Nghiên cứu tạo vật liệu in vitro và bước đầu nhân nhanh cây xạ đen bằng phương pháp tạo đa chồi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
************


DƯƠNG THỊ MINH



NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO
VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật







HÀ NỘI - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
************


DƯƠNG THỊ MINH



NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO
VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học
Th.S LA VIỆT HỒNG
Th.S ONG XUÂN PHONG




HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Th.S La Việt
Hồng và Th.S Ong Xuân Phong đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên
khích lệ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ đang công tác tại Trung tâm Hỗ
trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện, môi trường làm việc tốt nhất cho em thực
hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài.
Em xin cảm ơn tới toàn thể các thầy cô đang công tác tại khoa Sinh –
KTNN, đó là những người đã cho em nguồn kiến thức vô cùng quý giá để em
có thể hoàn thành tốt đề tài.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn.

Ngày 19 tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện



Dương Thị Minh

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và xuất phát từ các
nghiên cứu thực nghiệm mà chúng em đã tiến hành trên đối tượng Xạ đen và
không trùng lặp với kết quả của tác giả khác.

.
Ngày 19 tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện



Dương Thị Minh





DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 13
Hình 1.2. Quả cây Xạ đen 13

Hình 3.1. Các bước tạo vật liệu vô trùng in vitro cây Xạ đen 23

Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hiệu quả khử trùng của chất khử trùng 25

Hình 3.3. Mẫu vô trùng sống phát sinh chồi 27

Hình 3.4. Mẫu vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) 27

Hình 3.5. Khối mô sẹo sau 7 ngày theo dõi 28

Hình 3.6. Khối mô sẹo sau 15 ngày theo dõi 28
Hình 3.7. Chồi mới tạo ra và sinh trưởng mạnh 30
Hình 3.8. Chồi mới không phát triển 30
Hình 3.9. Không tạo chồi mới 31
Hình 3.10. Chồi mới tạo ra chậm phát triển 31
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hệ số nhân chồi ở các môi trường của cây
Xạ đen 31












DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và thời gian
xử lý mẫu 9
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 17
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro 19
Bảng 3.1. Tạo vật liệu in vitro sau 5 ngày nuôi cấy 24
Bảng 3.2. Thời gian hình thành mô sẹo trên môi trường MS cơ bản có bổ sung
nồng độ BAP khác nhau. 27

Bảng 3.3. Số chồi tạo thành, chiều cao chồi và hệ số nhân chồi của mẫu cấy
trong các môi trường MS có bổ sung nồng độ BAP khác nhau 29
Bảng 3.4. Khối lượng tươi và khô của chồi đỉnh tái sinh in vitro. 32
Bảng 3.5. Nồng độ và hàm lượng diệp lục a (C
a
), diệp lục b (C
b
) và diệp lục
tổng số (C
a + b
), carotenoit tổng số (C
x+c
). 32
















CÁC TỪ VIẾT TẮT

BAP: 6 – Benzyl amino Purine
ĐC: Đối chứng
CT: Công thức
MS: Muashige and Skoog

























MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
NỘI DUNG……………………………………………………………………3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Nhân giống cây trồng in vitro 3
1.1.1. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) 3
1.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4
1.1.3. Ưu điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 5
1.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro 6
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô 8
1.2. Giới thiệu về cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 12
1.2.1 Vị trí phân loại 12
1.2.2. Đặc điểm sinh học 13
1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới và ở Việt Nam 14
1.2.4. Công dụng 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu 16
2.2. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 16
2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ 16
2.2.2. Môi trường nuôi cấy 16
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu sơ bộ 17
2.3.2. Bố trí thí nghiệm 17
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
3.1. Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 22



3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro của cây

Xạ đen 27
3.2.1. Sự hình thành mô sẹo (callus) 27
3.2.2. Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi mới in vitro 29
3.3. Một số chỉ tiêu sinh lí của chồi đỉnh tái sinh in vitro 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
PHỤ LỤC…………………………………………………………………… 37
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC GIẢ… 38






