Góp phần nghiên cứu sàng lọc acid shikimic trong một số cây thuốc ở việt nam

ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid shikimic từ lâu được biết đến là một hợp chất trung gian quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp một số acid amin thơm như phenylalanine,
tyrosin, tryptophan; và một số hợp chất alcaloid. Acid shikimic có thể được
phân lập từ vi khuẩn như E. coli hay từ một số loài thực vật.
Trong những năm gần đây, acid shikimic còn được biết đến với vai trò quan
trọng mới, nó là nguyên liệu dùng để tổng hợp osletamivir – hoạt chất chính
của Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H
5
N
1
. Hiện nay, acid
shikimic dùng để tổng hợp Tamiflu được chiết xuất chủ yếu từ quả của cây
Hồi - đây là nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòng
chống cúm gia cầm.
Tuy nhiên, Hồi không phải là loại cây dễ trồng, và phải đợi khoảng 5-7
năm mới có thể thu hoạch quả được, và phải hơn 10 năm mới cho thu hoạch ổn
định. Hơn nữa, cây Hồi là cây có vùng phát triển hẹp, cây thích nghi vùng đồi
núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23
0
C; lượng mưa hàng năm vào khoảng 1450-
1600mm. Như vậy, nếu chỉ trông chờ vào cây Hồi thì sẽ không đáp ứng được
nhu cầu về nguyên liệu acid shikimic, việc tìm ra các nguồn dược liệu khác có
chứa acid shikimic là rất quan trọng.
Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Góp phần nghiên cứu sàng lọc acid
shikimic trong một số cây thuốc ở Việt Nam” nhằm mở rộng nguồn dược liệu
có chứa acid shikimic.
Đề tài gồm các nội dung sau :
1. Định tính acid shikimic trong một số dược liệu bằng SKLM.
2. Định lượng hàm lượng acid shikimic trong các dược liệu bằng HPLC.
3. Xây dựng quy trình chiết tách và tinh chế acid shikimic từ dược liệu có

hàm lượng cao ở quy mô phòng thí nghiệm.
1
PHẦN I :
TỔNG QUAN
1.1.ACID SHIKIMIC
1.1.1 Công thức hóa học, tính chất chung :
Acid shikimic có công thức phân tử C
7
H
10
O
5
; tên khoa học [3R-
(3α,4α,5β)]-3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexem-1-carboxylic acid ; phân tử khối
174,15 [30].
Công thức cấu tạo :

Acid shikimic là chất bột màu trắng, nóng chảy ở nhiệt độ 190-191
0
C , tan
nhiều trong nước (18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,5%), không tan trong
ether, cloroform, benzen và ether dầu; có đỉnh hấp thụ cực đại trong ethanol ở
bước sóng 213nm [30].
1.1.2. Các phương pháp định tính, định lượng acid shikimic
* Phương pháp định tính
Các phương pháp định tính acid shikimic đã được các nhà khoa học nghiên
cứu từ rất sớm.
- Phương pháp thuốc thử hiện màu: SA là chất không màu và không phát
quang dưới ánh sang tử ngoại. Các phương pháp đo màu được áp dụng
bằng cách cho phản ứng với các thuốc thử hiện màu để phát hiện SA

trên SKG. Tuy nhiên các thuốc thử trong phương pháp này không đặc
2
hiệu cho SA, một số acid hữu cơ khác như acid quinic cũng cho màu
tương tự [27].
- Phương pháp SKLM: được sử dụng để định tính SA từ những năm 1960
[27]. Sử dụng hệ dung môi thích hợp để chấm sắc ký so sánh chất thử
với SA chuẩn. Một mẫu có SA dương tính nếu có vết cùng R
f
và cùng
màu sau khi phun thuốc thử với SA chuẩn.
- Phương pháp HPLC: gần đây HPLC là phương pháp phổ biến để định
lượng các chất trong đó có SA [10], [20], [23].
* Phương pháp định lượng acid shikimic
Có nhiều phương pháp được áp dụng để định lượng acid shikimic như:
- Phương pháp HPLC với detector UV: phương pháp này được áp dụng dựa
vào việc xác định đường chuẩn của SA chuẩn, phát hiện SA ở bước sóng
210nm [20], [23], [24].
- Phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC): phương pháp này được tiến hành
bằng cách tạo dẫn xuất trimethylsilyl. Sử dụng cafein làm chất chuẩn nội,
cột IO và 200 mesh gas – chrom Q với detector FID, nhiệt độ buồng tiêm
mẫu và buồng cột lần lượt là 210 và 185
0
C [18], [19].
- Phương pháp chuẩn độ: SA sau khi được tách cột Dowex-1x 8 column,
chuẩn độ bằng NaOH loãng [16], [25].
1.1.3. Vai trò và tác dụng
* Vai trò
Acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp của
nhiều hợp chất thiên nhiên như các acid amin thơm như phenylalanin,
tryptophan và tyrosin, và các alcaloid, các hợp chất phenolic, các phenyl

