên môi trƣờng có hàm lƣợng dầu thô khác nhau 41
Bảng 3.7. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa
nhiệt trên môi trƣờng có nồng độ muối khác nhau 45
Bảng 3.8. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa
nhiệt trên môi trƣờng tại các pH khác nhau 49
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các đơn chủng vi khuẩn
khử sunphat ƣa nhiệt 52
Bảng 3.10. Đặc điểm phân loại của các đơn chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
có khả năng sử dụng dầu thô 53



vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1. Ảnh đơn chủng 110G6_KL2 sinh trƣởng trở lại trong môi trƣờng dầu
thô sau khi sốc nhiệt 35
Hình 3.2. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 70G3_KL1 đƣợc
quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 36
Hình 3.3. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 110G6_KL2 đƣợc
quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 36
Hình 3.4. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt ĐHG7 đƣợc quan
sát dƣới kính hiển vi điện tử 37
Hình 3.5. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt 802G8_KL1 đƣợc
quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 37
Hình 3.6. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt Đ914_KL2 đƣợc
quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 38
Hình 3.7. Ảnh tế bào chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt Đ1008G10_KL1
đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 38
Hình 3.8. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng 70G3_KL1 trên môi trƣờng có
hàm lƣợng dầu thô khác nhau 42
Hình 3.9. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng 110G6_KL2 trên môi trƣờng có
hàm lƣợng dầu thô khác nhau 42
Hình 3.10. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng ĐHG7 trên môi trƣờng có hàm
lƣợng dầu thô khác nhau 43

Hình 3.11. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng Đ914_KL2 trên môi trƣờng có
hàm lƣợng dầu thô khác nhau 43
Hình 3.12. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng 70G3_KL1 ở 55
o
C trên môi
trƣờng dầu thô 5% với các nồng độ NaCl khác nhau 46
Hình 3.13. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng 110G6_KL2 ở 55
o
C trên môi
trƣờng dầu thô 0,5% với các nồng độ NaCl khác nhau 46
vii



Hình 3.14. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng ĐHG7 ở 55
o
C trên môi trƣờng
dầu thô 0,5% với các nồng độ NaCl khác nhau 47
Hình 3.15. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng Đ914_KL2 ở 55
o

C trên môi
trƣờng dầu thô 0,5% với các nồng độ NaCl khác nhau 47
Hình 3.16. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng 70G3_KL1 ở 55
o
C trên môi
trƣờng dầu thô 5%, NaCl 1% với các pH môi trƣờng khác nhau 50
Hình 3.17. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng 110G6_KL2 ở 55
o
C trên môi
trƣờng dầu thô 0,5%, NaCl 3% với các pH môi trƣờng khác nhau 50
Hình 3.18. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng ĐHG7 ở 55
o
C trên môi trƣờng
dầu thô 0,5%, NaCl 1% với các pH môi trƣờng khác nhau 51
Hình 3.19. Hàm lƣợng H
2
S tạo thành của chủng Đ914_KL2 ở 55
o
C trên môi
trƣờng dầu thô 0,5%, NaCl 1% với các pH môi trƣờng khác nhau 51

1




MỞ ĐẦU

Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn rất đa dạng có khả năng sử dụng
sunphat làm chất nhận điện tử cuối cùng. Chúng là những vi khuẩn kị khí bắt buộc
phân bố khá rộng trên Trái đất. Chúng có trong đất, trong các vùng trầm tích, bùn lắng
ở các đáy ao tù, cống rãnh, sông hồ, biển, trong các vùng có điều kiện sống khắc
nghiệt nhƣ áp suất cao, nhiệt độ cao, độ mặn cao, hay môi trƣờng quá kiềm, quá axit…
và đặc biệt tồn tại với một số lƣợng lớn trong các mỏ dầu. Sự đa dạng cao của vi
khuẩn khử sunphat đƣợc tìm thấy ở các trầm tích biển, nơi có nồng độ sunphat cao
(28mM) [Cord-Ruwisch và cs, 1987].
Ngƣời ta biết đến loại vi khuẩn này sau khi Bejierink phân lập đầu tiên năm
1895. Từ đó đến nay vi khuẩn khử sunphat đƣợc các nhà khoa học thế giới đặc biệt
quan tâm vì vai trò quan trọng của chúng trong chu trình địa hóa của carbon, lƣu
huỳnh và quá trình hình thành dầu mỏ, cũng nhƣ những ứng dụng của nó trong việc
loại bỏ kim loại nặng. Tuy nhiên, vi khuẩn khử sunphat cũng gây ra những rắc rối
không nhỏ cho ngành công nghiệp và nông nghiệp, đặc biêt là ngành công nghiệp dầu
khí. Kể từ khi bắt đầu sản xuất thƣơng mại dầu khí khoảng 140 năm trƣớc, các kỹ sƣ
dầu khí và các nhà khoa học đã nhanh chóng nhận ra vi khuẩn khử sunphat là tác nhân
sản sinh khí H
2
S trong các giếng khoan, là nguyên nhân hàng đầu làm giảm giá trị
thƣơng mại của dầu thô. Sự có mặt của H
2
S không chỉ ảnh hƣởng đến sức khỏe công

nhân tại các giàn khoan, gây ăn mòn kim loại trong điều kiện kị khí mà còn làm giảm
hiệu quả tách nƣớc khỏi dầu, đồng thời gây nên mùi hôi khó chịu làm giảm chất lƣợng
các sản phầm dầu mỏ. Hơn nữa, cặn FeS sinh ra khi khí H
2
S kết hợp với ion sắt có
trong các thiết bị khai thác, vận chuyển và lƣu trữ các sản phẩm dầu mỏ sẽ gây tắc các
thiết bị khoan và bơm ép nƣớc [Gibson, 1990; Lại Thúy Hiền và Lê Phi Nga, 1992;
Rabus và cs, 1996; Lại Thúy Hiền và cs, 2003]. Với những thiệt hại to lớn mà chúng
gây ra cho ngành công nghiệp dầu khí, vi khuẩn khử sunphat luôn là đối tƣợng nghiên
cứu hàng đầu của các nhà khoa học trong lĩnh vực vi sinh vật dầu mỏ.
2




Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về vi sinh vật dầu mỏ, đặc biệt là vi khuẩn khử
sunphat luôn đƣợc quan tâm nghiên cứu song song với những bƣớc phát triển của
ngành công nghiệp dầu khí nƣớc nhà. Các nghiên cứu khu hệ vi sinh vật nói chung và
vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt nói riêng ở các giếng khoan dầu khí đã đạt đƣợc những
thành tựu nhất định [Lại Thúy Hiền và Đặng Phƣơng Nga, 1998; Lại Thúy Hiền và cs,
1991; 2003]. Tuy nhiên, khoảng 15 năm trở lại đây, các nhà khoa học trên thế giới lần
lƣợt chứng minh khả năng sử dụng dầu thô trong điều kiện kị khí của vi khuẩn khử
sunphat, hơn thế nữa, điều này lại rất phổ biến trong giếng khoan trên thế giới
[Aeckersberg và cs, 1991; Rueter và cs, 1994; So và Young, 1999; Harms và cs, 1999;
Ehrenreich và cs, 2000; Kniemeyer và cs, 2003; Rios-Hernandez và cs, 2003; Cravo-
Laureau và cs, 2004; Nakagawa và cs, 2008]. Nhƣ vậy, một lần nữa cho thấy tiềm ẩn
mối nguy mà nhóm vi khuẩn này gây ra cho ngành công nghiệp dầu khí. Tại Việt
Nam, các nghiên cứu về vi sinh vật sử dụng hydrocarbon dầu mỏ mới chỉ tiến hành
trên các đối tƣợng vi sinh vật hiếu khí [Lại Thúy Hiền và cs, 1996; 1997; 1999]. Do
đó, một câu hỏi đặt ra là các vi khuẩn khử sunphat trong các giếng khoan dầu khí Việt

Nam cũng có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất cho sự phát triển hay
không? Vì vậy, chúng tôi đã đề xuất và tiến hành đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn khử
sunphat ưa nhiệt có khả năng sử dụng dầu thô phân lập từ giếng khoan dầu khí
Vũng Tàu”. Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô
của vi khuẩn khử sunphat. Hi vọng đề tài sẽ góp phần giải quyết khó khăn do vi khuẩn
khử sunsphat gây ra cho nền công nghiệp dầu khí nƣớc nhà.











3




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Thành phần, tính chất của dầu thô Việt Nam - Vũng Tàu
Dầu thô là một hỗn hợp phức tạp, trong đó có hàng trăm các cấu tử khác nhau.
Mỗi loại dầu đƣợc đặc trƣng bởi thành phần riêng, song về bản chất, chúng đều có các
hydrocarbon là thành phần chính (chiếm 60 - 90% trọng lƣợng dầu), còn lại là các hợp
chất không hydrocarbon nhƣ: hợp chất chứa oxy (axit, keton, rƣợu), hợp chất chứa

nitơ (furol, indol, carbazol), hợp chất chứa lƣu huỳnh, hợp chất cao phân tử (hắc ín,
bitum) và các nguyên tố vi lƣợng. Dầu thô lấy từ những vùng dầu khác nhau có thành
phần hóa học khác nhau. Khi khảo sát thành phần của nhiều loại dầu mỏ, ngƣời ta thấy
không có loại dầu nào giống loại dầu nào, có bao nhiêu mỏ dầu thì có bấy nhiêu loại
dầu mỏ. Ngay trong một giếng khoan, dầu lấy từ những tầng chứa khác nhau cũng
khác nhau [Đinh Thị Ngọ, 2001].
1.1.1. Thành phần nguyên tố của dầu thô
Các nguyên tố chính tạo nên dầu mỏ là carbon và hydro. Hàm lƣợng carbon và
hydro trong dầu mỏ rất khác nhau, hàm lƣợng carbon có từ 83,5 - 87%, hàm lƣợng
hydro có từ 11,5 - 14. Hàm lƣợng nitơ trong dầu mỏ thấp, từ 0,001 - 0,3%. hàm lƣợng
oxy từ 0,1 - 0,3%. Hàm lƣợng lƣu huỳnh thay đổi trong khoảng rộng. Ngoài ra trong
dầu mỏ còn chứa một số kim loại nặng, hàm lƣợng rất nhỏ nhƣ: vanadi, niken, sắt,
magie, crom…[Đinh Thị Ngọ, 2001]
Dầu thô Việt Nam thuộc loại dầu Parafinic có đặc điểm: nhẹ, sạch, chứa rất ít
các độc tố, rất ít lƣu huỳnh, nitơ, kim loại nặng và là loại dầu chứa nhiều hydrocarbon
parafin, đặc biệt chứa nhiều hydrocarbon n- parafin C10 - C40. Theo tiêu chuẩn phân
loại của Liên Xô cũ thì dầu thô mỏ Bạch Hổ và mỏ Đại Hùng xếp loại 1/3, còn theo
tiêu chuẩn xếp loại của Viện khoáng sản Mỹ thì dầu thô mỏ Bạch Hổ xếp loại 2/9 và
dầu thô mỏ Đại Hùng xếp loại 5/9 [ Đinh Thị Ngọ, 2001].
4




1.1.2. Tính chất vật lý của dầu thô
Dầu mỏ là chất lỏng sánh, thƣờng có mùi đặc trƣng, nhẹ hơn nƣớc và không
hòa tan trong nƣớc. Dầu thô Việt Nam sánh đặc, có màu nâu đen là do có chứa nhiều
parafin, tỷ trọng khoảng từ 0,8 - 1%. Dầu mỏ chứa nhiều parafin có nhiệt độ nóng
chảy cao, có thể đông đặc ở nhiệt độ thƣờng (dầu thô mỏ Bạch Hổ đông đặc ở 33
o

C,
dầu thô mỏ Đại Hùng đông đặc ở 27
o
C) [ Đinh Thị Ngọ, 2001].
1.1.3. Thành phần hóa học của dầu thô
• Các hợp chất hydrocarbon của dầu thô
Hydrocarbon là thành phần chính và quan trọng nhất của dầu thô. Theo tài liệu
của Viện hóa dầu Liên bang Nga (1986) thành phần cơ bản của hydrocarbon trong dầu
thô gồm có:
- Hydrocarbon mạch thẳng (30 - 35%) gồm n-parafin và iso-parafin, là những
alkane mạch thẳng. Công thức tổng quát C
n
H
2n+2

- Hydrocarbon mạch vòng (25 - 75%). Công thức tổng quát C
n
H
2(n-m+1).

- Hydrocarbon thơm (10 - 20%), còn gọi là aren hay aromatic.
- Ngoài ra còn có một số loại hỗn hợp naphten – thơm.
Số nguyên tử carbon trong các loại hydrocarbon trong dầu thô thƣờng từ C
5
-
C
60
, tƣơng ứng với phân tử lƣợng từ 850 - 880. Bằng các phƣơng pháp hóa lý ngƣời ta
đã xác định đƣợc hơn 400 loại hydrocarbon khác nhau.
Các hydrocarbon có khối lƣợng phân tử thấp đến trung bình là các chất dễ bị

phân hủy sinh học, các hợp chất phân nhánh và nhiều vòng khó bị phân hủy hơn so với
các phân tử chuỗi thẳng và phân tử chỉ có một nhân thơm đơn giản. Khi độ dài tăng và
khối lƣợng phân tử đạt đến 500 thì chúng không còn là nguồn carbon cho vi sinh vật
đƣợc nữa. Khả năng sử dụng hydrocarbon dầu mỏ có thể sắp xếp theo thứ tự giảm dần
sau: n-alkane > alkane mạch thẳng phân nhánh > alkene phân nhánh > n- alkyl chứa
vòng thơm trọng lƣợng phân tử thấp > hợp chất một vòng thơm > alkane vòng > hợp
chất đa nhân > asphanten [Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007].
5