1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay y dược học phát triển, cùng với nó là những bài thuốc dân gian
cũng dần dần được tìm ra và một trong số những bài thuốc dân gian đó là tìm
ra cây thuốc trong tự nhiên có những tác dụng ưu việt trong điều trị các bệnh
ung thư, mụn nhọt của con người. Một trong nhưng cây thuốc dân gian đó là
cây Xạ đen, nó có rất nhiều tác dụng và đóng vai trò không thể thiếu trong các
bài thuốc cổ truyền.
Hiện nay cây Xạ đen là loại cây nhỏ được trồng phổ biến ở các tỉnh như
Sơn La, Hoà Bình, Hà Nam, Quảng Bình. Xạ đen được dùng trong y dược
học cổ truyền Việt Nam để chữa các bệnh như viêm dạ dày, ung nhọt, trị khối
u, ung thư, chống oxi hoá [12].
Tỷ lệ ung thư trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng
tăng cao. Hiện trên thế giới mỗi năm có khoảng 12 triệu người được phát hiện

mắc ung thư. Việt Nam cũng là quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh này thuộc loại cao.
Thông tin này được đưa ra trong buổi phát động chiến dịch mang tên ”Ung
thư cũng có thể ngăn ngừa” nhân ngày Ung thư thế giới (4/2), do Hiệp hội
phòng chống ung thư thế giới (UICC) tổ chức. Theo thống kê của Bộ Y tế,
năm 2006 tại Việt Nam đã có hơn 77.280 ca ung thư ác tính được phát hiện.
Đứng đầu là ung thư vú với gần 8.400 ca, kế đến là ung thư cổ tử cung, gần
6.770 ca, ruột kết và trực tràng gần 6.290, dạ dày 5.860, khí quản, phế quản
và phổi 5.800 ca [13].
Trong những năm gần đây việc sử dụng Xạ đen để điều trị bệnh ung thư
được phổ biến rộng rãi vì vậy đã làm cạn kiệt nguồn cây tự nhiên. Việc trồng
Xạ đen để cung cấp nguồn dược liệu còn hạn chế bởi nguồn giống, nguồn đất
trồng… Quá trình nhân giống cây Xạ đen chủ yếu là dùng phương pháp giâm
cành, phương pháp này có nhược điểm là phụ thuộc vào điền kiện mùa vụ
2

(thường chỉ thực hiện được vào mùa xuân) cây Xạ đen lại có vai trò rất lớn
trong các bài thuốc y dược học cổ truyền do vậy mà chúng tôi chọn đề tài
“Nghiên cứu tạo vật liệu in vitro và bước đầu nhân nhanh cây xạ đen bằng
phương pháp tạo đa chồi” để tạo ra nguồn cây giống nhanh và liên tục cung
ứng cho nhu cầu về số lượng cây cho y dược học cổ truyền, phương pháp này
có ưu điểm là nhân nhanh giống mà không phụ thuộc vào điều kiện mùa vụ,
môi trường.
2. Mục đích và nhiệm vụ
2.1. Mục đích
Nhằm tạo ra một nguồn giống cây sạch bệnh và đồng nhất về mặt di
truyền với số lượng lớn để đáp ứng yêu cầu về cây phục vụ cho y dược học cổ
truyền.
2.2. Nhiệm vụ
Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo cây in vitro.
Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro

của cây Xạ đen.
Xác định một số chỉ tiêu sinh lý của chồi đỉnh tái sinh in vitro.
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
- Ý nghĩa lý luận: bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro cây Xạ
đen
- Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể được sử dụng trong nuôi
cấy mô tế bào cây dược liệu. Góp phần sản xuất và nhân nhanh cây giống có
hiệu quả cao, chất lượng tốt ứng dụng vào sản xuất cây trồng dược liệu phục
vụ cho các ngành khoa học khác.