propanoid [27], [11], [28].
Acid shikimic là chất trung gian hóa học quan trọng trong các quá trình
chuyển hóa trong thực vật và vi sinh vật (con đường shikimat).
3
Những năm gần đây, acid Shikimic được biết đến với vai trò mới, nó là
nguyên liệu để bán tổng hợp oseltamivir làm thuốc điều trị cúm H
5
N
1
.
* Tác dụng
Các nhà khoa học đã chứng minh acid shikimic có tác dụng giảm đau,
chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa, ngăn cản sự phát triển của tế bào
ung thư [24].
1.1.4. Tình hình sản xuất acid shikimic hiện nay
Hiện nay,đã có nhiều nghiên cứu công bố về việc phân lập và tinh chế SA
từ quả Hồi. Theo đó, người ta nghiên cứu chiết xuất SA từ quy mô phòng thí
nghiệm đến pilot và quy mô công nghiệp. Các cơ sở nghiên cứu công bố có thể
đáp ứng được một khối lượng lớn SA [9].
Trong những năm gần đây, xuất hiện nhiều nghiên cứu mới về các phương
pháp sản xuất SA khác nhau, có thể lên men vi khuẩn E. coli, có thể ức chế
con đường shikimat ở thực vật để tăng tích lũy SA, và cũng có những nghiên
cứu tổng hợp hóa học hoàn toàn [9]. Tuy nhiên những nghiên cứu đó vẫn chỉ
dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào công nghiệp do
nhiều hạn chế. Vì vậy, cho tới nay, việc sản xuất SA đi từ dược liệu vẫn là
phương pháp được áp dụng, do vậy việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu mới có
khả năng cung cấp SA thay thế cho cây Hồi là một vấn đề cấp thiết hiện nay.
1.2. Các dược liệu có chứa acid shikimic
Acid shikimic được phân lập lần đầu tiên từ cây Hồi Nhật Bản (Illicium
anisatum) vào năm 1885. Tuy nhiên phải sau gần 50 năm cấu trúc của nó mới

được xác định[32]. Sau đó, acid shikimic cũng được tìm thấy và được phân lập
từ nhiều cây khác như Hồi (Illicium verum Hook.f.), Canh-ki-na (Cinchona
spp.), Kha tử (Terminalia chebula), Chuối tiêu (Musa sapientum), Hướng
4
dương (Heliantuns annuus), Bạch quả (Ginko biloba), Tiểu hồi (Foeniculum
vulgare), Liquidambar styraciflua…[32], [26].
Hiện nay, phần lớn acid shikimic để sản xuất Tamiflu vẫn chủ yếu được
chiết xuất từ quả Hồi. Tuy nhiên, phải mất 5-7 năm sau khi trồng cây mới bắt
đầu cho thu hoạch quả được, và phải hơn 10 năm mới bắt đầu cho thu hoạch
ổn định. Hơn nữa, cây Hồi là cây có vùng phát triển hẹp, cây thích nghi vùng
đồi núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23
0
C; lượng mưa hàng năm vào khoảng
1450-1600mm. Cây được trồng trên loại đất feralit đỏ vàng, mới được khai
phá, có pH 4-5,5 [2]. Như vậy, nếu chỉ trông chờ vào cây Hồi thì sẽ không đáp
ứng được nhu cầu về nguyên liệu acid shikimic, việc tìm ra các nguồn dược
liệu khác có chứa acid shikimic là rất quan trọng.
Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát acid shikimic trên
các cây sau : một số loài Hồi, Cỏ ngọt, Bụp giấm, Dây thìa canh, Bồ công anh,
Ban tròn.
1.2.1. Đại Hồi (Illicium. verum Hook.f. Illiaceae )
* Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái
Đại Hồi còn gọi là Bát giác hồi hương, Hồi hương, Hồi sao, Mác chác, Mác
Hồi (Tày), Pit cóc (Dao) [2].
Là cây gỗ nhỏ, cao 6-8m, có thể đến 10m hay hơn. Cây có nhiều ở miền
Nam Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, đây là hai khu vực cung cấp nguồn
nguyên liệu và tinh dầu Hồi chủ yếu cho thế giới.
Ở Việt Nam, cây Hồi có nhiều ở Lạng Sơn, Cao Bằng. Gần đây phát triển
rộng ra Quảng Ninh, Bắc Kạn, Lai Châu và Hà Giang [1,2]. Cây thích nghi
vùng đồi núi thấp, nhiệt độ trung bình 21-23