Các alkane mạch ngắn là chất độc đối với nhiều loại vi sinh vật, các alkane có
độ dài trung bình (C
10
- C
24
) dễ đƣợc vi sinh vật sử dụng nhất. Các alkane có mạch
càng dài thì khả năng vi sinh vật sử dụng càng khó. Các hydrocarbon n-parafin C
10
-
C
40
đƣợc gọi chung là parafin, có rất nhiều trong dầu thô Việt Nam. Về phƣơng diện
kinh tế, dầu thô nhiều parafin là nhƣợc điểm chính ảnh hƣởng đến giá cả do độ linh
động thấp, gây khó khăn khi vận chuyển, chế biến. Tuy nhiên, về mặt phân hủy sinh
học, parafin lại là cơ chất thích hợp cho vi sinh vật sử dụng [Đinh Thị Ngọ, 2001]. Vì
vậy, ta có cơ sở để nghĩ rằng, vi khuẩn khử sunphat phân lập từ các giếng khoan dầu
khí Vũng Tàu cũng có khả năng sử dụng và chuyển hóa đƣợc hydrocarbon dầu mỏ.
• Các hợp chất không hydrocarbon của dầu thô

Đây là những hợp chất mà trong thành phần của chúng có chứa oxy, nitơ, lƣu
huỳnh, tức là hợp chất hữu cơ của oxy, nitơ, lƣu huỳnh. Tuy nhiên thành phần nguyên
tố của oxy, nitơ, lƣu huỳnh trong dầu rất thấp, nhƣng vì những nguyên tố này nằm
trong một kết hợp phân tử của hydrocarbon nên trọng lƣợng phân tử của chúng cũng
tƣơng đƣơng với trọng lƣợng phân tử của hydrocarbon mà chúng đi theo [Đinh Thị
Ngọ, 2001].
• Các chất nhựa, asphanten của dầu thô
Các chất nhựa, asphanten của dầu thô là những chất mà trong cấu trúc phân tử
của nó ngoài carbon và hydro còn chứa đồng thời cả oxy, nitơ, lƣu huỳnh. Về cơ bản
chúng bao gồm nhiều vòng thơm ngƣng tụ lại, nối với nhau bằng các cầu nối là các
mạch parafin chứa các nguyên tố kim loại. Đây là những hợp chất có phân tử lƣợng rất
lớn, từ 500 - 600 trở lên. Chính vì vậy, các chất nhựa và asphanten chỉ thấy ở các phân
đoạn nặng và cặn của dầu thô.
Hàm lƣợng nhựa, asphanten có thể lên tới hàng chục phần trăm trong dầu mỏ.
Đối với dầu thô Bạch Hổ, hàm lƣợng các chất nhựa và asphanten rất thấp, chỉ có
1,97% nhựa, 0,77% asphanten; dầu thô Đại Hùng chỉ số cao hơn, hàm lƣợng chất nhựa
là 7,55% và hàm lƣợng asphanten là 2,5%. Tuy nhiên cả hai loại dầu thô này đều
thuộc loại dầu thô chứa ít chất nhựa và asphanten [Trần Mạnh Trí, 1996].
6




1.2. Khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí
Khi nghiên cứu vi sinh vật dầu mỏ, các nhà khoa học trên thế giới đã dành mối
quan tâm rất lớn cho việc nghiên cứu khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí.
Hai nhà khoa học Nga (Kuznhexov và Ivanov) đã tổng kết những nhóm vi sinh
vật có mặt ở các mỏ dầu Liên Xô cũ thành 2 nhóm: nhóm vi khuẩn hiếu khí gồm vi
khuẩn oxy hóa hydrocarbon, vi khuẩn Thiobacillus, vi khuẩn hoại sinh; nhóm vi khuẩn
kị khí gồm vi khuẩn khử sunphat, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn phân hủy xenluloza, vi

khuẩn sinh metan và vi khuẩn tía. Ở vùng dầu Tersko-Dagestan, số lƣợng vi khuẩn ở
nƣớc vỉa có dầu (115.10
3
- 495.10
3
tế bào/ml) cao hơn hẳn vỉa không có dầu (8.10
3
-
5.10
4
tế bào/ml). Ở vùng có nƣớc, có sự tƣơng tác với dầu, số lƣợng vi khuẩn nhiều và
đa dạng hơn vùng không có nƣớc và nƣớc không có dầu [Kuznhexov và Ivanov,
1963].
Ở Đức, Heyer và Schwartz đã phân lập hàng loạt vi khuẩn từ các kho chứa dầu
tự nhiên dƣới lòng đất. Khu hệ vi sinh vật dầu mỏ ở Đức gồm Pseudomonas, vi khuẩn
khử sunphat, Mycobacterium và Nocardia. Theo Cord-Ruwisch, Kleinitz và Widdel
(1987), số lƣợng vi khuẩn khử sunphat thuộc chi Desulfovibrio, Desulfobacter trong
các giếng khoan dầu khí Tây Đức lên đến 10
5
- 10
6
tế bào/ml [Cord-Ruwisch và cs,
1987].
Khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí đƣợc nghiên cứu nhiều ở
Trung Quốc từ 60 năm nay. Năm 1894, Wang công bố khu hệ vi sinh vật ở mỏ dầu
Laojunmiao (20 - 36
o
C) gồm có vi khuẩn hoại sinh, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn sử
dụng hydrocarbon và vi khuẩn khử sunphat (số lƣợng vi khuẩn khử sunphat lên tới 10
5

- 10
6
tế bào/ml). Các nhóm vi khuẩn hoạt động mạnh nhất ở vùng có sự kết hợp giữa
vi khuẩn khử sunphat và vi khuẩn oxy hóa hydrocarbon [Wang, 1984].
Tại Việt Nam, Lại Thúy Hiền và cộng sự (2005) đã có một số công trình nghiên
cứu về khu hệ vi sinh vật trong các giếng khoan dầu khí Vũng Tàu và Thái Bình. Khu
hệ vi sinh vật ở đây rất phong phú bao gồm các chi: Pseudomonas, Alcaligenes,
Bacillus, Chromohalobacter, Nocardia, Diplococus, Micrococcus, Rhodococcus,
7




