Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống mía Roc10 (Saccharum officinarum L.) bằng công nghệ nuôi cấy in Vitro

I HM HÀ NI 2

KHOA SINH - KTNN


 THM


NGHIÊN CU QUY TRÌNH NHÂN NHANH
GING MÍA ROC10 (Saccharum officinarum L.)
BNG CÔNG NGH NUÔI CY IN VITRO

KHÓA LUN TT NGHII HC

Chuyên 






Hà Ni, 2014


KHOA SINH - KTNN

 THM


NGHIÊN CU QUY TRÌNH NHÂN NHANH
GING MÍA ROC10 (Saccharum officinarum L.)

BNG CÔNG NGH NUÔI CY IN VITRO

TÓM TT KHÓA LUN TT NGHII HC



Người hướng dẫn khoa học
Th.S PHAN TH THU HIN
PGS.TS CHU HOÀNG HÀ



Hà Ni, 2014
LI C



Tôi             PGS.TS Chu
Hoàng Hà
         và Ths. Phan Thị Thu
Hiền  

Tôi 


Tôi 
trong kh

 


 , tháng 5 
Sinh viên









Tôi xi





Sinh viên





BAP : 6- Benzyl amino purine
CCS 
cs : 
 : Môi 
 
IBA : Indol - 3 - butiric acid
MS : 
NAA : Naphthalene Acetic Acid
NN1 : 
NN2 : 
NN3 : 
NN4 : 
ROC : Republic of China
TB : Trung bình
TR1 : 
TR2 : 
TR3 : 
TR4 : 















Hình
Tên hình
Trang
1.1
          


4
1.2
Ging mía ROC10
15
1.3


15
3.1
Quá trình hình thành và phát trin c nh sinh
ng, chi nách sau khi kh trùng

26
3.2
Bi ng ca n BAP và IBA ti h
s nhân nhanh chi mía ROC10

29
3.3
S phát trin ca chi mía sau 30 ngày nuôi cy
30
3.4
Bi s r trung bình/chi ca chi mía ROC10
33
3.5
R hình thành sau 30 ngày nuôi cy
34
3.6
Cây ging trng trong bt
35




Trang
1.1

Mt s chu ting dùng
5
2.1

22
2.2

23
3.1
Kt qu nuôi cy chi nách sau 7 ngày nuôi cy
24
3.2


25
3.3
ng ca t hn kh 
nhân nhanh chi mía ROC10
28
3.4
ng ca n - n kh o
r ca ging mía ROC10
32



 1
 1
2. Mc tiêu nghiên cu 2
 2
 2
 3
U 3
 3
1.1.1.  3
 4
in vitro 7

in vitro 9
1.2.1.  9
 10
1.3.  12
1.3.1 12
1.3.2.  12
 14
1.4.1.  14
1.4.2.  14
1.4.3.  15

.  17
 17
 17
 17
 17
 17
 18
 19
 19
 19
 19
2.5.4
in vitro 21
2.5.5- 
 22
.  24
 24
3.2 24

ROC10 27
3.4-  31
 36
 37
 38

1



1. 
Mía (Saccharum L.) thuc chi Mía (Saccharum), h Hòa tho (Poaceae),
b lúa (Poales), lp Mt lá mm (Monocotyledoneae). ng là cây
trng kinh t quan trng ca vùng nhii và cn nhic trng trong
khong 74 quc gia trên th gii. Hin nay,  khnh v trí là
cây công nghi  u cung cp ngun nguyên liu cho ngành công
nghing, phc v nhu cc và còn là mt hàng xut
khu quan trng. Ngoài ra các ph phm ca ngành công nghing còn là
ngun nguyên liu quí báu cho các ngành công nghip giu, cn. Vì
vy, khi mà ngun nhiên liu lng ngày càng cn kin
vic thay th ng ca th k 21 là ly t mía, sn xut men các loi,
sn xut ethanol [15].
 c ta liên tc phát trin, tng mnh v
din tích, sc trng rng rãi  nhia
  c ta các t      An, Thanh
ng Nai Tuy nhiên, ngành công nghip c
 máy ho công sut vì thiu nguyên liu.
Nguyên nhân ca v này là do các ging mía bt cao
dn dn b thoái hóa sau mt thi gian canh tác còn các gic nhp
ni v d b sâu bnh, không phù hp vu kin khí h
sut thp. V i bc thit là phi tìm ra ngun ging cây trng
t cao, va sch bnh, phù hp vu kin khí hu Vi
phc v sn xut.
Có nhiu gic nhp ni, khng hiu
nhit trt cao, chng tt,
2