0
C, lượng mưa trung bình hàng
năm từ 1450 – 1600mm.
Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng 8-10,
vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau. Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho
5
thu hoạch. Sau 15 năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm,
năng suất tương đối ổn định ở mức 20-30 kg/năm [2].
* Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của cây hồi, nhất là quả Hồi đã được nghiên cứu khá kỹ.
Ngoài hai thành phần chính được quan tâm nhiều là tinh dầu và acid shikimic,
quả hồi còn có chứa các thành phần catechin, protocatechin, tinh dầu, dầu béo,
acid protocatechuic, acid shikimic, secocycloartan, phenpropanoid và các chất
vô cơ… Lá có chứa tinh dầu. Hạt chứa dầu béo [2], [20].
* Công dụng
Người ta chiết xuất lấy tinh dầu Hồi dùng làm nước hoa, hương liệu cho đồ
uống…Tinh dầu Hồi là một thành phần trong các cao xoa, cao dán để giảm
đau khi bị sai khớp, bong gân, chấn thương bầm tím, đau lưng [2], [8].
Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam, các phương pháp chiết xuất, định tính,
định lượng SA từ quả Hồi đã và đang được nghiên cứu khá kỹ. Hàm lượng SA
trong quả Hồi được công bố khoảng 5 – 8% [8].
1.2.2. Các loài Hồi khác
Chi Illicium ở Việt Nam hiện có 14 loài [5]. Trong số các loài Hồi đó, chỉ
loài Hồi trồng (I. verum) là loài có diện tích lớn, tập trung và có giá trị cao do
sản phẩm (tinh dầu, quả khô) được sử dụng rộng rãi và hàm lượng acid
shikimic thu được khá cao. Các loài còn lại chủ yếu mọc hoang và sử dụng
trong dân gian trong một số bài thuốc dân tộc (rễ Hồi núi ngâm rượu chữa
bong gân, hoặc trong một vài bài thuốc trị thương của những người học võ
nghệ). Với mục đích tìm kiếm nguồn dược liệu có SA, chúng tôi đã thu mẫu và
tiến hành khảo sát SA trong 2 loài Hồi mọc hoang là Hồi lá nhỏ và Hồi lá

mỏng.
6
Hồi lá nhỏ có tên khoa học là I. parviflorum, hiện nay mới chỉ thấy phân bố
ở Bạch Mã (TT Huế), Bà Nà ( Đà Nẵng). Trong đề tài này chúng tôi gọi tên
mẫu là Hồi Bạch Mã và Hồi Bà Nà.
Hồi lá mỏng có tên khoa học là I. tenuifolum, phân bố ở Nghệ An, Gia Lai,
Lâm Đồng, Khánh Hòa. Mẫu được sử dụng trong đề tài được lấy từ Pù Mát –
Nghệ An, nên gọi tên là Hồi Pù Mát.

1.2.3. Bụp giấm
Bụp giấm còn được gọi là Cây giấm, đay Nhật; tên khoa học là Hibiscus
sabdariffa L. họ Bông Malvaceae.
* Mô tả, phân bố, sinh thái
Bụp giấm là cây bụi, cao 1 – 2 m, sống nhiều năm, nhưng trong sản xuất
người ta chỉ trồng một năm rồi phá đi trồng lại. Cây dễ trồng, không kén đất,
có khả năng chịu hạn, không chịu úng, được nhân giống bằng hạt và cành.
Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á và châu Phi.
Bộ phận dùng là đài hoa, lá và quả. Để chiết xuất SA, người ta sử dụng đài hoa
Bụp giấm [10].
* Thành phần hoá học
Bụp giấm chứa anthocyan, acid hữu cơ, nhựa, đường, alcaloid và một số
thành phần khác.
Các lá đài giàu về acid và protein; các aicd chính tan trong nước là acid citric,
acid malic, acid tartric và acid hisbiscis [2], [4], [5].
Ngoài ra hoa bụp giấm còn chứa acid shikimic với hàm lượng 0,3% [10].
* Công dụng
Lá Bụp giấm có vị chua, dùng làm rau ăn. Đài hoa được dùng làm gia vị thay
giấm, chế nước giải khát, mứt kẹo, siro hoặc đem phơi khô và nấu lấy nước
uống.
7

Lá, đài hoa và quả cong chữa bệnh scorbut. Đài hoa mọng nước sắc lấy nước
uống hoặc hãm uống giúp tiêu hoá và trị các bệnh về mật, cũng dùng điều trị
bệnh về tim và thần kinh, huyết áp cao và xơ cứng động mạch [2], [5].
1.2.4. Cỏ ngọt
Cỏ ngọt còn được gọi là Cỏ đường, Cúc ngọt, có tên khoa học là Stevia
rebaudiana Bert. họ Cúc Asteraceae.
* Mô tả, phân bố, sinh thái
Cây thảo, sống nhiều năm, cao 30-60cm. Mùa hoa tháng 5-9. Bộ phận dùng
là lá. Hiện nay được trồng phổ biến ở Việt Nam. Là cây ưa ẩm và ưa sáng, sinh
trưởng tốt vào vụ xuân – hè, trồng một lần có thể thu hoạch trong 2 – 3 năm
Mùa hoa tháng 5-9. Bộ phận dùng là lá [2], [4], [5].
* Thành phần hoá học
Lá chứa các heterosid diterpenic dẫn xuất của phyllocladen: steviosid (7%),
rebaudiosid và dulcosid.
Steviosid có độ ngọt gấp 150-280 lần cao hơn saccharose [2], [4], [5].
Ngoài ra lá Cỏ ngọt còn chứa acid shikimic với hàm lượng 0,66% [10].
* Công dụng
Cỏ ngọt được sử dụng rộng rãi để lấy chất thay thế đường (steviosid) trong
công nghiệp thực phẩm (làm chất điều vị cho bánh mứt kẹo, nước giải khát),
trong công nghiệp dược phẩm (thuốc thay thế đường trong đái tháo đường và
mập phì). Người ta sử dụng bột lá Cỏ ngọt khô để làm chất điều vị ngọt cho trà
túi lọc, trà thuốc[2], [5].
1.2.5. Dây thìa canh
Còn có tên khác là Dây muôi, tên khoa học là Gymnema sylvestre họ Thiên
lý Acclepiadaceae.
* Mô tả
8
Dây leo cao 6-10m, lá có phiến bầu dục. Thường mọc trong các bờ bụi, hàng
rào tại một số nơi ở miền Bắc Việt Nam như Haiir Dương, Hải Phòng, Bắc
Giang, Ninh Bình, Thanh Hóa.