3

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhân giống cây trồng in vitro
1.1.1. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro)
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh
vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ
thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp
nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ
nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ ban đầu, làm rút ngắn thời gian đưa một
giống mới vào sản xuất [1], [3].
Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây
trồng quý hiếm.
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh
nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay
mô sẹo (callus) mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, được phân chia và
cấy chuyền để nhân giống [3].

Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho đến nay được chứng minh là phương
pháp nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan hiệu quả nhất. Năm 1939,
nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan trên sự hình thành chồi và rễ (White
và Nobercourt, 1939). Và các kết quả nghiên cứu về sự tác động của các nhân
tố bên trong và bên ngoài ảnh hưởng đến sự hình thành cơ quan [13].
Qua kết quả nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan in vitro, cho thấy
có 3 nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đó là môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi
cấy và mẫu được sử dụng nuôi cấy [1].
Vận dụng quá trình hình thành cơ quan in vitro qua sự tác động tương hỗ
của các nhân tố nói trên, có hàng ngàn loài thực vật đã được nghiên cứu quá
trình hình thành chồi và rễ [1].
4

1.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ nằm trong sinh lý
thực vật. Ở nước ta ngành này mới được chú ý và phát triển khoảng 15 – 20
năm trở lại đây. Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở
sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1996) và một số nhà nuôi cấy
mô nước ngoài nhận định [8]:
- Đó là tính toàn năng của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được
cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời. Đây là một điểm
rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện
được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây
trồng.
- Khả năng loại trừ virut bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng
vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính. Vấn đề này được các nhà
khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (cam,
quýt,…).
- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocrom và nhân giống vô

tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất, cây lương thực (khoai
tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,…), cây làm
thuốc,…
- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm,
khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong
ống nghiệm.
- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó
tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai
tạo.
- Khả năng hấp thu AND ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.
5

- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó
ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.
- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh
cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai.
- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi
lai xa.
- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở
nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào.
Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình
nghiên cứu di truyền thực vật.
Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần
quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong
các ngành kinh tế.
1.1.3. Ưu điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những ưu
điểm sau:
Nuôi cấy mô giống như nhân giống vô tính vì phương pháp này tạo ra
cây con đồng nhất và giống như cây mẹ về mặt di truyền. Đối với cây trồng

thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh
ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong
trường hợp này nhân giống từ nuôi cấy mô có ưu điểm hơn nhân giống từ hạt
[1].
So với kiểu nhân giống vô tính bình thường (chiết cành, giâm, hom,…),
nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây
con từ một cá thể ban đầu trong thời gian ngắn [1].
Có thể tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban
đầu một cách chặt chẽ và nghiêm ngặt hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên
6

sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết,
điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để
đưa vào sản xuất [1].
1.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Theo Trần Thị Dung (2003), sự thành công của việc nhân giống in vitro
chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn [2]:
 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu
thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro.
Vô trùng mô nuôi cấy là một thao tác khó và ít khi thành công ngay lần
đầu tiên. Tuy nhiên nếu kiên trì tìm ra được nồng độ và thời gian vô trùng
thích hợp thì sau một vài lần thử sẽ mang lại kết quả như mong muốn.
 Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy
Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi
đỉnh (đỉnh sinh trưởng) hoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tùy từng đối
tượng mà người ta còn có thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa,
cánh hoa, Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng
các mô nuôi cấy, quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp

chất auxin/cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, cần
phải quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy. Theo Anolerson (1980) mẫu
nuôi cấy của cây được lấy vào thời kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả
quan trong tái sinh chồi.
 Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích
tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn
then chốt của quá trình.
7

Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin,
Gibberelin), các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch
thủy phân Casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy
thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích
thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi
nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
 Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 1 – 2 tuần, từ những chồi riêng
lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, các chất  - indole -
acetic acid (IAA), Indode - 3 - butyric acid (IBA), α - Napthalene acelic acid
(α-NAA) và 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) được sử dụng, nghiên
cứu nhiều nhất.
 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm
ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết
định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ,

để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Để đảm bảo cho cây có tỷ
lệ sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp
từ 10 – 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó
chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường.
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng
sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh
8

(nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất.
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô
 Mô nuôi cấy
Theo lý thuyết tất cả các mô chưa hoá gỗ đang sinh trưởng mạnh như:
Mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,…,
khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả
năng tạo mô sẹo, phân hoá thành rễ, thân, cành, lá,… rất khác nhau.
Việc chọn mẫu để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định,
nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu được
nhưng cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngưng phát triển ở
một giai đoạn nhất định [5]. Chủ yếu là người ta chọn mẫu nuôi cấy là chồi
bên và mô phân sinh đỉnh.
 Vô trùng trong nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và
vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia
tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, vì vậy
nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày môi
trường nuôi cấy sẽ phủ đầy nấm hoặc vi khuẩn, trong điều kiện này thí
nghiệm phải loại bỏ vì mô cấy không thể phát triển và chết dần.
Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đòi hỏi rất cao mới
có hy vọng thành công. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi

cấy chúng ta phải thực hiện yêu cầu sau:
- Vô trùng mẫu nuôi cấy bằng cách rửa sạch mẫu tự nhiên dưới vòi nước,
rồi đưa vào buồng cấy và rửa sạch mẫu lại lần nữa bằng nước cất vô trùng,
sau đó tiến hành xử lý sơ bộ bằng cồn (etanol) 70% và một số hoá chất xử lý
9

vô trùng khác như Hydroperoxid (H
2
O
2
), hoặc javen với các nồng độ và thời
gian khử trùng thích hợp.
- Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh ta sử dụng cồn để đốt các dụng cụ cấy mẫu
này.
- Vô trùng môi trường nuôi cấy và nút đậy bằng nồi hấp khử trùng.
- Thao tác nuôi cấy phải hết sức cẩn thận, không đưa tay qua bề mặt
thoáng của dụng cụ nuôi cấy cũng như môi trường nuôi cấy để tránh rơi nấm,
bụi hoặc khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy.
- Khi cấy mẫu vô trùng vào môi trường cần phải tiến hành gần ngọn lửa
đèn cồn.
Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tuỳ theo sự tiếp
xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn,
nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các hoá chất
có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ
thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề
mặt mô cấy. Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để
và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mô cấy.
Trần Văn Minh (2004) đưa ra nồng độ, thời gian và hiệu quả sử dụng các
chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [7].
Bảng 1.1. Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và

thời gian xử lý mẫu
Tác nhân vô trùng
Nồng độ (%)
Thời gian xử lý
(phút)
Hiệu quả
Hypochlorite canxi
9 – 10
5 – 30
Rất tốt
Hypochlorite natri
2
5 – 30
Rất tốt
Hydroperoxid (H
2
O
2
)
10 – 12
5 – 15
Tốt
Nước Brom
1 – 2
2 – 10
Rất tốt
10

Tác nhân vô trùng
Nồng độ (%)

Thời gian xử lý
(phút)
Hiệu quả
HgCl
2

0.1 – 1
2 – 10
Trung bình
Chất kháng sinh
4 – 5 (mg/l)
30 – 60
Khá tốt

Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt
nấm, khuẩn.
 Môi trường nuôi cấy
Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính
sau đây:
- Các muối khoáng đa lượng.
-Các muối khoáng vi lượng.
- Các Vitamin.
- Đường làm nguồn cacbon.
- Các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần
xác định như acid amin, Ethylendiamin Tetraacetic Acid (EDTA), hoặc không
xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào trong môi trường tuỳ theo
nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy. Trong hàng trăm môi trường do
rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3
môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Knop.
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5, Gamborg.
- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS (Muashige and Skoog, 1962).
 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy
Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng
sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến
11

