Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo và tiếp nhận gen gus của một số giống lúa thông qua vi khuẩn agrobacterium tumerfaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



LÂM THỊ MẠNH


Tên đề tài:
“
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TIẾP NHẬN GEN GUS
CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMERFACIENS”




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC



Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : CNSH - CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khoá học : 2010 – 2014
Giáo viên hướng dẫn : 1. PGS.TS. Ngô Xuân Bình
2.ThS. Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH & CNTP Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014
LỜI CẢM ƠN

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô
sẹo và tiếp nhận gen gus của một số giống lúa thông qua vi khuẩn agrobacterium
tumerfaciens”.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Ngô Xuân Bình
trưởng khoa CNSH - CNTP, đã tạo điều kiện giúp đỡ cho em trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s Lương Thị Thu Hường, Ks. Lã
Văn Hiền những người trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình làm đề tài và
hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
quá trình học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên tạo
điều kiện để em hoàn thành khóa luận này.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi
những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn
để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Lâm Thị Mạnh
MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về cây lúa 3
2.1.1. Nguồn gốc cây lúa 3
2.1.2. Phân loại cây lúa 3
2.1.3. Sinh thái học của cây lúa 4
2.1.4. Giá trị cây lúa 6
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 6
2.2.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 6
2.2.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA 7
2.2.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật 9
2.3. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu 10
2.3.1. Gen gus 10
2.3.2. Gen bar 10
2.4. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa 11
2.4.1. Phương pháp vi tiêm 11
2.4.2. Chuyển gen bằng xung điện 11
2.4.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) 11
2.4.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen 12
2.5. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam 12
2.5.1. Trên thế giới 12
2.5.2. Ở Việt Nam 13

2.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào lúa ở thế giới và Việt Nam 14
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14
2.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15
Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Vật liệu nghiên cứu 16
3.1.1. Vật liệu thực vật 16



4
3.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium và vector biến nạp 16
3.2. Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu 17
3.3. Hóa chất và thiết bị 17
3.3.1. Hóa chất 17
3.3.2. Thiết bị 17
3.4. Nội dung nghiên cứu 17
3.5. Phương pháp nghiên cứu 18
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa 22
4.2. Kết quả ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số giống lúa
25
4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp với kinetin đến khả năng tạo
mô sẹo của một số giống lúa 27
4.4. Kết quả ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus của một
số giống lúa 30
4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen gus của một
số giống lúa 33
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
5.1. Kết luận 36

5.2. Đề nghị 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO 37



DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

As :

Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)
A. tumefaciens :

Agrobacterium tumefaciens
BAP :

6- Benzyl Amino Purine
CCM :

Co-Cultivation Medium
CMV :

Cucumber Mosaic Virus
Cs :

Cộng sự
CT :

Công thức
CV :

Coeficient of Variation
DNA :

Deoxyribonucleic Acid
Đ/c :

Đối chứng
FFTC :

Food and Fertilizer Technology Center
FAO :

Food and Agriculture Organization
Gus :

β-1,4-Glucuronidase
KD :

Khang Dân
LSD :

Least Singnificant Diference Test
MS :

Murashige & Skoog (1962)
TMV :

Tobacco Mosaic Virus
Ti -plasmid :

Tumor Including Plasmid
TB :

Thái Bình
X-gluc :

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronidase Acid
2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG


Bảng 2.1. Một số loài lúa Oryza, nhiễm sắc thể, và sự phân bố 4
Bảng 2.2. Đặc điểm sinh thái của một số bộ phận cấu tạo cây lúa 5
Bảng 2.3 . Diện tích, năng suất và sản lượng lúa trên thế giới qua các năm 13
Bảng 2.4. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa của Việt nam qua các năm 13
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa 22
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa 25
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp kinetin đến khả năng tạo mô
sẹo của một số giống lúa 27
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus của
một số giống lúa 30
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen gus của
một số giống lúa 33
DANH MỤC CÁC HÌNH