Hoa nhỏ, màu vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, dài 8mm, rộng 12-
15mm, đài có lông mịn; tràng không có lông ở mặt ngoài, tràng phụ là 5 răng
[4].Quả đại dài 5,5cm, rộng ở nửa dưới, hạt dẹp, lông mao dài 3cm.
Hoa tháng 7, quả tháng 8.
Bộ phận dùng là dây, lá được thu hái quanh năm [4].
* Thành phần hóa học
Cây chứa một chất glucosidic là acid gymnetinic rất gần với acid
chrysophanic nhưng khác về một số tính chất.
Lá chứa những hợp chất hữu cơ, 2 hydratcacbon, chlorophyll a và b, phytol,
nhựa, acid tartric, inositol, các hợp chất anthraquinonic và acid gymnemic.
Lá Dây thìa canh có chứa acid shikimic với hàm lượng 6,79% [10].
* Công dụng
Thường dùng trị đái tháo đường. Lá cũng dùng làm thuốc dễ tiêu hóa, còn
dùng tán thành bột để chống độc.
Ở Ấn Độ, người ta dùng đắp lên vết cắn và dùng đắp lên vết cắn và dùng sắc
uống trong để trị rắn độc cắn.
Ở Trung Quốc, người ta thường dùng cả cây bỏ rễ và quả làm thuốc trị
phong thấp tê dại, viêm mạch máu, rắn độc cắn, trĩ và các vết thương do dao,
đạn [4].
1.2.6. Bồ công anh – Trung Quốc
Tên khác là Bồ công anh thấp, tên khoa học là Taraxacum officinale, họ Cúc
Asteraceae.
* Mô tả, phân bố, sinh thái
9
Cây thảo, sống một năm hay nhiều năm, cao 0,2 – 0,4 cm, không có thân [2],
[4], [5]. Phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm, á nhiệt đới thuộc châu Âu, châu
Mỹ và châu Á. Được nhập vào Việt Nam từ lâu nhưng đến nay đã trở nên
hoang dại ở một số vùng núi cao 900m trở lên như Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sa
Pa, Bắc Hà (Lào Cai), Sìn Hồ (Lai Châu), Đà Lạt (Lâm Đồng)…[2].
Cây được nhân giống từ hạt. Sau khi ra hoa quả, cây tàn lại, hạt có túm lông

được gió phát tán đi khắp nơi. Vòng đời của cây dài khoảng 3 – 5 tháng.
Bộ phận dùng là toàn cây, gồm rễ, thân và lá.
* Thành phần hóa học
Toàn cây Bồ công anh TQ chứa 0,98% flavonoid toàn phần: lactopicrin,
taraxacin, taraxasterol, β - sitosterol, stigmasterol…Ngoài ra còn có nhựa, tinh
dầu, pectose, acid béo, sáp [2],[4],[5].
Theo nghiên cứu gần đây, cây Bồ công anh có chứa 1,21% acid shikimic [10].
* Công dụng
Toàn cây dùng để chữa sưng vú, viêm tuyến vú, ít sữa, tiểu tiện khó, nhiễm
khuẩn tiết niệu, mụn nhọt, sưng tấy.
Ở Trung Quốc còn dùng để chữa đau mắt, tiêu hóa kém, rắn cắn.
Ở Pháp, Bồ công anh thấp còn chữa các bệnh gan mật, các bệnh tiêu hóa, sỏi
thận, tiểu tiện ít, tăng cholesterol, xơ vữa động mạch, béo phì…[2], [4], [5].
1.2.7. Ban tròn
Tên khoa học là Hypericum patulum họ Ban Hypericaceae.
* Mô tả, phân bố, sinh thái
Cây thảo nhỏ, sống một năm hay hai năm, cao 10 – 20 cm. Thân cứng, nhẵn,
không phân nhiều nhánh.
Cây phân bố ở hầu hết các tỉnh từ vùng đồng bằng đến trung du và miền núi
phía Bắc. Cây mọc từ hạt vào cuối xuân hoặc đầu hè, sinh trưởng và phát triển
nhanh, khoảng 3 – 4 tháng là lụi tàn. Quả khi chín tự nứt, hạt vương vãi trên
10
mặt đất, có thể tồn tại trong một thời gian dài, qua đông đến mùa xuân sang
năm mới nảy mầm.
Bộ phận dùng là toàn cây phơi khô.
* Thành phần hóa học
Toàn cây chứa sarotranol, isojaca.
Từ phần trên mặt đất đã phân lập được 2 chromon glycosid.
Cho tới nay, đã có một số thông báo về sự có mặt của SA trong một số loài
thuộc chi Hypericum, nhưng chưa có bất cứ tài liệu nào công bố về H. patulum