Lactobacillus, Thiobacillus, Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum,
Desulfobacter và Desulfococcus. Ngoài ra còn có các vi khuẩn tạo khí metan, khử
nitrat, nấm mốc và một số vi khuẩn chƣa đƣợc định tên. Trong số các chi đã đƣợc
phân loại có một số loài chƣa từng đƣợc công bố ở các giếng khoan trên thế giới nhƣ
Desulfovibrio vietnamesis, Pseudonocardia alni và Chromohalobacter marismortui.
Khi phân tích thành phần vi sinh vật trong các mẫu nƣớc có nguồn gốc khác
nhau từ mỏ Bạch Hổ đã cho thấy ở các giếng khoan bơm ép nƣớc thƣờng có số lƣợng
vi sinh vật cao hơn hẳn các giếng khoan khai thác [Lại Thúy Hiền và cs, 2005]. Điều
này đƣợc giải thích rằng khi chƣa bơm ép nƣớc vào vỉa, bản thân ở các vỉa dầu đã tồn
tại một số loại vi khuẩn nhƣ vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt, không ƣa mặn, vi khuẩn
sử dụng hydrocarbon. Trong quá trình khoan khai thác, việc đƣa dung dịch khoan đã
kéo theo nhiều loại hóa chất, tinh bột, polysacarit, axit xitric… xuống giếng khoan.
Cùng với việc bơm ép nƣớc để duy trì áp suất vỉa đã tăng thêm nguồn dinh dƣỡng và
muối khoáng cho vi sinh vật phát triển, dẫn đến việc xuất hiện thêm nhiều loại vi
khuẩn khác nhƣ vi khuẩn tạo nhớt, Clostridium, vi khuẩn khử nitrat, vi khuẩn lên men
kị khí, vi khuẩn vi hiếu khí… [Lại Thúy Hiền, 1997].
Trong quá trình khai thác dầu mỏ, các kỹ sƣ dầu khí đã phải đối mặt với các

vấn đề do vi sinh vật gây ra. Đặc biệt vi khuẩn khử sunphat là tác nhân chính gây ảnh
hƣởng xấu đến ngành công nghiệp này. Do đó, vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi sinh
vật đƣợc nghiên cứu phổ biến nhất trong khu hệ vi sinh vật giếng khoan. Việc bơm ép
nƣớc biển vào giếng để tăng cƣờng hiệu suất thu hồi dầu không chỉ làm phong phú
thêm khu hệ vi sinh vật trong giếng khoan dầu khí mà còn làm biến đổi thành phần vi
khuẩn khử sunphat có trong giếng khoan, làm tăng thêm tính đa dạng của loài này.
Lysnes và cộng sự trong một nghiên cứu gần đây đã chứng minh đƣợc sự thay đổi
thành phần vi khuẩn khử sunphat thay trƣớc và sau khi bơm ép tại một giếng dầu ở
biển Bắc. Lysnes đã giải thích rằng nƣớc vỉa có chứa hàm lƣợng cao axit béo dễ bay
hơi, dẫn đến làm tăng số lƣợng vi khuẩn oxy hóa acid béo. Nếu sunphat có trong nƣớc
bơm ép thì cùng với việc tăng nhiệt độ trong giếng khoan, các axit béo này sẽ làm tăng
số lƣợng vi khuẩn ƣa nhiệt trong giếng khoan [Lysnes và cs, 2009].
8




1.3. Vi khuẩn khử sunphat
1.3. 1. Môi trƣờng sống
Từ khi đƣợc Bejierinck phân lập đầu tiên vào năm 1895 từ ống dẫn nƣớc cho
đến những nghiên cứu sau này về vi khuẩn khử sunphat đã cho thấy vi khuẩn này có
môi trƣờng sống rất đa dạng. Chúng là những vi khuẩn kị khí bắt buộc phân bố khá
rộng trên Trái đất. Mỗi môi trƣờng sống khác nhau đƣợc đặc trƣng bởi mỗi chi vi
khuẩn khử sunphat khác nhau. Nhóm vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt thƣờng đƣợc tìm
thấy ở các hệ sinh thái nóng nhƣ suối nƣớc nóng, mạch nƣớc ngầm sâu dƣới lòng đất,
các giếng dầu… Sự đa dạng cao của vi khuẩn khử sunphat đƣợc tìm thấy ở các trầm
tích biển, nơi có nồng độ sunphat cao (28mM) [Cord-Ruwisch và cs, 1987].
Trong những công trình nghiên cứu đầu tiên về vi khuẩn khử sunphat, ngƣời ta
đã nghĩ rằng vi khuẩn này là vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt. Tuy nhiên, khoảng 20 năm
trở lại đây quan điểm này đã thay đổi. Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng vi khuẩn khử

sunphat có khả năng chống chọi đƣợc với oxy. Theo báo cáo của Cypionka (2000), vi
khuẩn khử sunphat không chỉ sống đƣợc trong môi trƣờng có oxy nhiều giờ mà thậm
chí nhiều ngày và nhiều loài thậm chí có thể khử đƣợc oxy thành nƣớc. Quá trình này
có thể thực sự là quá trình hô hấp khi kết hợp với quá trình chuyển hóa năng lƣợng.
Ngƣời ta đã phát hiện thấy một số lƣợng lớn vi khuẩn khử sunphat trong các vùng hiếu
khí và vùng ranh giới giữa hiếu khí và kị khí của các trầm tích. Hầu hết các loài vi
khuẩn khử sunphat phân lập đƣợc từ những vị trí hiếu khí đều thuộc về hai chi
Desulfovibrio và Desulfomicrobium. Theo Cord-Ruwisch và cộng sự, khả năng sống
trong môi trƣờng có oxy của vi khuẩn khử sunphat có thể đƣợc giải thích nhƣ sau:
Trƣớc hết hô hấp của các vi khuẩn hiếu khí sẽ tiêu thụ oxy để tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn khử sunphat. Đồng thời, H
2
S do vi khuẩn khử
sunphat tạo ra là một chất khử, nó sẽ tác dụng với oxy ở điều kiện thƣờng làm giảm
nồng độ oxy ở khu vực đó [Cord-Ruwisch và cs, 1987]. Mặc dù để có thể thích nghi
với môi trƣờng, chúng có thể chống chọi với oxy. Tuy nhiên, do vi khuẩn này thƣờng
sử dụng các sản phẩm lên men đƣợc tạo thành trong điều kiện kị khí nên chúng không
thể có những thuận lợi trong quá trình cạnh tranh với vi sinh vật khác phát triển trong
9




môi trƣờng hiếu khí, do vậy, vi khuẩn khử sunphat vẫn là vi khuẩn kị khí [Cypionka,
2000].
Trong môi trƣờng hiếu khí, vi sinh vật dị dƣỡng có thể thực hiện quá trình
chuyển hóa hoàn toàn hợp chất hữu cơ thành CO
2
. Tuy nhiên, trong hệ sinh thái kị khí
thì sự chuyển hóa lại phức tạp hơn và đòi hỏi sự tƣơng tác của một lƣợng lớn các

