Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu của một số dòng đậu tương VX93 chuyển gen ở thế hệ t1, t2 và t3

1

I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM


HONG èNH LP


Tờn ti:
Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ
và kháng sâu của một số dòng đậu tơng VX93
chuyển gen ở thế hệ T
1
, T
2
Và T
3



KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC



H o to : Chớnh quy
Chuyờn ngnh : Cụng ngh Sinh hc
Lp : K42 - CNSH
Khoa : CNSH-CNTP
Khoỏ hc : 2010-2014
Ging viờn hng dn: TS. Nguyn Vn Duy

Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn




Thỏi Nguyờn, nm 2014
2

LỜI CẢM ƠN
Trong suất quá trình thực tập tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm khoa CNSH -
CNTP vừa qua, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, giảng viên hướng dẫn, cán bộ kỹ thuật tại
phòng thí nghiệm, thầy cô và gia đình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy giáo TS. Nguyễn Văn
Duy, Phó khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi thực tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Lã Văn Hiền, người đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất, cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu trong quá trình
thực tập và hoàn thành khóa luận trong suốt thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy, cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm - trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn tận tình giúp
đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến sự quan tâm sâu sắc từ gia đình, đã luôn ủng
hộ tôi về tinh thần, tạo điều kiện tốt nhất về kinh tế để tôi hoàn thành quá trình thực
tập tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến các anh, chị và bạn bè cùng thực tập tại phòng
thí nghiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và động viên để tôi có thêm nghị lực và niềm
tin hoàn thành khóa luận này.
Trong thời gian hoàn thành khóa luận, do còn hạn chế về trình độ và thời gian
nên không tránh khỏi những sai sót. Vì vậy, kính mong các thầy, cô giáo và các bạn

đóng góp ý kiến giúp cho bài khóa luận này được hoàn thiện hơn.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó !
Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2014
Sinh viên


Hoàng Đình Lập
3

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới trong giai đoạn 2008 - 2012
5
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam trong những năm gần đây
6
Bảng 3.1. Mật độ gieo trồng
24
Bảng 3.2: Trình tự hai cặp mồi khuếch đại vùng gen bar và gen cry1Ac
26
Bảng 4.1. Kết quả theo dõi khả năng kháng thuốc trừ cỏ ở thế hệ T
1
sau 5 ngày
30
Bảng 4.2. Kết quả theo dõi khả năng kháng thuốc trừ cỏ ở thế hệ T
2
sau 5 ngày
31
Bảng 4.3. Kết quả theo dõi khả năng kháng thuốc trừ cỏ ở thế hệ T
3
sau 5 ngày
31

Bảng 4.4. Kết quả theo dõi khả năng kháng sâu trên đồng ruộng ở thế hệ T
1
32
Bảng 4.5. Kết quả theo dõi khả năng kháng sâu trên đồng ruộng ở thế hệ T
2
33
Bảng 4.6. Kết quả theo dõi khả năng kháng sâu trên đồng ruộng ở thế hệ T
3
34
4

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1. Vòng đời của sâu cuốn lá đậu tương
11
Hình 2.2. Sâu đục quả đậu tương
12
Hình 4.1: Kết quả kiểm tra Basta 0,3mg/l trên đồng ruộng
29
Hình 4.2. Kết quả sau 24 giờ theo dõi khả năng kháng sâu của các dòng đậu
tương VX93 trong phòng thí nghiệm ở thế hệ T
1
35
Hình 4.3. Kết quả sau 24 giờ theo dõi khả năng kháng sâu của các dòng đậu
tương VX93 trong phòng thí nghiệm ở thế hệ T
2
36
Hình 4.4. Kết quả sau 24 giờ theo dõi khả năng kháng sâu của các dòng đậu
tương VX93 trong phòng thí nghiệm ở thế hệ T
3

36
Hình 4.5. Kết quả điện di DNA tổng số thế hệ T1
37
Hình 4.6. Kết quả điện di DNA tổng số thế hệ T
2
37
Hình 4.7. Kết quả điện di DNA tổng số thế hệ T
3
38
Hình 4.8. Kết quả PCR gen bar thế hệ T
1
38
Hình 4.10. Kết quả PCR gen bar thế hệ T3
39
Hình 4.11. Kết quả PCR gen cry1Ac thế hệ T
1
40
Hình 4.12. Kết quả PCR gen cry1Ac thế hệ T2
41
Hình 4.13. Kết quả PCR gen cry1Ac thế hệ T
3
41
5

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Bar : Baialaphos resistance
BNN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Bt : Bacillus thuringiensis var. Kurstaki
Cs : Cộng sự