* Công dụng
Theo dân gian, cây Ban được dùng để chữa viêm gan vàng da, trẻ em lên sởi,
vết thương sưng đau, mụn nhọt, sâu răng, hôi mồm, ho, có nơi dùng chữa rắn
cắn.
Ở Trung Quốc còn dùng để chữa viêm gan cấp hoặc mãn, viêm ruột thừa,
viêm amidan, cam tích ở trẻ em.
Trong số các dược liệu trên, hiện nay ở Việt Nam mới chỉ có các nghiên cứu
về acid shikimic trên các loài Đại Hồi (Illicium verum), những loài Hồi khác
và dược liệu còn lại đang được bước đầu nghiên cứu trên thế giới. Chính vì
vậy chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mở rộng nguồn nguyên liệu cho acid
shikimic.
11
PHẦN II:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu :
- Lá các mẫu Hồi được thu hái tại Bà Nà (Đà Nẵng), Bạch Mã (Thừa Thiên
Huế), Pù Mát (Nghệ An) vào tháng 8/2009; hiện đang được lưu mẫu tại khoa
Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu.
- Đài hoa Bụp giấm, được thu hái tại Bắc Giang và được lưu giữ tại khoa Phân
tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu.
- Lá Cỏ ngọt, Ban tròn lấy tại nơi lưu mẫu dược liệu chuẩn của khoa Phân tích,
Viện Dược liệu.
- Lá Dây thìa canh do Thạc sĩ Ngô Quốc Luật, trung tâm cây thuốc Hà Nội
cung cấp.
2.2. Dụng cụ và hóa chất :
* Dụng cụ :
- Sinh hàn đối lưu.
- Bản mỏng tráng Silicagel GF 254 (Merk).
- Máy cất quay “Buchi”.
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến “Carry 1E”.

- Tủ sấy “Model UNB 500”.
- Cân “Presica B220A”.
- Máy siêu âm Ultrasonic.
- Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC Shimadzu LC 10ATvp, detector chuỗi diod
SPD-M10Avp.
Các máy móc thiết bị được đặt tại phòng Phân tích, Viện Dược liệu.
* Hóa chất :
12
Acid formic, cloroform, ethanol, ethylacetat, methanol, buthanol…
2.3. Phương pháp nghiên cứu :
2.3.1. Định tính acid shikimic trong các dược liệu bằng phương pháp
SKLM
Chuẩn bị dịch chiết các mẫu dược liệu đem sàng lọc. Tiến hành SKLM với
bản mỏng tráng sẵn silicagel (Merk). Chấm trên bản mỏng 2 vết: vết chuẩn và
vết thử. Mẫu thử được cho là dương tính với SA nếu có vết cùng R
f
với chuẩn
và cho cùng màu với chuẩn sau khi phun thuốc thử.
2.3.2. Định lượng acid shikimic trong các dược liệu bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC)
2.3.2.1. Điều kiện HPLC
Hàm lượng SA trong các dược liệu được định lượng bằng phương pháp
HPLC với các điều kiện sau:
- Pha tĩnh: Cột Shimpac MRC (250mm × 4,6mm ID, 5µm).
- Pha động: Acetonitril – Dung dịch acid acetic 0,5% (5 – 95)
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Detector chuỗi diod (DAD): bước sóng phát hiện 213nm
- Tốc độ dòng: 0,5ml/phút
- Thể tích tiêm: 10µl
2.3.2.2. Phương pháp xử lý mẫu

* Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn mẹ acid shikimic (Sigma) có nồng
độ 0,4mg/ml. Từ dung dịch này pha loãng để được các dung dịch chuẩn có
nồng độ thích hợp.
13
* Dung dịch thử:
Cân chính xác 2g (chính xác đến 0,0001g) dược liệu đó nghiền nhỏ cho vào
túi giấy lọc. Chiết dược liệu bằng bộ dụng cụ shoxhlet với 200 ml ethanol phân
tích 85% đến hết acid shikimic. Thu hồi dung môi đến cạn. Hòa tan cắn thu
được vào khoảng 30ml nước cất. Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 20
phút.
Lọc lấy dịch, rửa giấy lọc bằng 5ml nước cất. Gộp dịch lọc và dịch rửa, thêm
nước cất vừa đủ bình định mức 50ml (ddA). Pha loãng ddA 50 lần với dung
môi pha động, lọc qua màng lọc Supelco trước khi tiêm mẫu.
2.3.2.3. Khảo sát phương pháp định lượng acid shikimic
Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Được xác định từ 6 lần tiêm
lặp lại của dung dịch chuẩn có nồng độ SA thích hợp, ghi lại các giá trị về thời
gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột. Xử lý
thống kê các số liệu thu được để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp: Khảo sát sự phụ thuộc
tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng bằng cách pha các
dung dịch acid shikimic chuẩn có nồng độ thích hợp. Xây dựng đường chuẩn
hồi quy: y = ax + b. Trong đó x là diện tích pic (mAU.s), y là nồng độ của
dung dịch tiêm (µg), a và b là các hệ số thực nghiệm. Đánh giá đường chuẩn
thông qua hệ số tương quan r.
Khảo sát độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại của phương pháp được
đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 phép đo riêng biệt thông qua độ lệch chuẩn
tương đối RSD (Relative Standard Deviation).
Khảo sát độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được
đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn.
14