Hình 2.1. Vi khuẩn A. tumefaciens 6

Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 7
Hình 2.3. Cấu trúc Ti-plasmid 7
Hình 2.4. Cấu trúc T-DNA 9
Hình 2.5. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 9
Hình 3.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi
gen điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh
giới phải). 16
Hình 3.2. Sơ đồ cấu trúc của vector pCambia 3301 16
Hình 3.3: Phương pháp biến nạp gen gus vào lúa (Hiei Y và cs, 2008) [34]
Error! Bookmark not defined.
Hình 4.1. Mô sẹo của 3 giống lúa được nuôi cấy trên môi trường N6 và MS 24
Hình 4.2. Mô sẹo của 3 giống lúa nuôi cấy trên môi trường N6 có bổ sung
2,4D 2mg/l (sau 14 ngày) 26
Hình 4.3. Mô sẹo của 3 giống lúa được nuôi cấy trên môi trường bổ sung nồng
độ 2,4D 2mg/l kết hợp với nồng độ kinetin 0,5mg/l (sau 17 ngày) 29
Hình 4.4. Mô sẹo của các giống lúa sau khi tiếp nhận gen gus 32
Hình 4.5. Mô sẹo của 3 giống lúa sau khi biến nạp và nuôi cấy trên môi
trường có bổ sung AS 35



1
Phần 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cây Lúa có tên khoa học là Oryza sativa, thuộc họ Hòa thảo (Poaceae). Lúa
là một trong năm loại cây lương thực chính phục vụ nhu cầu thiết yếu hằng ngày
của hơn một nửa dân số trên thế giới. Đặc biệt, đối với người dân Châu Á và Châu
Phi, lúa gạo là nguồn lương thực chính, cung cấp dinh dưỡng có giá trị trong khẩu

phần ăn do trong lúa gạo có hàm lượng tinh bột cao, giàu protein và các acid amin
thiết yếu như Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan. Vì vậy lúa gạo đóng vai
trò to lớn trong đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu. Bên cạnh đó, lúa còn là mặt
hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước trên thế giới, trong đó bao gồm cả Việt
Nam và có tiềm năng rất lớn trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn
nuôi, sản xuất rượu cồn và ngành thương mại [11]. Với những giá trị đó, lúa được
trồng ở nhiều quốc gia trên trế giới như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc, Ấn
Độ,…Năm 2011, FAO thống kê sản lượng lúa trên thế giới đạt đến 721 triệu tấn
(tương đương 481 triện tấn gạo), tăng lên 3% hay 24 triệu tấn so với 2010 [1]. Ở
Việt Nam, sản lượng lúa cả năm 2012 đạt 43,7 triệu tấn, tăng 1,3 triệu tấn so với
năm trước do diện tích và năng suất đều tăng, trong đó diện tích gieo trồng đạt
7753,2 nghìn ha, tăng 97,8 nghìn ha; năng suất đạt 56,3 tạ/ha, tăng 0,9 tạ/ha [15].
Tuy nhiên, năng suất và chất lượng lúa gạo phụ thuộc rất nhiều yếu tố như khí
hậu, thời tiết, đặc điểm thổ nhưỡng, giống và đặc biệt là yếu tố sâu bệnh hại đã gây
thiệt hại nghiêm trọng. Để đáp ứng nhu cầu lương thực ngày càng tăng và hạn chế
các tác nhân làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo, hiện nay xu hướng sử dụng
các giống lúa biến đổi gen đang được các nhà nghiên cứu khoa học đặc biệt quan
tâm. Một số các nhà nghiên cứu cũng đã thành công trong tạo giống lúa biến đổi
gen như:
- Daisuke Tokuhara và cs đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-ARP1có
khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [29].
- Nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã chuyển gen thành công
vào giống lúa IR64 [13].
- Phan Tố Phượng và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21
kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A.tumerfaciens [17].



2
Trên thực tế hiệu quả chuyển gen ở lúa còn gặp nhiều hạn chế: tỷ lệ tạo mô

sẹo, tỷ lệ nhân nhanh và hiệu quả tái sinh còn thấp, còn phụ thuộc khả năng xâm
nhiễm của A.tumerfaciens dẫn tới hiệu quả biến nạp gen còn thấp (chỉ khoảng 11%)
[13]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh
hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo và tiếp nhận gen gus của
một số giống lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” đề đánh giá
hiệu quả biến nạp gen ở lúa và phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyển gen ở nhiều
giống lúa khác nhau.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Xác định ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa.
- Xác định ảnh hưởng của nồng độ 2,4D và kinetin đến khả năng tạo mô sẹo
của một số giống lúa.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp nhận gen gus
thông qua A.tumerfaciens vào một số giống lúa ở Việt Nam.
1.3. Yêu cầu
- Xác định được ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa.
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa.
- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ 2,4D kết hợp với kinetin đến khả
năng tạo mô sẹo của một số giống lúa.
- Xác định được ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp nhận gen gus
của một số giống lúa, bao gồm các yếu tố sau:
+ Độ tuổi của mô sẹo
+ Nồng độ của AS
1.4. Ý nghĩa của đề tài
- Giúp sinh viên củng cố, hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu.
- Biết được phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu,
biết cách trình bày một bài báo khoa học.
- Dựa trên kết quả đó tiến hành các nghiên cứu tiếp theo và là cơ sở để áp

dụng công nghệ chuyển gen cho các giống lúa và các loài cây trồng khác.