CT : Công thức
CTAB : Cetyl-trimethyl ammonium bromide
Đ/c : Đối chứng
EDTA : Ethyenediamine tetraacetate
Nxb : Nhà xuất bản
FAO : Food and Agriculture oganization of the United Nations
Gus : B-1,4- Glucoronidase
GNA : Galanthus Nivalis Agglutinin
PCR : Polymerase chain reaction
T
0
: Thế hệ cây chuyển gen đầu tiên thu được sau tái sinh (Ví dụ:D35)
T
1
: Thế hệ thứ nhất của cây T
0
(Ví dụ: D35.1; D35.2; D35.3.v.v )
T
2
: Thế hệ thứ hai của cây T
0
(Ví dụ: D35.1.1; D35.2.1;.v.v )

T
3
: Thế hệ thứ ba của cây T
0
(Ví dụ: D35.1.1.2; D35.2.1.1;.v.v )

TB : Trung bình

USD : United states dollar

6

MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 3
2.1.2. Giá trị của cây đậu tương 3
2.1.3. Một số đặc điểm của giống đậu tương VX93 4
2.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam 5
2.2.Ảnh hưởng của cỏ dại và sâu hại đối với quá trình sản xuất đậu tương 7
2.2.1. Ảnh hưởng của cỏ dại 7
2.2.2. Ảnh hưởng của sâu hại 11
2.3. Tình hình sản xuất cây đậu tương đổi gen trên thế giới và Việt Nam 13
2.3.1. Trên thế giới 13
2.3.2. Tại Việt Nam 14
2.4. Tìm hiểu về gen bar (kháng thuốc diệt cỏ) và gen cry1Ac (kháng sâu) 15
2.4.1. Tìm hiểu về gen bar 15
2.4.2. Tìm hiểu về gen kháng sâu cry1Ac 16
2.5. Các phương pháp nghiên cứu, đánh giá, theo dõi sự biểu hiện của gen bar và
gen cry1Ac 19
2.5.1. Trên thế giới 19
2.5.2. Tại Việt Nam 20
PHẦN 3:VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1. Vật liệu nghiên cứu 22
7

3.1.1. Vật liệu thực vật 22
3.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 22
3.2. Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 23
3.2.1. Phạm vi nghiên cứu 23
3.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23
3.3. Nội dung nghiên cứu 23
3.4. Phương pháp nghiên cứu 23
3.4.1. Phương pháp theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu của các
dòng đậu tương VX93 chuyển gen qua các thế hệ T
1
, T
2
, T
3
trên đồng ruộng 23
3.4.2. Phương pháp phát hiện gen bar và gen cry1Ac của một số dòng đậu tương
VX93 chuyển gen ở thế hệ T
1
, T
2
,T
3
bằng kỹ thuật PCR 25
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. KẾT QUẢ 29
4.1.1. Kết quả theo dõi khả năng kháng thuốc trừ cỏ và kháng sâu của một số
dòng đậu tương VX93 chuyển gen ngoài đồng ruộng 29

4.1.2. Kết quả theo dõi hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp sinh học phân tử
37
4.2.2. Kết quả phân tích PCR xác định sự có mặt của gen bar và gen cry1Ac với
cặp mồi đặc hiệu 38
4.2. THẢO LUẬN 42
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Kiến nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45



1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị
kinh tế cao. Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc,
nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Hạt đậu
tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình khoảng từ 35,5-
40%, lipit từ 15- 20%, hydratcacbon từ 15- 16% và nhiều loại sinh tố và muối
khoáng cần thiết cho sự sống [21]. Việc phát triển cây đậu tương là một trong
những biện pháp nhanh chóng khắc phục tình trạng thiếu hụt protein ở các nước
nghèo [3]. Riêng đối với Việt Nam là nước nông nghiệp nhiệt đới trồng đậu tương
với ba mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho người và gia súc, xuất khẩu và
cải tạo đất [10].
Cây đậu tương thuộc nhóm cây dễ mẫn cảm, bên cạnh những yếu tố kĩ thuật
như canh tác thì ảnh hưởng của yếu tố cỏ dại và sâu bệnh là những nguyên nhân
chính làm cho năng suất và sản lượng của đậu tương nước ta còn thấp [10]. Việc
phòng trừ cỏ dại và sâu hại cho đậu tương hiện nay vẫn chủ yếu dựa vào phương

pháp hóa học. Tuy nhiên các biện pháp này thường gây ô nhiễm môi trường, mất
cân bằng sinh thái, ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng. Vì vậy, tạo cây đậu tương
kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu được các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Năm
1996, cây đậu tương mang gen kháng thuốc trừ cỏ và gen kháng sâu đã được nghiên
cứu thành công và đưa vào thực tiễn sản xuất [31].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu khoa học của khoa Công nghệ Sinh học và Công
nghệ thực Phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã chuyển gen thành công
tạo ra các dòng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu từ các giống đậu tương
của Việt Nam [5]. Để kiểm tra sự ổn định về mặt di truyền của cây trồng chuyển
gen cần phải có các quá trình theo dõi kiểm tra. Do vậy tôi đã tiến hành thực hiện
nghiên cứu đề tài với mục đích: “Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ và kháng
sâu của một số dòng đậu tương VX93 chuyển gen ở thế hệ T
1
, T
2
và T
3
”.