các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất
điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực
vật. Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những
quá trình sinh lý, sinh hoá khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực
vật đối với điều kiện của môi trường [9].
- Auxin: auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài của tế bào, kìm
hãm sự rụng của lá, hoa và quả, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trưởng
của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của ống phấn [9].
Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tuỳ theo
giai đoạn phát triển của chúng. Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có
nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí
nghiệm.
Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của
chất auxin, nhưng thường với các liều lượng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị
kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có
NAA. Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí
quan trọng, hai tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế
bào và sự hình thành rễ [7].
- Cytokinin: các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều
kiện có sự hiện diện của auxin. Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế
bào và sinh tổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự
hình thành chồi non nhưng lại ức chế sự tạo rễ [3].

- Gibberellin: hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích
thích sự kéo dài lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ
và biểu bì.
Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế
bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin. Xử lý gibberellin làm tăng năng
12

suất mía cây và đường (do kích thích sự kéo dài lóng). Gibberellin liều cao (hay
phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá. Trên lá yến mạch hay
diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin [9].
 Ảnh hưởng của pH và Agar
pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi
cấy mô. Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát
triển của mô [1], [8].
Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết
môi trường dinh dưỡng. Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả
năng làm đông môi trường. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước và
hấp thụ hoá chất. Nồng độ agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %.
1.2. Giới thiệu về cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth)
1.2.1. Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Celastrales
Họ: Celastraceae
Chi: Celastrus
Loài: Celastrus hindsii Benth
Một số tên gọi khác của cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) như: cây
Bách giải, cây Đồng triều, cây Bạch vạn hoa, dây gối, quả nâu, người Mường
gọi là cây ung thư.

13


1.2.2. Đặc điểm sinh học
Xạ đen thuộc loại cây dây leo thân gỗ, mọc thành búi, dễ trồng, nhánh
non tròn, không có lông, lá mọc cách và không rụng theo mùa, phiến bầu dục
xoan ngược, gân phụ 7 cặp, bìa có răng thấp. Cuống lá dài từ 5 – 7 mm. Chùm
hoa ở ngọn hay ở nách lá, dài 5 – 10 cm. Cuống hoa dài từ 2 – 4 mm. Hoa
mẫu 5, cánh hoa trắng, hoa cái có bầu 3 ô. Quả nang hình trứng, dài cỡ 1 cm,
nổ thành 3 mảnh. Hạt có áo hạt màu hồng. Ra hoa tháng 3 – 5, Ra quả tháng
8 - 12.
Điều kiện sinh trưởng: điều kiện đất đai không khắt khe, dễ trồng và sinh
trưởng mạnh, mọc tự nhiên trong các khu rừng ở nước ta. Nhân giống chủ yếu
sử dụng phương pháp giâm, chiết cành. Tuy nhiên phải thực hiện vào mùa
xuân thì cây mới đạt tỷ lệ sống sót cao.
Hình 1.1. Cây Xạ đen
(Celastrus hindsii Benth)
Hình 1.2. Quả cây Xạ đen
14

Cây Xạ đen được phân bố ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc,
Myanmar, Thái lan Ở Trung Quốc, loại cây này thường mọc ở độ cao từ
1000 – 1500 m.
Còn ở nước ta, Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Hà Nam, Quảng
Ninh, Ninh Bình, Hòa Bình, Vườn quốc gia Cúc Phương, Vườn quốc gia Ba
Vì, Thừa Thiên - Huế, Gia Lai
1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới
Từ năm 1977, tác giả Lưu Khải Thọ ở Trung Quốc đã bắt đầu nghiên
cứu về cây Xạ đen, ông đã chiết xuất được chất Saponin Triterpenoid từ cây