3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về cây lúa
2.1.1. Nguồn gốc cây lúa
Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khảo cổ học, lúa có nguồn gốc từ vùng
Đông Nam Á và Đông Dương, những nơi có nhiều di tích phổ biến của cây lúa phát
triển khoảng 10.000 năm trước Công Nguyên. Các giống lúa Indica được trồng ở
vùng nhiệt đới Đông Nam Á, các giống Japonica được trồng phổ biến ở vùng
Trung và Nam Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Đài Loan có điều kiện khí hậu
lạnh hơn [11].
2.1.2. Phân loại cây lúa
- Về mặt phân loại thực vật, cây lúa thuộc họ Poacae (hòa thảo), chi Oryza.
Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ẩm của Châu Phi, Nam
và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung Mỹ và một phần ở Châu
Úc [12]. Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và chiếm đại bộ phận
diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L. Loài lúa này có mặt ở khắp nơi như vùng
đầm lầy, sườn núi, vùng nước ngọt, nước mặn, vùng xích đạo,và cả vùng nhiệt và
ôn đới. Loài Oryza glaberrima Steud., chỉ được trồng giới hạn ở một số quốc gia
Tây Phi Châu và hiện đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L. [15].
Chi Oryza có 23 loài, có 3 loài phụ là Indica, Japonica và Javanica [11].
Lúa Indica thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới có thân
cao, dễ đổ ngã, nhiều nhánh, lá xanh nhạt, cong và kháng được nhiều sâu bệnh. Hạt
gạo dài và trung bình, chứa nhiều tinh bột nhưng năng suất kém hơn Japinica.
Lúa Japonica thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc nơi có độ cao trên

100m (so với mực nước biển), có thân ngắn, chống đổ, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít
nhánh hơn, hạt gạo thường ngắn và tròn hơn, có năng suất cao hơn Indica.
Lúa Javanica (Japonica nhiệt đới): Có tính chất trung gian giữa lúa Japonica
và lúa Indica. Loại lúa này có hạt to rộng, chất amylose cao, thường có đuôi, trấu có
lông dài, ít chồi, gié dài, thân cây dày thẳng đứng, cây rất cao giàn, không chịu
lạnh, chịu hạn hán.



4
Bảng 2.1. Một số loài lúa Oryza, nhiễm sắc thể, và sự phân bố
Loài lúa Oryza

Số NST
n=12
Phân bố
O. alta Swallen 48 Trung và Nam Mỹ
O. australiensis Domin 24 Châu Úc
O. barthii Chev (O. breviligulata) 24 Tây và Đông châu Phi
O. brachyantha A. Chev. & Roehr. 24, 48 Tây, Đông và Trung châu Phi
O. eichingeri A. Peter 24 Đông và Tây châu Phi
O. glaberrima Steud. 48 Tây châu Phi
O. grandiglumis (Doell) Prod. 48 Nam Mỹ
O. granulata Ness & Arn. Ex Hook
f.
24 Trung và Nam Mỹ
O. glumaepatula Steud. (O. perennis
subsp. cubensis)
48
24

Châu Phi
Trung và Nam Mỹ
O. latifolia Desv. 24 Châu Úc, Trung và Nam Mỹ
O. longiglumis Jansen 48
Đông Nam Á, Nam Trung
Quốc, New Guinea
Nguồn: Nguyễn Ngọc Đệ,2008[11].
2.1.3. Sinh thái học của cây lúa
Các giống lúa có những đặc điểm như chiều cao, thời gian sinh trưởng (dài
hay ngắn), chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh khác nhau. Song
cây lúa đều có những đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và đều có chung các bộ
phận rễ, thân, lá bông và hạt. Mỗi bộ phận đều có đặc điểm sinh thái phù hợp với
các chức năng nhất định [15].