nhóm vi khuẩn khác nhau [Vosjan, 1982]. Mỗi nhóm vi khuẩn thực hiện một quá trình
oxy hóa một phần hợp chất hữu cơ và sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của chúng lại
đƣợc đồng hóa bởi các thành tiếp theo của chuỗi thức ăn cho đến khi kết thúc quá trình
oxy hóa [Gibson, 1990]. Vi khuẩn khử sunphat trong điều kiện kị khí thƣờng đƣợc
nghiên cứu đặt trong mối quan hệ với hai nhóm vi khuẩn kị khí khác là vi khuẩn sinh
metan và vi khuẩn khử nitrat. Các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã
cho thấy có mối quan hệ hội sinh của vi khuẩn khử sunphat và vi khuẩn sinh metan, nhất
là trong điều kiện nƣớc biển và nƣớc vỉa dầu mỏ [Gibson, 1990; Lại Thúy Hiền, 1997].
Rõ ràng là vi khuẩn khử sunphat sống hội sinh với vi khuẩn sinh metan, khử không hoàn
toàn các hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trƣờng thành axetat và chính nguồn axetat này
lại là cơ chất cho các vi khuẩn sinh metan và các vi khuẩn sử dụng axetat sinh trƣởng phát
triển [Gibson, 1990]. Còn mối quan hệ của vi khuẩn khử sunphat và vi khuẩn khử nitrat
đang đƣợc các nhà nghiên cứu rất quan tâm vì có tính ứng dụng cao của nó [Voordouw và
cs, 1996; Lysnes và cs, 2009]. Lysnes gần đây đã phát hiện ra chủng khử nitrat ƣa nhiệt
phân lập từ giếng dầu vùng biển Bắc sử dụng cơ chất axit béo lại có khả năng sinh trƣởng
trên những nguồn cơ chất ƣa thích của vi khuẩn khử sunphat. Điều này đã tạo cơ sở mở ra
hƣớng ứng dụng mới: sử dụng nhóm vi khuẩn khử nitrat cho việc ức chế sự phát triển của
vi khuẩn khử sunphat trong các giếng khoan bằng phƣơng pháp sinh học thay cho hóa học
nhƣ hiện nay [Lysnes và cs, 2009].
1.3.2. Phân loại vi khuẩn khử sunphat
Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn có sinh lý phức tạp nhƣng có đặc điểm
chung là sử dụng sunphat (SO
4
2-
) làm chất nhận điện tử cuối cùng. Các loại vi khuẩn
khử sunphat khác nhau thể hiện ở nhiều đặc điểm nhƣ hình thái tế bào, khả năng di
động, khả năng hình thành bào tử, hàm lƣợng GC chứa trong ADN, desulfovibrin, hệ
10

thống cytochrome, nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng và khả năng trao đổi chất (oxy hóa
hoàn toàn hay không hoàn toàn cơ chất) [Castro và cs, 2000].
Nhóm vi khuẩn khử sunphat có hình dạng tế bào rất đa dạng tùy theo từng chi
(với kích thƣớc tế bào khoảng 0,3 - 1,5 µm x 0,8 - 10 µm): hình que nhƣ
Desulfobulbus, Desulfotomaculum, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfohabdus,
Thermodesulfatator, hình dấu phẩy nhƣ Desulfovibiro, Thermodesulfovibrio, hình
ovan nhƣ Desulfobacter, Desulfobacterium, hình cầu nhƣ Desulfococcus, hình túi
Desulfosarcina, hình sợi nhƣ Desulfonema [Cord-Ruwisch và cs, 1987; Devereux và
cs, 1989; Castro và cs, 2000].
Trong tự nhiên, vi khuẩn khử sunphat bơi tự nhiên hoặc bám vào giá thể nào
đó, nhất là các mẩu sắt, ống sắt. Tùy loài mà chúng có thể đứng đơn độc hay kết đôi,
hoặc xếp chuỗi ngắn, cũng có khi chúng tập hợp lại thành một đám lộn xộn [Irene và
cs, 2006]. Một số loài vi khuẩn khử sunphat chuyển động nhờ tiên mao hoặc một
chùm tiên mao, trong khi một số khác chỉ di động trong giai đoạn đầu của quá trình
phát triển, sau đó khả năng giảm dần và mất hẳn. Một số khác lại không có khả năng
di chuyển [Mandigan và cs, 2009].
Cho đến thời điểm này, đã có rất nhiều loại vi khuẩn khử sunphat đƣợc phát
hiện và phân loại. Với sự phát triển của kỹ thuật phân tích trình tự gen 16S rARN kết
hợp với các đặc điểm sinh lý trên đã xây dựng đƣợc cây phát sinh loài của vi khuẩn
này. Cây phát sinh loài cho thấy sự đa dạng rất cao số lƣợng loài của nhóm vi khuẩn
khử sunphat. Dựa trên trình tự phân tích rARN, vi khuẩn khử sunphat đƣợc chia thành
bốn nhóm chính: vi khuẩn khử sunphat Gram âm ƣa ấm; vi khuẩn khử sunphat Gram
dƣơng sinh bào tử; vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt và vi khuẩn khử sunphat cổ ƣa nhiệt
[Castro và cs, 2000].
Nhóm vi khuẩn khử sunphat Gram âm ƣa ấm gồm hai họ lớn là
Desulfovibrioaceae (gồm hai chi Desulfovibrio và Desulfomicrobium) và
Desulfobacteriaceae. Họ Desulfobacteriaceae phong phú về số chi hơn với khoảng gần
10 chi nhƣ Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobotulus, Desulfobacterium,

Desulfonema…Điều thú vị của họ Desulfobacteriaceae chính là khả năng hình thành
11




cụm vi khuẩn giúp chống lại những điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ quan sát thấy
ở Desulfosarcina hay khả năng di động cho phép chúng di chuyển đến những vùng có
nhiều chất dinh dƣỡng hơn [Castro và cs, 2000].
Ngƣợc lại với nhóm vi khuẩn khử sunphat Gram âm ƣa ấm, nhóm vi khuẩn khử
sunphat Gram dƣơng sinh bào tử có một số loài thích nghi đƣợc với môi trƣờng sống
có sự thay đổi của nhiệt độ từ ấm lên cao do chúng có cơ chế hình thành bào. Tuy vậy,
nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của nhóm vi khuẩn này là từ 25 - 40
o
C, một vài loài có
thể là từ 40 - 65
o
C. Đến nay chúng ta mới chỉ khám phá ra một chi Gram dƣơng có khả
năng sinh bào tử duy nhất là chi Desulfotomaculum. Với khả năng hình thành bào tử
khi gặp điều kiện sống khắc nghiệt nên chi Desulfotomaculum thƣờng đƣợc tìm thấy
trong các môi trƣờng sống mà ở đó khó bắt gặp các chi vi khuẩn khử sunphat ƣa ấm
khác (nhƣ các cánh đồng lúa nƣớc nơi có sự xen kẽ của điều kiện có oxy và thiếu oxy
do sự thay đổi mùa nƣớc lên) [Castro và cs, 2000].
Hai nhóm vi khuẩn khử sunphat còn lại là nhóm vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
và nhóm vi khuẩn cổ ƣa nhiệt (Archaea) đều đƣợc phân lập tại các môi trƣờng có nhiệt
độ cao nhƣ các giếng khoan sâu dƣới mặt đất có nhiệt độ lên tới 80
o
C. Các vi khuẩn
khử sunphat ƣa nhiệt chủ yếu là vi khuẩn Gram âm, thuộc các chi
Thermodesulfohabdus, Desulfacinium, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfatator

và Thermodesulfovibrio [Castro và cs, 2000; Muyzer và Stams, 2008]. Mặc dù, nhóm
này có nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng ở 55 - 75
o
C nhƣng chúng vẫn có thể sống ở
nhiệt độ thấp [Nilsen và cs, 1996]. Các loài thuộc chi Archaeoglobus, Caldivirga và
Thermocladium (đều đƣợc phân lập tại các hệ thống biển nóng) là những đại diện duy
nhất của vi khuẩn khử sunphat trong nhóm vi khuẩn cổ Archaea [Castro và cs, 2000;
Muyzer và Stams, 2008].
1.3.3. Quá trình trao đổi chất và năng lƣợng
Vi khuẩn khử sunphat thực hiện quá trình trao đổi chất và năng lƣợng của
chúng trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt và có thế oxy hóa khử E
h
< -150 mV. Sự có
mặt của oxy ảnh hƣởng tiêu cực đến sự phát triển của chúng. Nếu trong môi trƣờng có
oxy thì chỉ một số ít loài có thể tiếp tục sinh trƣởng. Trong điều kiện kị khí, dựa vào
12




quá trình trao đổi chất, vi khuẩn khử sunphat đƣợc chia thành hai nhóm chính. Các loài
thuộc nhóm thứ nhất tiến hành oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ với
axetat là sản phẩm cuối cùng. Đại diện của nhóm này có thể kể đến chi Desulfovibrio,
Desulfobulbus, Archaeoglobus…. Các loài thuộc nhóm thứ hai oxy hóa hoàn toàn chất
hữu cơ kể cả axetat thành CO
2
nhƣ Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfonema,
Thermodesulfobacterium… [Castro và cs, 2000; Magot và cs, 2000]. Hầu hết các loài
thuộc nhóm thứ nhất sinh trƣởng nhanh hơn nhóm hai, trong khi các loài thuộc nhóm
hai còn có thể hợp tác với các loài thuộc nhóm 1 bằng cách sử dụng axetat do các loài

thuộc nhóm một thải ra trong quá trình trao đổi chất [Cord-Ruwisch và cs, 1987].
Vi khuẩn khử sunphat có thể sử dụng đƣợc nhiều loại cơ chất khác nhau (bảng
1.1) [Cord-Ruwisch và cs, 1987; Devereux và cs, 1989; Aeckersberg và cs, 1991;
Rabus và cs, 1993; Hansen, 1994; Rueter và cs, 1994; Uberio và Bhattacharya, 1997;
Muller và cs, 1999; Reichenbecher và cs, 2000; Labes và Schonheit, 2001; Pas và cs,
2001; Rios-Hernandez và cs, 2003; Aitken và cs, 2004; Cravo-Laureau và cs, 2004;
Ommedal và Torsvik, 2007; Ahn và cs, 2009]. Một số chất này đƣợc nhiều chủng sử
dụng trong khi một số chất khác lại chỉ có thể là nguồn năng lƣợng cho duy nhất một
chủng. Chi Desulfovibrio và các chi khác thuộc nhóm vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt
Gram âm nhƣ đã nói ở mục (1.3.2) là những loài hẹp về cơ chất (chỉ gồm hydro, lactat,
pyruvat), trái lại, chi Desulfotomaculum lại đƣợc biết đến là chi có khả năng sử dụng
nguồn cơ chất rất linh động. Nó sử dụng rất nhiều chất làm chất cho điện tử cho quá
trình sinh trƣởng và phát triển của mình [Castro và cs, 2000].







13




Bảng 1.1. Các cơ chất vi khuẩn khử sunphat sử dụng trong quá trình sinh trƣởng
Loại hợp chất
Các hợp chất đƣợc sử dụng
Chất vô cơ
H

2
; CO
2

Axit monocarboxylic
Focmat; axetat; propionat; butyrat; isobutyrat; 2-
metylbutyrat; 3-metylbutyrat; 3-metylvalerat;
pyruvat; lactat
Axit dicacboxylic
Succinat; fumarat; malat; oxalat; malenat; glutarat
Rƣợu
Metanol; etanol; propanol; butanol; pentanol;
isobutanol; etylen glycol (mono-, di-, và tetra); 1,2-
propandiol; 1,3-propandiol; glyxerol
Axit amin
Glyxin; serin; alanin; cystein; cystin; treonin, valin;
leuxin; isoleuxin; aspartat; glutamat; phenyl alanin
Cacbonhydrat
Fructoz; glucoz; mannoz; xyloza; rhamnoz; tinh bột
Hydrocacbon
Hexadecan, hexadecanoat, benzoat; 2-, 3-, và 4-
hydroxybenzoat; phenol; p-cresol; catechol;
resorcinol; hydroquinon; phlorglucinol; pyrogallol;
axit nicotinic; indol; quiolin; phenylacet;
naphthalen, 2-methylnaphthalen; tetralin; xylen;
toluene; ethylbenzen; ethylcyclopentan
Các hợp chất khác
Cholin; betain; oxamat; axeton; cyclohexanol; và
một số các hợp chất vòng no khác

Nhƣ vậy ta có thể thấy vi khuẩn khử sunphat sử dụng các loại cơ chất khác
nhau từ những hợp chất hữu cơ đơn giản nhƣ hydro, lactat… cho đến những hợp chất
phức tạp hơn nhƣ các hydratcarbon, hydrocarbon. Đặc biệt là trong những năm gần
đây, các nhà nghiên cứu ngày càng phát hiện ra nhiều hợp chất hydrocarbon dầu mỏ
14




mà vi khuẩn khử sunphat có thể làm nguồn cơ chất [Aeckersberg và cs, 1991; Rabus
và cs, 1993; Rueter và cs, 1994; Reichenbecher và cs, 2000; Rios-Hernandez và cs,
2003; Aitken và cs, 2004; Cravo-Laureau và cs, 2004; Ommedal và Torsvik, 2007].
1.3.4. Khả năng sử dụng dầu thô là nguồn cơ chất
Nhƣ đã nói ở phần (1.1), hydrocarbon là thành phần chính của dầu mỏ và đƣợc
sử dụng rộng rãi nhƣ là một nguồn nhiên liệu và hóa chất. Tuy nhiên, trƣớc khi dầu mỏ
đƣợc con ngƣời khai thác từ lòng đất hay từ sâu dƣới đại dƣơng để đƣa vào sử dụng
trong công nghiệp thì đã có sự tích lũy các hydrocarbon này trong môi trƣờng sống do
quá trình rò rỉ tự nhiên. Do đó, có khả năng các hydrocarbon đã đƣợc phân bố mọi nơi
trên Trái đất trong suốt quá trình lịch sử. Điều này có thể giải thích đƣợc tại sao có rất
nhiều loài vi sinh vật đã tiến hóa khả năng chuyển hóa để sử dụng các hợp chất này là
nguồn carbon trong quá trình sinh tổng hợp tế bào hay là chất cho điện tử trong các
quá trình oxy hóa khử [Spormann và Widdel, 2000].
Nếu nhƣ các nghiên cứu về vi sinh vật hiếu khí có khả năng sử dụng
hydrocarbon là nguồn cơ chất đƣợc bắt đầu từ hơn một thế kỉ qua thì vi sinh vật kị khí
(đặc biệt là vi khuẩn khử sunphat) có khả năng sử dụng hydrocarcon lại mới chỉ thật
sự đƣợc quan tâm nghiên cứu khoảng 20 năm trở lại đây. Các loại hydrocarbon khác
nhau lại có khả năng là nguồn cơ chất cho một hoặc nhiều loài vi khuẩn khử sunphat
khác nhau. Công trình then chốt của Aeckersberg và cộng sự (1991) đã chứng minh có
sự phân hủy alkane trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt của một chủng vi khuẩn khử
sunphat. Sau đó, Rueter và cộng sự (1994) cũng đã phân lập đƣợc một loại vi khuẩn