chng chu khc trng nhm cung cp
ngun nguyên liu ch l - Tuyên Quang.
Ging mía ROC10 do vin nghiên cu o. Ging
mía này có nhm nông sinh hc: ny mng thi gian
m, thi gian sau t  nhánh kho, thích
ht màu mt mn, chu thâm canh, kháng bnh than và mt s bnh
khác, t l t cao.  ng thì
vic cp thit là phi cung cp cho nông dân ngun ging tt cao,
sch b có m nhu cng
t nuôi cy in vitro là mt li th ln. t này giúp bo
tn ngun gen thc vt. Xut phát t nhng lý do trên chúng tôi tin hành
thc hi tài u quy trình nhân nhanh ging mía ROC10 bng
công ngh nuôi cy in vitro
2. Mc tiêu nghiên cu
Nhân nhanh thành công ging mía ROC10 bng công ngh nuôi cy mô
t bào in vitro.

-  trùng, nuôi cnh ng và chi nách
- ng công ngh t bào
- o r
- áp hun luyn và tri
4. 
- Nghiên cu to vt liu sch bnh bng nuôi cng và
chi nách t các cá th .
- Xây dng quy trình nhân ging mía ROC10 bng công ngh in vitro.
- Tin hành ra r
- Tin hành tru kii
3





1.1.1. 

   

- Tính toàn năng của tế bào: 

].
m sinh hc hii thì m
u cha mng thông tin di truy ng
thông tin di truy
u có th phát trin thành m
a t bào [13].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cy mô t bào thc cht là kt
qu ca s phân hoá và phn phân hoá.
- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào: 
                 mô
 






4





14].
               
chuyên :






Hình 1.1
[3]

 
 



 
 10].

Là nhân t quan trng quynh s thành công ca quá trình nuôi
cy. Hu hng nhân tc s d nuôi cy
mô và t bào thc vu bao gm các thành phn sau:
- Các nguyên t mui khoáng
+ Nguyên t ng: Các nguyên t ng bao gm: Fe, N, P, K, S,
T bào phôi
sinh
S phân hóa t

bào
S phn phân hóa t
bào
T bào chuyên hóa
5

Mg, Ca, Chúng có chn cu trúc ca t
bào. N ca các nguyên t ng trên 30 mg/l (tc 30 mg/l)
+ Nguyên t ng: Các nguyên t ng bao gm: Cu, Zn, Mn, Bo,
I, Co,ng nguyên t c s dng  n th
- Ngu: 
saccarozap là 2
-
coza, mantoza, galactoza [2], [8].
- Vitamin: Vitamin là các hp cht hu trúc ca
enzim và các cofactor ca nhiu phn ng sinh hoá. Mc dù tt c các loi mô
và t bào thc vt nuôi cy in vitro có kh  tng hc hu ht các
 v n phi b sung thêm t bên
ngoài vào, nht là các vitamin thuc nhóm B (Vitamin B
1
, vitamin B
2
, vitamin
B
6,
myo inositol, biotin, pantothenic axit).
-: Các chu ting là thành phn
không th thing nuôi cy mô và t bào thc vt, có vai trò
quynh quá trình phát trin hình thái ca cây.
Bng1.1. Mt s chu ting dùng [16]