5
Bảng 2.2. Đặc điểm sinh thái của một số bộ phận cấu tạo cây lúa
Bộ phận Đặc điểm sinh thái
Thân
Lúa thuộc loại thân thảo. Ở thời kì mạ và giai đoạn lúa non thân
lúa do các bẹ lá tạo thành. Sau khi làm đốt, thân lúa do các lóng và
đốt tạo thành. Chỉ vài lóng ở ngọn dài ra, số còn lại ngắn và dày đặc.
Lá
Lá lúa điển hình gồm: bẹ lá, phiến lá, lá thìa và tai lá. Lá được
hình thành từ các mầm lá ở mắt thân. Tốc độ ra lá thay đổi theo thời
gian sinh trưởng và điều kiện ngoại cảnh. Lá mầm mọc ra trong quá
trình ngâm ngủ và thời kì đầu khi gieo mạ. Lá thật mọc trong quá
trình sinh trưởng và tồn tại trong suốt quá trình sinh trưởng của lúa.
Rễ

Bộ rễ lúa thuộc loại rễ chùm. Những rễ non có màu trắng sữa,
rễ trưởng thành có màu vàng nâu và nâu đậm, rễ đã già có màu đen.
Gồm rễ mầm và rễ phụ: Rễ mầm là rễ mọc ra đầu tiên khi hạt lúa nẩy
mầm, thường mỗi hạt lúa chỉ có một rễ mầm. Rễ phụ mọc ra từ các
mắt (đốt) trên thân lúa. Rễ có nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng
nuôi cây, giúp cây bám chặt vào đất.
Hoa
Hạt lúa khi chưa thụ phấn, thụ tinh thì gọi là hoa lúa. Trên một
bông lúa thường có nhiều hoa và quá trình trổ bông không đồng thời,
do đó hoa lúa nở theo quy luật từ trên xuống dưới, từ ngoài vào
trong.
Hạt lúa
Gồm hạt gạo và vỏ trấu. Hạt gạo gồm : phôi và phôi nhũ. Vỏ
trấu gồm: trấu trên và trấu dưới. Trấu dưới lớn hơn trấu trên và bao
khoảng hai phần ba bề mặt hạt gạo trưởng thành. Chiều dài, rông, độ
dày của hạt thay đổi nhiều giữa các giống. các hạt lúa xếp xít lên
nhau tạo thành bông lúa.
Nguồn: Nguyễn Đăng Nghĩa, 2008[15].




6
2.1.4. Giá trị cây lúa
Lúa gạo là lương thực chính của người dân Châu Á và khoảng 40% dân số thế
giới, cũng như ngô của người dân Nam Mỹ và lúa mì ở Bắc Mỹ. Lúa gạo có giá trị
rất lớn không chỉ về mặt dinh dưỡng mà còn về mặt sử dụng và thương mại [11].
- Về mặt dinh dưỡng: Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng. So với lúa mì, gạo có
thành phần tinh bột và protein thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra nhiều hơn và
trong gạo chứa hàm lượng acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine,

Methionine, Tryptophan… có cao hơn lúa mì [11].
- Về giá trị sử dụng: Ngoài làm nguồn lương thực chính, gạo còn dùng để chế
biến nhiều loại bánh, sản xuất rượu, cồn, thức ăn chăn nuôi… Cám là các lớp vỏ
ngoài của hạt gạo do chứa nhiều protein, chất béo, chất khoáng, vitamin, nhất là
vitamin nhóm B, nên được dùng làm bột dinh dưỡng trẻ em và điều trị người bị
bệnh phù thũng và là thành phần cơ bản trong thức ăn gia súc, gia cầm,…Trấu
ngoài công dụng làm chất đốt, chất độn chuồng còn dùng làm ván ép, vật liệu cách
nhiệt, cách âm, chế tạo carbon và silic….[11].
- Về mặt giá trị thương mại: Trên thị trường thế giới, giá gạo xuất khẩu tính
trên đơn vị trọng lượng cao hơn rất nhiều so với các loại hạt ngũ cốc khác. Nói
chung, giá gạo xuất khẩu cao hơn lúa mì từ 2 – 3 lần và hơn ngô 4 lần [11].
2.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật
2.2.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens

Hình 2.1. Vi khuẩn A. tumefaciens



7
A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5-3,0 x 0,7-
0,8µm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí,
nhuộm màu gram âm (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn. A.tumefaciens là loài vi khuẩn
gây ra bệnh khối u hình chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ
rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối
u hình chóp [2].

Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.2.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid và T-DNA
- Ti-plasmid

Hình 2.3. Cấu trúc Ti-plasmid
Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vòng, nằm
độc lập trong tế bào chất. Plasmid có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc
vào sự sao chép DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn [2].



8
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở
nhiệt độ dưới 30
0
C. Bằng phương pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép dị hợp,
người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng. Trong đó, vùng T-
DNA (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành
khối u còn hai vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong
Agrobacterium [8].
Trong Ti-plasmid có hai vùng quan trọng cần thiết cho quá trình chuyển gen ở
thực vật. Thứ nhất, vùng T-DNA là vùng được chuyển vào thực vật nhờ quá trình tiếp
hợp giữa A. tumefaciens và thực vật ở những chỗ có vết thương. Hiện nay trong kỹ
thuật chuyển gen cây trồng, người ta lợi dụng vùng T-DNA đã mang đoạn gen cần
chuyển vào thực vật. Thứ hai, vùng vir là vùng gây độc cho thực vật nên không được
chuyển vào bộ gen của cây trồng, mà nó đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình chuyển T-
DNA vào trong tế bào thực vật [8].
- T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho
sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị
trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left
Border).
Ở Ti-plasmid dạng nopaline, T-DNA xâm nhập vào genome thực vật ở dạng

một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-DNA là một
đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá
những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u
như tms1, tms2, tmr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
auxin và cytokinine. Trong các vùng DNA của Ti-plasmid, ngoài T-DNA vùng
được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi
là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir là một loạt các
protein đặc hiệu như virE
2
, virB, virD, virD
2
[31].




9

Hình 2.4. Cấu trúc T-DNA

2.2.3. Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật
Các tế bào cây khi bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi
khuẩn như: acetosyringon (As), alpha hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các
hợp chất này, A. tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-
DNA vào tế bào thực vật. Quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và
RB, LB. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng
vir hoạt động và tăng cường biểu hiện [20]. Sự tiếp xúc của A.tumerfaciens với các
hợp chất giải phóng từ mô thực vật bị tổn thương đã làm cho vùng vir của Ti-
plasmid được hoạt hóa và phiên mã.

Hình 2.5. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Khi A.tumerfaciens gặp dịch rỉ của các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc As
tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác
với As và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của
gen virG [18].




10
Sau đó protein virG đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen virB, C, D và E
không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen virG. Các sản phẩm của
operon virD mã hóa một loại endonuclease tạo ra vết cắt trên Ti-plasmid tại hai trật tự
biên 25bp. Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay
thế vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt
của trật tự biên phải. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương
tác giữa protein VirD2 với một hoặc hai protein do gen VirC mã hóa. Còn protein
VirE2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra, để làm cho nó ổn định trong
quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Còn gen VirB mã hóa cho các protein hình
thành nên một cầu nối cho T-DNA được chuyển sang tế bào thực vật [20].
2.3. Hệ thống gen chỉ thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens được sử dụng trong nghiên cứu
2.3.1. Gen gusA
Gen gusA: chỉ thị nhuộm màu mô tế bào thông qua phản ứng oxy hóa cơ chất

X-Gluc không màu thành màu xanh lam dưới tác dụng xúc tác của β-Glucuronidase
(gus) [10].
Gen gusA lần đầu tiên được phân lập từ E. coli. β-glucuronidase thường được
sử dụng để làm chỉ thị chọn lọc để nhận biết cây chuyển gen bởi ưu điểm dễ nhận biết
thông qua nhuộm màu, phản ứng có độ nhạy và độ ổn định cao. Hoạt tính gus trong tế
bào, dịch chiết, cặn tế bào còn có thể định lượng được thông qua phản ứng xúc tác cơ
chất huỳnh quang MUG (4-methylumbelliferyl β-D-Glucuronide) và đo bằng RE-
Mini 150 Fluometer (Schimadzu; Columbia) với chất chuẩn là MU (4-
methylumbelliferone, Sigma) ở bước sóng 360 và 460 nm. [42].
2.3.2. Gen bar
Gen bar được tạo dòng đầu tiên từ dòng vi khuẩn Streptomyses hygroscopicus,
là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT), có
tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT) là hoạt chất chính của thuốc
trừ cỏ như Bialaphos, Finale, Buster, Harvest và Basta. Glufosinate là hợp chất tự
nhiên được phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chế hoạt tính của enzyme tổng



11
hợp glutamin, enzyme cần thiết cho sự tạo thành glutamin và độc tính ammonia.
Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàm lượng glutamin và làm tăng
ammonia trong mô thực vật. Điều này làm cho quá trình quang hợp ngừng và cây
chết sau này [14].