khử sunphat ƣa nhiệt từ trầm tích giếng dầu vịnh Mexico cũng có khả năng sử dụng
alkane. Cùng với một loạt các nghiên cứu sau này [So và Young, 1999; Ehrenreich và
cs, 2000; Cravo-Laureau và cs, 2004] đều đã chứng minh vi khuẩn khử sunphat sử
dụng alkane là nguồn cơ chất và chuyển hóa hoàn toàn thành CO
2
và nƣớc. Những
nghiên cứu này cũng chỉ ra vi khuẩn khử sunphat sử dụng alkane đều thuộc nhóm
Deltaproteobacteria có tế bào hình que hay hình ovan [Irea và cs, 2006].
Không chỉ có alkane của dầu thô mới đƣợc nhóm vi khuẩn khử sunphat sử
dụng, mà một thành phần quan trọng trong dầu thô là các hydrocarbon vòng thơm
15




cũng là một nguồn chất cho điện tử của nhóm vi khuẩn này. Các ankylhydrocarbon
một vòng thơm nhƣ benzen, toluen, ethylbenzen, xylen (o- , m- , p- xylen) gọi chung là
hợp chất BTEX là những chất độc đối với vi sinh vật cũng có khả năng đƣợc phân hủy
bởi vi khuẩn khử sunphat [Beller và cs, 1992; Rabus và cs, 1993; Harms và cs, 1999;
Kniemeyer và cs, 2003; Nakagawa và cs, 2008]. Những nghiên cứu này đã kết luận
rằng: (1) Tất cả các chủng vi khuẩn khử sunphat có khả năng sử dụng các hợp chất
thơm đều thuộc về họ Desulfobacteriaceae; (2) Hầu hết chúng oxy hoàn toàn các hợp
chất này thành CO
2
và nƣớc; (3) Chi Desulfovibiro không có khả năng sử dụng
hydrocarbon thơm của dầu thô, chỉ có các alkane mạch thẳng (parafin) mới là nguồn
cơ chất cho nhóm này. Gần đây, các nhà khoa học tiếp tục khám phá thêm khả năng
phân hủy hợp chất hydrocarbon thơm vòng đôi naphthalen và 2-methylnaphthalen
trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt ở chủng vi khuẩn khử sunphat NapHS
2

biển phân
lập từ trầm tích vùng biển Địa Trung Hải [Musat và cs, 2009].
Các hydrocarbon mạch vòng (alicyclic hydrocarbon) chiếm 12% trong thành
phần dầu thô cũng đƣợc nghiên cứu khả năng sử dụng làm nguồn chất cho điện tử
trong điều kiện khử sunphat. Cơ chất đƣợc lựa chọn cho mô hình nghiên cứu là
ethylcyclopectane (ECP) cho thấy sự phân hủy ECP có liên quan đến chi
Desulfobacter [Rios-Hernandez và cs, 2003].
Nhƣ vậy ta có thể thấy rằng việc phân hủy kị khí các hydrocarbon dầu thô bởi
nhóm vi khuẩn khử sunphat là một hiện tƣợng phổ biến hơn ta nghĩ trƣớc đây. Tuy đã
có rất nhiều nghiên cứu các cơ chất dầu mà vi khuẩn khử sunphat sử dụng, nhƣng cho
đến thời điểm này, chƣa có một công trình nghiên cứu nào đƣa ra cơ chế con đƣờng
phân hủy kị khí các hydrocarcon này một cách hoàn chỉnh vì đó thực sự là một quá
trình phức tạp đi qua rất nhiều cơ chất trung gian. Có lẽ phải cần thêm một thời gian
nghiên cứu sâu hơn nữa thì các cơ chế này mới đƣợc làm sáng tỏ.



16




1.3.5. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của vi khuẩn khử sunphat
Hoạt động của vi sinh vật trong tự nhiên chịu ảnh hƣởng nhiều của các yếu tố
vật lý, hóa học. Những yếu tố này ảnh hƣởng không những đến độ lớn và thành phần
loài của các quần thể vi sinh vật mà còn ảnh hƣởng đến hình thái và sinh lý của chúng.
Ở một số loài, nếu các yếu tố nhƣ nhiệt độ, nồng độ muối và pH ở cao hơn hoặc thấp
hơn mức tối ƣu thì có thể dẫn tới sự thay đổi đáng kể về trao đổi chất, hình dạng tế bào
và quá trình sinh sản [Rheiheimer, 1985]. Tuy rằng, trong các môi trƣờng sống tự
nhiên có rất nhiều các yếu tố khác nhau tác động lên các cơ thể sống, song một số yếu

tố trong chúng bao giờ cũng có ý nghĩa đặc biệt. Đó là những yếu tố giới hạn khả năng
sống của các vi sinh vật ở một mức độ nhất định. Trong đó, ba yếu tố chính đƣợc coi
là đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh trƣởng của vi khuẩn khử sunphat
là nhiệt độ, độ mặn và pH.
1.3.5.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng đặc biệt quan trọng đến quá trình sinh trƣởng của vi
khuẩn khử sunphat. Nhiệt độ ảnh hƣởng đến phản ứng khử sunphat, sự tạo thành H
2
S
và sự oxy hóa cơ chất cũng nhƣ hình thái tế bào. Theo báo cáo của Mueller và Nielsen,
ở một số chủng vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt, phản ứng khử sunphat quan sát đƣợc ở
nhiệt độ 35 - 75
o
C và trong khoảng nhiệt độ 50 - 60
o
C sự khử sunphat xảy ra với tốc
độ cao nhất. Ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn, phản ứng khử sunphat xảy ra với tốc
độ thấp hơn và pha lag kéo dài hơn [Muller và Nielsen, 1996]. Hình thái tế bào rất
khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau. Thể tích tế bào càng tăng khi nhiệt độ tăng
[Canganella và cs, 2000]. Đối với các mẫu lấy từ vùng Alaska và biển Bắc ở nhiệt độ
35
o
C các tế bào hình que có kích thƣớc trong khoảng 0,3 - 0,6 m 1,5 - 3 m chiếm
ƣu thế trong khi đó ở 50
o
C các tế bào có dạng sợi dài từ 5 - 50 m lại chiếm ƣu thế. Ở
60
o
C, các tế bào chiếm ƣu thế dài từ 2 - 4 m và có đƣờng kính từ 0,3 - 0,7 m còn tế
bào chiếm ƣu thế ở 75

o
C lại là tế bào hình cầu nhỏ với đƣờng kính trong khoảng 0,2 -
0,5 m [Muller và Nielsen, 1996].
17