Khảo sát giới hạn định lượng của phương pháp: Đánh giá các mẫu có
nồng độ acid shikimic thấp nhất về khả năng phát hiện trên sắc ký đồ, độ đúng
và độ lặp lại bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn và tiến hành định
lượng theo phương pháp HPLC khảo sát được.
2.3.2.4. Định lượng acid shikimic trong các dược liệu nghiên cứu
Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, tiến
hành phân tích và ghi lại sắc ký đồ.
So sánh thời gian lưu và phổ UV-VIS của pic trên sắc ký đồ của dung dịch
thử với thời gian lưu và phổ UV-VIS của pic acid trên sắc ký đồ của dung dịch
chuẩn để xác định pic acid shikimic.
Xác định diện tích của pic acid shikimic trên sắc ký đồ dung dịch thử. Tính
nồng độ acid shikimic trong dung dịch thử dựa vào diện tích pic của dung dịch
thử và đường chuẩn xây dựng.
2.3.3. Xây dựng quy trình chiết tách và tinh chế acid shikimic từ dược liệu
có hàm lượng cao
2.3.4. Phương pháp xử lý kết quả
Các số liệu được xử lý bằng công cụ Data analysis của Microsoft Exel.
15
PHẦN III:
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
3.1.Định tính acid shikimic trong các dược liệu bằng SKLM
3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết
Chuẩn bị các dược liệu: lá của 3 loài Hồi, lá của các cây Ban tròn, Bồ công
anh, Cỏ ngọt, Dây thìa canh, và đài hoa Bụp giấm.
Lấy 50g dược liệu đem siêu âm trong cồn 700 ở 400C trong 2h, thu được
dịch chiết cồn. Dịch chiết thu được đem cô chân không đến khi thu được cao
đặc, thêm nước cất vào, siêu âm đến khi tan hết. Dịch nước thu được đem lắc
với EtAc, loại bỏ lớp EtAc. Dịch còn lại sau khi loại EtAc đem lắc với BuOH,
loại bỏ lớp nước, lấy phân đoạn BuOH đem chấm SKLM đinhj tính acid
shikimic.

3.1.2. Tiến hành chấm SKLM
* Sắc ký lớp mỏng pha thuận
- Chuẩn bị bản mỏng :
Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F
254
(Merck), hoạt hóa ở 110
0
C trong 1h.
-Các hệ dung môi khai triển:
Hệ I: HCOOH – MeOH – EtAc (1- 9- 11)
Hệ II: HCOOH – MeOH – CHCl
3
(1- 9- 11)
Hệ III: Propanol – EtAc – CH
3
COOH – H
2
O (4 – 3 – 1 – 2)
Hệ IV: n-BuOH - CH
3
COOH – H
2
O (5 – 1 – 4)
- Thuốc thử hiện màu:
Bản mỏng sau khi chạy được phun với H
2
SO
4
10% sau đó đem đốt nóng ở
120

0
C, acid shikimic nếu có sẽ xuất hiện màu vàng nâu.
- Kết quả:
16
Sau khi chạy SKLM cho thấy với hệ IV các vết tách nhau tốt nhất. Các vết
thử đều có Rf ngang với Rf của vết chuẩn và có màu tương ứng với màu của
SA chuẩn sau khi phun thuốc thử.
Từ phép thử định tính bắng SKLM có so sánh với chuẩn có thể kết luận sơ
bộ các mẫu dược liệu: lá Hồi Bạch Mã, lá Hồi Bà Nà, lá Hồi Pù Mát, lá Ban
tròn, lá Bồ công anh, hoa Bụp giấm, lá Cỏ ngọt, Dây thìa canh đều có acid
shikimic. Các mẫu dược liệu này được định tính SA một lần nữa bằng HPLC,
so sánh thời gian lưu và phổ hấp thụ UV của mẫu thử và chất chuẩn. Kết quả
được thể hiện qua các sắc ký đồ sau.
17
Hình 1 : Sắc ký đồ HPLC acid Shikimic chuẩn
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 200 400 600 800 1000
4.35 100.00
1: 210 nm, 8 nm
ACID SHIKIMIC Sigma
Shikimic acid Std 0,54mg-ml -5uL- 030210-001.dat
Retention Time
Area Percent

Spectrum at time 4.35 min.
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360
4.35 min

Lambda max : 212 655 292 299 307
Lambda min : 287 291 297 306 310
Hình 3: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết Dây thìa canh
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 100 200 300 400 500 600
4.42 7858868
5.00 1136259
6.03 484860
6.67 294329
7.03 690806
8.19 382651
9.88 988519
10.73 329586
11.42 308062
12.12 256102
13.16 282812
16.17 246276
1: 210 nm, 8 nm
Acid shikimic - DTC
SL_A Shikimic_DTC (20mg-ml) -5uL- 150510 - 001.dat
Retention Time
Area
Spectrum at time 4.44 min.
nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360
4.44 min
Lambda max : 212 655 298 304 307
Lambda min : 297 302 306 319 309