Tên chng
N s dng (mg/l)
2,4D [dichlorrophennoxy]
-NAA [naphtylaxetic axit]
-IAA [indol axetic axit]
IBA [indol butyric axit]
Kinetin [6 finfuryl amino purine]
BA [6-BAP][6benzy 1 amino purine]
2-IP[N6-Dimetylally1amino purine]
GA
3
[Gibberelic axit]
0,2-5
0,1-5
0,1-5
0,1-2
0,1-2
0,1-2
0,1-2
0,1-2
6

-t s hp chc b ng

+ c da: Là hp chc s dng nhiu . Cht có
ho   c da hi  c chng minh là myo-inositol (m-
inositol) và mt s c dng
nuôi cng khá ln chim 10 - 20% th ng [2], [16].
+ 



+ 
tiên nuôi t



+  


  )
, [2].
+ 
y mô t bào
axit amin.
+ 



-
7

+ Chn - thch (Agar)
Agar là mt trong nhng ch ng ph bin nht (to
c s dng làm chng rn li.  80
0
C,
thch ngc chuyn thành dng sol và  40
0
C tr v trng thái gel. Kh
c ca thch là 6 - 12 c [2].

+ ng
ng nuôi cy phc hoàn toàn sch ion. Thông
i ta s dc ct hai ln [2].
+ Than hot tính
 hp thu các cht màu, các hp cht phenol, các sn phm
i th cng tr nên sm
khi có than ht tính, có th kích thích s ng ca r [2].
+  pH cng

- 5,8

gar.
in vitro
V n quy trình nhân gin [17].
1.1.3.1. Giai đoạn 1: Giai đoạn vào mẫu
nh ti toàn b quy
trình nhân gin này phm bc các yêu cu sau:
- T l cht thp.
- T l sng cao.
- Mô cng và phát trin tt.
8

Mt s hoá chng dùng HgCl
2
, CaOCl
2
, NaOCl, H
2
O
2,

Tu thuc
vào tng mô thc vt mà la chn n, thi gian x lý và hoá cht thích
hp [13].
1.1.3.2. Giai đoạn 2: Giai đoạn nhân nhanh
n then cht ca c quá trình
nhân ging in vitro vì mc n này là nhm to ra h s nhân
chi in vitro cao nh  s nhân chi, phng
ng các chu ting: Auxin, Xytokinin, Gibberelin,
các hp cht t nhiên kt hp vi yu t nhi, ánh sáng thích hp. Giai
n này kéo dài trong khong 4 - 8 tun [17].
1.1.3.3. Giai đoạn 3: Giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
ng nuôi cc b sung mng nh 
nhóm hoocmon thc vt có vai trò sinh lý là to r bnh cho mô nuôi cy,
-c s dng nhiu nhn này
ng kéo dài 2 - 8 tun [17].
1.1.3.4. Giai đoạn 4: Giai đoạn huấn luyện thích nghi
n cui cùng ca quá trình nhân ging in vitro, nó quyt
nh kh ng ng dng ca quá trình này vào thc tin sn xut. Thi gian
ti thiu cho s- 3 tun, trong thi gian này cây cc
o vc nhng bt lc, nhim nm, vi
khun này cn có giá th cp.
Phi gi n phi che ch
gi m và tránh ánh sáng quá mn này cm b t t
76 -  t 82 - 85% [17].
9

 
in vitro

,

- 1960,,

  in vitro            

nhiên kin vitro
].
in vitro



      

].


   
].
Heinz,           

    

].
10

c bii
vi các cây trng nhi d hp t cao. Hu hu có th
ng vô tính in vitro vi mi hoá trên quy mô
ln (theo tài liu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987) [9].