2.4. Một số phương pháp biến nạp gen ở lúa
Ngoài phương pháp biến nạp gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens,
các phương pháp biến nạp gen trực tiếp cũng đã được ứng dụng nhiều trong chuyển
gen vào lúa, cụ thể:
2.4.1. Phương pháp vi tiêm
Các nhà nghiên cứu sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng

nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn. Phương pháp
này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác vị trí đã xác định và có
thể quan sát được. Phương pháp này cần thiết bị có độ chính xác cao, các thao tác
thực hiện cần chính xác và thành thạo [6].
2.4.2. Chuyển gen bằng xung điện
Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh. Khi
đặt các tế bào trần trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên
sinh thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình
thành lỗ hổng trên màng tế bào. Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình
thành, DNA sẽ đi vào tế bào qua các lỗ hổng. Một số tế bào thực vật có thể tiếp thụ
DNA nhờ xung điện mà không cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì
[5]. Zang và cs, (1988) đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần nhờ sử dụng phương
pháp xung điện [51].
Năm 1989, Shimamoto và cs đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở lúa
Japonica cũng sử dụng phương pháp chuyển gen qua xung điện [46].
2.4.3. Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube)
Phương pháp này lần đầu tiên được
Z. Luo
và Ray Wu và các cộng sự ở trường
Đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên cây lúa [52]. Khi hạt phấn rơi trên núm



12
nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ này mầm hình thành ống phấn. Lúc này tiêm
gen mong muốn theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ
hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào. Phương pháp này khá thành công đặc
biệt trên cây lúa và bông [6].
2.4.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen
Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs,

(1991) và được cải tiến bởi Cao và cs, (1992) [21]; Li và cs, (1993) [49]. Sau đó kỹ
thuật này đã được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa
Japonica. Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển
nhiều gen vào lua Japonica sử dụng súng bắn gen [25]. khi sử dụng súng bắn gen
tạo áp lực đẩy viên đạn được làm bằng kim loại đã được bọc plasmid mang gen
thiết kế, có kích thước khoảng 1µm, với vận tốc 130m/s, xuyên qua các lớp tế bào
biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ
gen của tế bào chủ. Hiệu quả chuyển gen lúa thông qua phương pháp này cũng khá
cao [6].
2.5. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam
2.5.1. Trên thế giới
Theo FAO, sản lượng lúa thế giới năm 2011 đạt 724 triệu tấn (tương đương
480 triệu tấn gạo) so với 703 triệu năm 2010, tăng 3%. Sản lượng tăng cao do mở
rộng diện tích canh tác lên đến 163,6 triệu ha, chủ yếu diễn ra ở các nước châu Á,
đặc biệt là Trung Quốc, Ấn Độ và Indonesia. Tại châu Á sản lượng lúa đạt 653 triệu
tấn, tăng 10% so với năm 2010. Tại châu Phi sản lượng cũng đạt 25,5 triệu tấn, tăng
1% so với năm 2010 do được mùa ở Ai Cập, Guinea, Nigeria a Sierra Leone.
Nhưng mất mùa cũng diễn ra ở Mali và Madagascar. Châu Mỹ La-tinh và vịnh
Caribea cũng tăng sản lượng ở các nước ngoại trừ Ecuador và Peru và một số châu
lục khác như Úc, Nga và Mỹ.
Năng suất lúa cao nhất đạt 204,285 triệu tấn tại Trung Quốc, Ấn Độ đạt 152,6
triệu tấn (FAO, 2012). Trong đó sản lượng lúa Châu Á đạt 651,58 triệu tấn, tổng sản
lượng trên thế giới năm 2005 đạt 632,176 triệu tấn tăng lên 703,154 triệu tấn năm 2010
và đạt 719,738 triệu tấn vào năm 2012 (FAO, 2014).