Hình 2: Phổ UV của Acid Shikimic chuẩn
Hình 4: Phổ UV của dịch chiết Dây thìa canh
18
3.2. Định lượng acid shikimic trong các dược liệu
3.2.1. Khảo sát phương pháp định lượng acid shikimic
* Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký được xác định từ 6 lần tiêm lặp lại của
dung dịch chuẩn có nồng độ acid shikimic khoảng 40µg/ml, ghi lại các giá trị
về thời gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
STT Thông số Giá trị
1 Thời gian lưu (phút) 4,68
2 RSD của thời gian lưu (%) 0,19
3 RSD của diện tích pic (%) 0,25
4 Số đĩa lý thuyết 8670
5 Hệ số bất đối 1,26
Nhận xét:
Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký trên phù hợp cho phân tích
định tính và định lượng SA trong dược liệu.
* Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp
Khảo sát sụ phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định
lượng trên chất chuẩn SA bằng cách pha một dãy các dung dịch chuẩn SA có
nồng độ biến thiên từ 20µg/ml đến 100µg/ml. Định lượng SA bằng phương
pháp HPLC với điều kiện sắc ký đã chọn.
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp được trình bày ở Bảng
2 và hình 5.
Bảng 2: Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp
Nồng độ (µg/ml) 20 40 60 80 100
Diện tích pic (mAUs) 1021391 2117493 3019362 3709470 5017449

19
Số liệu thống kê Phương trình hồi quy: y = 2.10
-5
x – 0,7382
Bình phương hệ số tương quan: r
2
= 0,9949
Nhận xét:
Các số liệu thống kê thu được cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự
phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và lượng chất cần định lượng
vời đương chuẩn hồi quy: y = 2.10
-5
x – 0,7382 và bình phương hệ số tương
quan r
2
= 0,9949.
Hình 5: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng
độ acid shikimic
* Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua 5 lần định lượng hàm lượng SA
của mẫu quả Hồi với các điều kiện HPLC đã chọn ở mục 2.3.2.1. Kết quả
được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3: Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
STT Diện tích pic (mAUs) Hàm lượng acid shikimic (%) Số liệu thống kê
1 2201379 5,53
M = 5,595
n = 5
RSD = 0,02%
2 2219183 5,58
3 2193352 5,51

20
4 2306057 5,80
5 2199084 5,53
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy, với chương trình sắc ký đã chọn,
phương pháp định lượng SA có độ lặp lại cao, thể hiện ở độ lệch chuẩn tương
đối nhỏ (0,02% < 5%). Kết quả này đạt tiêu chuẩn quy định của các phương
pháp định lượng.
Điều này chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao, có thể sử dụng để định
lượng SA trong các mẫu dược liệu.
* Xác định độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được khảo sát bằng phương pháp thêm chuẩn.
Thêm một lượng chính xác SA chuẩn vào mẫu thử đã biết trước hàm lượng rồi
tiến hành chiết và định lượng theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2.1.
Từ kết quả định lượng tính được hàm lượng SA thu hồi so với lượng SA thực
tế thêm vào. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Khảo sát độ đúng của phương pháp
STT Lượng thêm
(mg)
Lượng tìm lại
(mg)
Hàm lượng tìm
lại (%)
Số liệu thống kê
1 0,1002 0,0998 99,60
M = 99,68%
RSD = 0,001%
2 0,1008 0,1003 99,50
3 0,1012 0,1010 99,80
4 0,1015 0,1013 99,80
5 0,1020 0,1017 99,71

Nhận xét:
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp định lượng SA có độ đúng cao, thể
hiện ở độ lệch chuẩn tương đối nhỏ RSD = 0,001% (<5%).
* Xác định giới hạn định lượng của phương pháp
21
Pha loãng dần dung dịch chuẩn và tiến hành sắc ký theo các điều kiện HPLC
đã chọn ở mục 2.3.2.1. Kết quả khảo sát cho thấy, dung dịch SA có nồng độ
2,0µg/ml có pic SA với chiều cao lớn hơn 10 lần nhiễu đường nền. Như vậy
giới hạn định lượng là 2,0µg/ml.
 Như vậy:
Các kết quả khảo sát về tính thích hợp của hệ thống sắc ký, khoảng tuyến
tính, độ lặp lại, độ đúng và giới hạn định lượng của phương pháp định lượng
SA bằng HPLC cho thấy có thể áp dụng phương pháp này để định lượng SA
trong các mẫu dược liệu đem sàng lọc.
3.2.2. Định lượng acid shikimic trong các mẫu dược liệu
Các mẫu dược liệu nghiên cứu được xác định hàm lượng SA bằng phương
pháp HPLC với các điều kiện đã chọn.
Sắc ký đồ HPLC thu được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử được thể hiện ở
hình 6 và hình 7.
Hình 6: Sắc ký đồ HPLC của dung dịch acid chuẩn
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 200 400 600 800 1000
4.35 100.00
1: 210 nm, 8 nm
ACID SHIKIMIC Sigma
Shikimic acid Std 0,54mg-ml -5uL- 030210-001.dat
Retention Time
Area Percent