Xạ đen [16].
Đến năm 1998, một chuyên gia Nhật Bản cũng đã chiết xuất được một
chất có tác dụng hạn chế sự phát triển của ung thư từ cây Xạ đen.
Ở nước ngoài các nhà khoa học chủ yếu quan tâm nghiên cứu về thành
phần các chất có trong cây Xạ đen và tác dụng của các chất đó đối với cơ thể [10].
1.2.3.2.Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở Việt Nam
Mở đầu cho công trình nghiên cứu về cây Xạ đen đó là tác giả Lê Thế
Trung ông đã biết đến “mối quan hệ” giữa cây Xạ đen và căn bệnh ung thư từ
năm 1989. Ông quan tâm tới các thành phần hoá dược của cây Xạ đen, ở lá,
thân, rễ của cây đều có 4 chất chính (chỉ khác nhau về hàm lượng) là:
Fanavolnoid, Quinon, Saponin Triterpenoid và Tanin Pyrocatechic, 4 chất này
có tác dụng hạn chế sự phát triển của các khối u trên cơ thể động vật mà ông
thí nghiệm ban đầu [15].
Ngày nay có thêm các nghiên cứu khác về cây Xạ đen, và các nghiên
cứu này tập trung chủ yếu vào nhân giống cây Xạ đen bằng kĩ thuật giâm,
hom,… truyền thống.
15

1.2.4. Công dụng
Cây Xạ đen là một cây thuốc nam mọc tự nhiên trong các khu rừng của
nước ta. Công dụng của cây Xạ đen không chỉ về mặt y học mà nó còn có giá
trị về mặt kinh tế, và đây cũng là cây trồng “xoá đói giảm nghèo” ở một số
huyện của tỉnh Hoà Bình.
Cây Xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có công dụng hữu hiệu trong điều
trị mụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong sơ gan cổ
chướng và đặc biệt trong chữa trị bệnh ung thư, tăng cường sức đề kháng của
cơ thể. Có tác dụng thông kinh lợi niệu. Cây dùng trị kinh nguyệt không đều,
bế kinh, viêm gan, bệnh lậu [12].
Qua nghiên cứu về thực vật học, hoá dược, dược lý, nghiên cứu thực nghiệm
trên động vật được gây ung thư, các bác sỹ đã phát hiện ra công dụng hạn chế sự

phát triển của khối u ác tính của cây Xạ đen. Hơn nữa theo GS. Lê Thế Trung,
hợp chất lấy từ Xạ đen nếu được kết hợp với chất Phylamin có thể kéo dài tuổi thọ
trung bình của động vật bị ung thư.
Đến cuối năm 1999, đề tài của các bác sỹ Học viện Quân y được nghiệm
thu, cây Xạ đen chính thức được công nhận là một trong không nhiều những
vị thuốc nam có công dụng điều trị hỗ trợ bệnh nhân ung thư.









16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành trên cây Xạ đen được cung cấp bởi Công ty
TNHH SX & DV TM Tân Hương Đức.
2.2. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 5 năm 2013 đến tháng 1 năm 2014
tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao Công nghệ,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
Các trang thiết bị được sử dụng khi tiến hành thí nghiệm, Cân kĩ thuật, tủ
lạnh sâu, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh Hitachi, máy cất nước hai
lần, buồng cấy vô trùng, máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, máy li tâm
lạnh, tủ sấy, pipet, hệ thống quang phổ tử ngoại khả biến.

Các dụng cụ sử dụng.
Dao, kéo, panh, khay cấy, giấy thấm khử trùng, đèn cồn, bình tam giác,
nút bông khử trùng, túi nilong khử trùng,…
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản [11].
Các chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng khi tiến hành thí nghiệm
nuôi cấy cây Xạ đen là chất kích thích sinh trưởng chồi BAP (mg/l).
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy
Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ
chiếu sáng 2000 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng từ 16 giờ sáng/8 giờ tối.
Nhiệt độ: 20
0
C - 25
0
C.
Độ ẩm: 50 – 60%.