Trong tự nhiên, vi khuẩn khử sunphat sống đƣợc ở nhiều điều kiện nhiệt độ
khác nhau từ 0
o
C đến 100
o
C. Một số chủng thuộc chi Desulfovibrio có khả năng phát
triển ở nhiệt độ 0
o
C thậm chí dƣới 0
o
C. Do việc lấy mẫu cũng nhƣ nuôi cấy vi khuẩn
khử sunphat ƣa lạnh gặp nhiều khó khăn nên nhóm vi khuẩn này chƣa đƣợc quan tâm
nghiên cứu nhiều. Các vi khuẩn khử sunphat ƣa ấm có thể sống đƣợc trong khoảng
nhiệt độ 4 - 65
o
C trong đó nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng trong khoảng 29 - 42
o
C
[Cord-Ruwisch và cs, 1987; Lại Thúy Hiền và Đặng Phƣơng Nga, 1998; Castro và cs,
2000]. Vi khuẩn khử sunphat ƣa nhiệt lại có thể sống trong khoảng nhiệt độ 40 - 89
o
C

và nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của chúng là 55 - 76
o
C [Castro và cs, 2000; Lại
Thúy Hiền và cs, 2003; Madigan và cs, 2009]. Còn đối với vi khuẩn khử sunphat siêu
ƣa nhiệt, nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của chúng là 80 - 92
o
C. Đồng thời, nếu nhiệt
độ nhỏ hơn 46
o
C hoặc lớn hơn 110
o
C thì chúng không thể sống đƣợc [Fadeau và cs,
1997; Takahata và cs, 2000].
1.3.5.2. NaCl
Vi khuẩn khử sunphat đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng nƣớc tự nhiên có nồng
độ muối NaCl từ 0% đến bão hòa. Tùy từng loài mà nhu cầu NaCl khác nhau. Có
những loài không cần cung cấp NaCl trong môi trƣờng nuôi cấy nhƣ các loài vi khuẩn
khử sunphat nƣớc ngọt. Chúng có thể bị ức chế nế nồng độ NaCl > 2 - 3%. Ngƣợc lại,
nhiều loài phân lập đƣợc từ nƣớc biển lại rất cần NaCl trong môi trƣờng sống. Chúng
không thể sinh trƣởng đƣợc trong môi trƣờng nƣớc ngọt mà đòi hỏi 10 - 30 g NaCl/l
và thỉnh thoảng cần cả muối magie cho quá trình sinh trƣởng. Trong môi trƣờng mặn
tự nhiên nhƣ hồ muối NaCl, ngƣời ta thấy vi khuẩn khử sunphat vẫn hoạt động ở nồng
độ muối NaCl gần bão hòa [Dang và cs, 1996]. Tuy nhiên, chƣa có báo cáo nào khẳng
định vi khuẩn khử sunphat ƣa mặn lại đòi hỏi nồng độ muối NaCl cao cho sinh trƣởng
tối ƣu. Một vài vi khuẩn khử sunphat có thể chịu đƣợc nồng độ muối NaCl cao hơn
mặc dù hoạt động của chúng bị giảm bớt khi nồng độ NaCl tăng lên đến 5 - 10%
[Cord-Ruwisch và cs, 1987].
Vi khuẩn ƣa ấm có khả năng chịu mặn cao, chẳng hạn Desulfovibrio
vietnamensis có khả năng chịu mặn đến nồng độ 30% NaCl. Tuy nhiên, loài này cũng
18

có thể sống ở nồng độ 0% NaCl và thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng ở 5% NaCl
[Dang và cs, 1996]. Đối với vi khuẩn ƣa nhiệt thì khoảng nồng độ NaCl mà chúng có
thể sinh trƣởng đƣợc là 0 - 6% và thích hợp nhất là 1 - 2% [Rosnes và Torsvik, 1991;
Nilsen và cs, 1996] trong khi đó nồng độ NaCl đối với vi khuẩn siêu ƣa nhiệt là 1 - 2%
NaCl [Fadeau và cs,1997; Takahata và cs, 2000].
1.3.5.3. pH
Sự sinh trƣởng và sinh sản của vi khuẩn khử sunphat bị ảnh hƣởng mạnh bởi
pH môi trƣờng. Khoảng pH thích hợp của vi khuẩn khử sunphat nằm trong khoảng từ
6 - 9. Tuy nhiên, đối với từng loại vi khuẩn khử sunphat lại có pH thích hợp riêng.
Chẳng hạn: vi khuẩn khử sunphat ƣa ấm có pH thích hợp nằm khoảng 6,8 - 7,5. Tuy
vậy, chúng vẫn có thể sống đƣợc nếu pH giảm xuống đến 5 hay tăng lên đến 10 [Dang
và cs, 1996]. Còn đối với vi khuẩn ƣa nhiệt, chúng có thể sống trong khoảng pH từ 5,5
- 9,1 và thích hợp nhất trong khoảng 6,8 - 7,5 [Rosnes và cs, 1991]. Trong khi đó, pH
thích hợp với vi khuẩn rất ƣa nhiệt là 6 - 7 và khoảng pH mà chúng có thể sống đƣợc
là 5,2 - 9 [Fadeau và cs, 1997; Takahata và cs, 2000].
Trong môi trƣờng có pH không thích hợp, vi khuẩn khử sunphat vẫn sống đƣợc
do chúng vẫn có thể sinh trƣởng trong các ổ sinh thái hẹp có pH trung tính đƣợc tạo
nên bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng. Hệ HS/H
2
S và HCO
3
-
/CO
2
đóng vai trò nhƣ
một hệ đệm đã giúp chúng chống lại những điều kiện không phù hợp [Cord-Ruwisch

và cs, 1987].

1.4. Vai trò của vi khuẩn khử sunphat trong thực tiễn cuộc sống
1.4.1 Ảnh hƣởng đến sinh thái và môi trƣờng
Vi khuẩn khử sunphat là nhóm vi khuẩn phân bố khá rộng trong tự nhiên, đặc
biệt ở những nơi có hàm lƣợng sunphat cao (28 mM) nhƣ trong nƣớc biển hay trong
các trầm tích đáy ao, sông, biển. Đặc trƣng quan trọng nhất của vi khuẩn khử sunphat
là tạo ra khí H
2
S trong quá trình sinh trƣởng, cũng chính điều này đã gây ảnh hƣởng
không tốt cho hệ sinh thái có sự xuất hiện nhóm vi khuẩn này. H
2
S là chất khí có mùi