Hình 7: Sắc ký đồ HPLC của dịch chiết lá Cỏ ngọt
22
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
-20 0 20 40 60 80 100
4.43 1660857
4.82 208742
5.08 509440
5.91 377652
6.56 328619
6.89 379753
8.18 225788
10.13 279756
10.60 355541
12.12 213039
12.68 201438
1: 210 nm, 8 nm
Acid shikimic - CN
SL_A Shikimic_CN (23mg-ml) -2.5uL- 150510 - 001.dat
Retention Time
Area
Nhận xét:
Với các điều kiện sắc ký đã chọn, pic acid shikimic có hình dạng cân đối,
gọn, thời gian cho mỗi lần phân tích là phù hợp. Trên sắc ký đồ của dung dịch
mẫu thử, các mẫu thử có độ phân giải cao.
Đối chiếu thời gian lưu và phổ UV-VIS của các pic trên sắc ký đồ dung dịch
thử với thời gian lưu và phổ UV-VIS của các pic SA trên sắc ký đồ dung dịch
chuẩn để xác định pic của SA.
Tính diện tích của pic SA. Tính nồng độ SA của dung dịch thử dựa vào

đường chuẩn hồi quy.
Hàm lượng SA trong dược liệu được tính theo công thức sau:
X (%) =
m
Ci25,0
Trong đó:
Ci: Nồng độ SA của dung dịch thử (µg/ml)
m: Khối lượng dược liệu chiết định lượng SA đã trừ độ ẩm.
23
Chúng tôi đã tiến hành định lượng hàm lượng SA trong mẫu trong các dược
liệu đã chuẩn bị, kết quả được trình bày trong bảng 3.5:
Bảng 5: Hàm lượng SA trong các dược liệu khảo sát
STT Dược liệu
Diện tích pic
(mAUs)
Hàm ẩm
(%)
Hàm lượng
SA/dược liệu (%)
1 Lá Hồi Bạch Mã 5533460 12,21 2,48
2 Lá Hồi Bà Nà 6300923 11,70 2.51
3 Lá Hồi Pù Mát 8876018 13,60 3,19
4 Lá Ban tròn 4011041 7,15 3,34
5 Lá Bồ công anh TQ 2869136 6,12 0,79
6 đài Bụp giấm 796317 7,19 0,11
7 Cỏ ngọt 1660857 11,25 0,16
8 Dây thìa canh 1574983 18,24 0,68
Nhận xét:
Chúng tôi đã định lượng acid shikimic trong 8 mẫu dược liệu: 3 mẫu Hồi,
Ban tròn, Bồ công anh, Bụp giấm, Cỏ ngọt, Dây thìa canh. Kết quả định lượng

cho thấy:
- Hàm lượng acid shikimic dao động từ 0,11% đến 3,69% 9 (tính theo khối
lượng dược liệu khô)
- Các mẫu Hồi Bạch Mã, Bà Nà, Pù Mát có hàm lượng acid shikimic lần lượt
là 2,98%; 3,01% và 3,69%. Như vậy hàm lượng SA trong các loài Hồi này
thấp hơn trong loài Illicium verum (5 – 8 % acid shikimic).
- Với các dược liệu còn lại, đây là lần đầu tiên được khảo sát acid shikimic
tại Việt Nam, hàm lượng của chúng tuy không cao nhưng hầu hết đều là
những cây có vòng đời ngắn, dễ trồng, do đó có thể là nguồn nguyên liệu
thay thế cho cây Hồi trong sản xuất acid shikimic.
3.3. Chiết tách acid shikimic từ cây Ban tròn (Hypericum patulum)
* Phương pháp chiết
24
Lấy 100g dược liệu đem chiết Soxhlet với ethanol 85% . Dịch chiết được
gộp lại và cô đặc dưới áp suất giảm. Cặn thu được sau đó được hòa vào nước
trong cốc có mỏ 1000ml. Để cốc dịch chiết trong tủ lạnh. Gạn lấy dịch trong ở
trên và loại bỏ phần không tan trong nước. Dịch chiết nước được lắc 3 lần với
EtAc. Cô đặc dịch nước còn lại dưới áp suất giảm và nhiệt độ không quá 70
o
C. Cặn axit shikimic thô sau đó được hòa trong hỗn hợp MeOH – H
2
O và tinh
chế bằng than hoạt. Cô đặc dịch chiết được bột acid shikimic màu nâu nhạt.
Kết tinh nhiều lần trong hỗn hợp dung môi MeOH – EtAc thu được tinh thể
acid shikimic dạng hình kim nhỏ màu trắng. Quá trình này được thể hiện ở sơ
đồ 1 và sơ đồ 2.
Kết quả:
Từ 100g Ban tròn, thực hiện quy trình như đã nêu ở trên, chúng tôi đã thu
được 0,7834g acid shikimic ở dạng bột. Việc thẩm định lại chất này có phải là
acid shikimic được thực hiện bằng phương pháp HPLC. Kết quả thể hiện ở sắc

ký đồ sau.
Hình 8 : Sắc ký đồ HPLC của SA chuẩn
Minutes
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
0 200 400 600 800 1000
4.35 100.00
1: 210 nm, 8 nm
ACID SHIKIMIC Sigma
Shikimic acid Std 0,54mg-ml -5uL- 030210-001.dat
Retention Time
Area Percent
Hình 9: Săc ký đồ HPLC của sản phẩm thu được
25