13
Bảng 2.3 . Diện tích, năng suất và sản lượng lúa trên thế giới qua các năm
Năm

Diện tích
(triệu ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lượng
(triệu tấn)
2004 150,553 4,023 605,808
2005 154,988 4,078 632,176
2006 155,551 4,107 639,067
2007 155,040 4,223 654,798
2008 160,000 4,288 686,212
2009 158,308 4,339 686,970
2010 161,649 4,349 703,154
2011 163,626 4,430 724,959
2012 163,199 4,410 719,738
Nguồn: FAO, 2014
2.5.2. Ở Việt Nam
Bảng 2.4. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa của Việt nam qua các năm
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lượng
(triệu tấn)
2004 7,45 4,85 36,15
2005 7,33 4,88 35,83
2006 7,33 4,89 35,85
2007 7,21 4,98 35,94
2008 7,40 5,23 38,73

2009 7,44 5,23 38,95
2010 7,49 5,34 40,01
2011 7,66 5,53 42,40
2012 7,75 5,63 43,66
Nguồn: FAO, 2014
Việt Nam có khoảng 9,3 triệu ha đất nông nghiệp, phần lớn diện tích đất dành
cho trồng lúa là chính khoảng 4,3 triệu ha (chiếm khoảng 46% diện tích đất nông
nghiệp). Năm 2009, diện tích canh tác lúa là 7,44 triệu ha, năm 2011 tăng thêm 0,21
triệu ha (7,66 triệu ha). Theo số liệu tính đến tháng 11/2012 cả nước đã gieo trồng
được 7 triệu ha lúa. Năng suất lúa bình quân 4,2 tấn/ha vào năm 2000 đã tăng lên 5,3



14
tấn/ha vào năm 2010. Năm 2012 theo số liệu tính năng suất đạt mức cao nhất từ trước
đến nay là 5,6 tấn/ha [4].
Sản lượng lúa gạo Việt Nam đạt với tới 32,9 triệu tấn 2002 và lượng gạo xuất
khẩu hàng năm khoảng 3,5 triệu tấn gạo. Năm 2009, lần đầu tiên Việt Nam đạt 6,05
triệu tấn gạo xuất khẩu. Sản lượng xuất khẩu cũng tăng liên tiếp trong năm 2010
(6,75 triệu tấn) và năm 2011 (7,10 triệu tấn). Sản lượng gạo xuất khẩu của Việt
Nam đã cung cấp lương thực cho 120 nước trên toàn thế giới [4].
2.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào lúa ở thế giới và Việt Nam
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Theo thông báo tóm tắt của ISAAA, năm 1995, diện tích gieo trồng cây chuyển
gen đầu tiên là 0,5 triệu ha, tăng lên 67 triệu ha năm 2003 và có gần 100 triệu ha cây
trồng chuyển gen được trồng trên phạm vi toàn cầu vào năm 2005. Trong giai đoạn
1986 – 1997 trên toàn cầu có tới 25,000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây
biến đổi di truyền với trên 60 loại cây trồng khác nhau [10].
Ở Philippine lúa là cây trồng chuyển gen đầu tiên được chính thức cho phép
thương mại hóa vào năm 2002. Trong năm 2004, Nam Phi đã trồng 84.000 ha lúa

chuyển gen, diện tích trồng ngô biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ cũng tăng
mạnh cho thấy xu hướng cây trồng biến đổi gen chiếm tỷ lệ lớn trong diện tích cây
trồng toàn cầu [10]
Một bước ngoặt trong nghiên cứu chuyển gen lúa trông qua A.tumerfaciens đã
được đánh dấu bởi công trình nghiên cứu của Smith và Hood (1995) [47]; Hiei và cs
(1997) [33]. Trong nghiên cứu của Hiei và cs, tác giả đã thiết kế thành công vector
đặc hiệu Superdinary, Cheng và cs đã thành công trong việc tạo ra quần thể lớn các
giống lúa chuyền gen Cry1Ab, Cry1Ac bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp thông
qua vi khuẩn A.tumefaciens [27].
Một số công trình nghiên cứu đã tạo được các dòng lúa Japonica và Indica
chuyển gen Bt kháng được sâu đục thân màu hồng, sâu đục thân sọc, sâu đục thân
màu vàng và sâu cuốn lá của các tác giả Fujimote và CS, 1993[28]; Nayak và CS,
1997[35], Wu và CS, 1997, báo cáo giống lúa Japonica chuyển gen cry1A(b) tạo
được tính kháng sâu đục thân ở thế hệ R6 và trong điều kiện thí nghiệm ngoài đồng
ruộng [50].