 Vit Nam, các ngành khoa hc nói chung và công ngh nuôi cy mô

t bào n trin chi th gii rt nhiu. Vic ng
dng nhng thành tu cng in vitro còn là m
vc khá mi mng
c nhng thành t trong thc
hin nhân nhanh các lo ngt, chui (Trung tâm CNSH),
da (Vin nghiên cu du và cây có du, Vin khoa hc Vit Nam), mía
ng (Trung tâm CNSH, Vin nghiên cu du và cây có du, Trung tâm
sinh hc và cây thc nghi cao [4].
    in vitro        
             


,
].



ng].
Tuy vii v


].
11

Chi Th Tc, H Hu Nh u s dng
t nuôi cy mô t  nhân nhanh mt s ging mía  Vi
CP5243, VN 72234, Ving và ging ROC 10. Kt qu nghiên cu thu
c là:  n vào mu, lá non cc s dng làm vt liu
to cm chi, x lí thích hp nht vi hoá cht HgCl
2

0,1% trong 5 phút. 
n nhân nhanh to cm chi kt qu i vi 2 ging mía
CP5243 và VN 72234 thì n BAP thích hp nht cho s phát sinh cm
chi vi hai ging mía ROC10 và Ving thì
n  BAP thích hp nht cho s phát sinh cm chi là 0,3 mg/l môi
ng [14].
            


].
n Th Thu H 
thut nhân nhanh ging mía VN84-422 và VN85-1427 bin
vitro, s dng nguyên liu nuôi cy là mt mm. Kt qu nghiên cc
là:  n nhân nhanh chi vi 2 ging mía VN84-422 và VN85-
1427 thì n 0,5 mg/l kinetin + 1,5 - 2 mg/l BAP thích hp nht và h s
t 2,8 ln sau 3 - 4 tun.  n ra r to cây hoàn chnh
n 2 - -NAA là thích hp nht [5].
Nguyn Th Nhn (2005) nghiên c  t nhân nhanh các ging
mía Qu ng 15 và F134 bin vitro. Kt qu nghiên cu
c:  n to vt liu khu in vitro i vi mô cnh
 ng và các mt ng trên thân cây vic kh trùng bng Hypocloric
canxi 5% trong 15 phút là phù hp.   n nhân nhanh in vitro môi
ng phù hp là: MS + 0,5 mg/l -NAA + 1 mg/l BA.  n ra r to
12

cây hoàn chng thích hp là: MS + 0,5 mg/l -NAA (hoc 7,5%
Saccaroza) [13].




mn xut hàng triu cây ging in vitro, c ging in vitro ca các loi
cây hot t nhit nhiu
phòng nuôi cy mô ci, hong rt có hiu qu và m
p mt s ng ln cây ging in vitro cho vùng sn xut tt
và các vùng ph cn [13].
1.3. Tìm hi
1.3.1. 
Cây mía thuc h hòa tho (Poaceae), ging Saccharum (S) là hn hp
ca sáu loài c c ging Saccharum 
di (S. spontaneum L. và S. robustum Brvaes & Jeswiet, S. sinense Roxb., và
S. edule Hassk). Bn loài cây trng  n có s lai ging phc tp và luôn
có th giao phn chéo vi nhau. Tt c các gic trng
hiu là các ging lai gia các loài này vi nhau [1].
1.3.2. 
Mía là cây công n



 - 90%
 -  mía chín già

ng. 
13

 



-  - 
 - 55% cellulose) 2,5%

 Bã mía có 
              
, 


-  - 
bình         , tro
15%, protein 5%, sáp 
 
-, 

c
lít 
 - 

.
-  -  


 hân

 - 

14

 
a
 - 
 - 
 trung du

 - 
   ].
1.4. m ca ging mía ROC 10
1.4.1. Ngun gc
Gic Vin Nghiên c
to và chính thn xut t tháng 5/1984. ROC10 có tên gc
là dòng lai 76 - 658, là con ca cp lai F152 (ng có kh 
t khá cao, có kh nh mnh than và bnh r
sng cao) và ROC5 (ng có kh nh cháy lá, bnh
th, bnh trng lá và bnh r st màu cam) [26].
1.4.2. 


 

. Không có tai lá, mía ra hoa. 
 .




15


Hình 1.2: Ging mía ROC10 [26]


ROC10 cho n].
1.4.3. 

Hình 1.310 [26]



16

- 
- 
- 
-  >10%
-  [26].