15
Năm 2013, Daisuke Tokuhara và cs đã tạo ra giống lúa chuyển gen MucoRice-
ARP1có khả năng cung cấp kháng thể chống Rotavirus [29].
2.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở nước ta, lĩnh vực nghiên cứu về cây trồng biến đổi gen đang được tiếp cận,
đầu tư và triển khai nghiên cứu. Nhiều gen quý có giá trị như gen quy định làm tăng
năng suất, tăng khả năng chống chịu, tăng chất lượng đã được phân lập và nghiên cứu
nhằm chuyển vào nhiều loại cây trồng như cây lúa, ngô, bông vải cây, cây đu đủ, cà
chua,…
Việt Nam đã tiến hành một số nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa như chuyển
gen kháng thuốc diệt cỏ, gen kháng sâu đục thân, kháng rầy, kháng virus,…
Trong chương trình Công nghệ Sinh học (CNSH) giai đoạn 1996 – 2000, Viện

CNSH đã thực hiện đề tài cấp Nhà nước đó là : “ Chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc
lá ở lúa“[15]. Giai đoạn 2001 – 2005, Viện CNSH thực hiện đề tài KC,04,13 :
“ Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu
sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi”

[9]

. Theo đó, Nhóm nghiên cứu tại Viện Di truyền
Nông nghiệp đã chuyển gen thành công vào giống lúa IR64 [13]. Phan Tố Phượng
và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây
lúa thông qua A.tumerfaciens [17].



16
Nos ployA

LacZ
35S
gus
35S
bar



LB

RB

Phần 3

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu là một số giống lúa được trồng ở các
tỉnh miền Bắc Việt Nam gồm: U
17
, Syn 6, Khang Dân.
3.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium và vector biến nạp
- Chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang hệ thống vector pCambia
3301 chứa gen chỉ thị gus do phòng thí nghiệm khoa CNSH-CNTP, trường ĐH
Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp.



Hình 3.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen
điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải).
- Vector pCambia 3301








Hình 3.2. Sơ đồ cấu trúc của vector pCambia 3301
Vector pCambia 3301 (hình 2.7) mang gen chọn lọc thực vật là gen bar, gen
chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này
được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi

17
đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là pUC18-
lacZa, dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus) và
được quy định bởi trình tự CaMV35S polyA. Chủng vi khuẩn Agrobacterium được sử
dụng là chủng EHA105 [53].
3.2. Địa điểm, thời gian và phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian: Từ 12/2013 - 06/2014
- Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá khả năng tiếp nhận gen gus của các giống lúa
U17, Syn6, Khang Dân ở quy mô phòng thí nghiệm.
3.3. Hóa chất và thiết bị
3.3.1. Hóa chất
- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS
(Murashige & Skoog, 1962); các chất kích thích sinh trưởng: BAP (Duchefa), IAA
(Trung quốc), GA3 (Duchefa), IBA (Duchefa), NAA (Trung quốc), Acetoseringone
(Sigma), L-pyroglutamic (Duchefa), L-asparagine (Duchefa),
- Kháng sinh: Rifamycin, spectomycin, cefotaxim, vancomycin, ticarcillin,
- Hóa chất khác: Yeast tract, pepton, NaCl, agarose, sucrose,
3.3.2. Thiết bị
Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử
(Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert
(Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210
(Đức), tủ nuôi lắc LSI (Hàn Quốc), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo
(Nhật bản), micropipette,
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo mô sẹo của một số
giống lúa.

- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo
của một số giống lúa.



18
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ2,4D kết hợp với kinetin đến khả
năng tạo mô sẹo của một số giống lúa.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen gus.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng tiếp nhận gen gus.
3.5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa được tiến hành dựa trên
phương pháp chuyển gen lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của
Hiei Y và cs (2008) [32]. Có cải tiến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và
được tiến theo quy trình dưới đây:
: Agrobacterium stock cấy trải trên đĩa

Hạt giống YEP (spec 50mg/l + rifam 25mg/l)

Cảm ứng mô sẹo MSD 2-3 ngày
7-10 ngày
Tạo dịch huyền phù AAM- Agro (OD=0,7-1,0)
Mô sẹo

Đồng nuôi cấy mô sẹo- Agro AAM-AS
3 ngày
Nhuộm X-gluc
Hình 3.3: Phương pháp biến nạp gen gus vào lúa (Hiei Y và cs, 2008) [34]

Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tiếp

nhận gen của một số giống lúa ở Việt Nam được tiến hành như sau:
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo
mô sẹo của một số giống lúa
Mẫu hạt lúa chín được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo phục vụ cho biến nạp
gen. Mẫu hạt được rửa bằng nước xà phòng loãng, để ráo nước. Tiến hành bóc bỏ