2
1.2. Mục đích nghiên cứu
Theo dõi khả năng kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu của một số dòng đậu
tương VX93 chuyển gen ở thế hệ T
1
, T
2
, T
3
.

1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Theo dõi được khả năng kháng thuốc diệt cỏ Basta 0,3% và khả năng kháng
sâu ở một số dòng đậu tương VX93 chuyển gen ở các thế hệ T
1
, T
2
, T
3
.
- Xác định được sự có mặt của gen chuyển ở các thế hệ T
1
, T
2
, T
3
bằng phản
ứng PCR.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học
Theo dõi được sự di truyền ổn định của gen kháng thuốc diệt cỏ và gen kháng
sâu trong một số dòng đậu tương VX93 chuyển gen qua các thế hệ T
1
, T
2
, T
3
. Từ đó
chọn lọc được dòng đậu tương chuyển gen mang đặc tính kháng thuốc diệt cỏ và
kháng sâu mong muốn.
Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo có giá trị cho các nghiên cứu tiếp

theo về phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các cây trồng
chuyển gen.
- Ý nghĩa thực tiễn
Thông qua quá trình theo dõi, chọn lọc được được dòng đậu tương chuyển
gen kháng sâu là cơ sở cho việc ứng dụng cây đậu tương chuyển gen vào thực
tiễn sản xuất.
Giúp sinh viên học tập, rèn luyện các kỹ năng chuyên sâu về sinh học phân tử,
tác phong nghiên cứu, làm việc khoa học, phục vụ cho nghề nghiệp tương lai.
Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đại học.


3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây đậu tương [Glycin max (L.) Merllin] là một trong những loại cây trồng
được biết đến từ rất sớm. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều
công nhận rằng cây đậu tương có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung
Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa và trồng làm cây thực phẩm ở Trung Quốc
vào khoảng thế kỷ XVII trước công nguyên. Từ Trung Quốc, cây đậu tương đã
được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ XVIII, vài thế kỷ sau đó du
nhập vào nhiều nước Châu Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt
Nam,v.v… Cây đậu tương được trồng ở Châu Âu vào thế kỷ XVII và ở Hoa Kỳ vào
thế kỷ XVIII [11].
Về phân loại học, đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ
cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae. Đậu tương có tên khoa học là Glycine
Max (L) Merr.
Có nhiều cách để phân loại đậu tương nhưng cho đến nay, hệ thống phân loại
căn cứ vào đặc đặc điểm về hình thái , phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể vẫn

được nhiều người sử dụng nhất. Hệ thống phân loại này do Hymowit và Newell
(1984) xây dựng. Theo hệ thống này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja.
Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia
ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L) Merr và loài hoang dại hàng năm
G.Soja Sieb và Zucc [6].
2.1.2. Giá trị của cây đậu tương
2.1.2.1. Giá trị về mặt thực phẩm
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình
khoảng từ 38 - 40%, có phẩm chất tốt nhất trong số các protein của thực vật - cao
hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong các đậu đỗ khác;
lipit từ 18 - 20%; giàu nguồn sinh tố và muối khoáng [14].


4
Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được
coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng. Lipit của đậu tương chứa một tỉ lệ cao các axit
béo chưa no (khoảng 60 - 70%) có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm như axit linoleic
chiếm (52 - 65%), oleic (từ 25 - 36%), linolenolic (khoảng 2 - 3%) [4].
Trong hạt đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng của các
vitamin B
1
và B
2
, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C,v.v… và các loại
muối khoáng khác [14].
Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng
tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột. Đậu tương là thức ăn tốt cho người bị bệnh đái
đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suy dinh dưỡng [6].
2.1.2.2. Giá trị về mặt công nghiệp
Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép

dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Đặc điểm của dầu đậu tương là
khô chậm, chỉ số iốt cao, ngưng tụ ở nhiệt độ từ - 15 đến - 18
o
C, từ dầu này người ta có thể
chế ra các sản phẩm công nghiệp khác như nến, xà phòng, nilon, v.v…. Đậu tương còn là
nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in,
chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không,…[6].
2.1.2.3. Giá trị về mặt nông nghiệp
- Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1 kg hạt đậu
tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn bộ các phần của cây đậu
tương đều có hàm lượng đạm khá cao nên có thể làm thức ăn cho gia súc hoặc nghiền khô
làm thức ăn tổng hợp của gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu làm thức ăn
cho gia súc rất tốt vì trong sản phẩm này có chứa thành phần dinh dưỡng khá cao [6].
- Cải tạo đất: Đậu tươg là loại cây ngắn ngày, có khả năng trồng trên nhiều loại đất
khác nhau, nhiều vụ trong năm, có thể luôn canh, xen canh, gối vụ với nhiều loại cây trồng
khác nhau…[14].
2.1.3. Một số đặc điểm của giống đậu tương VX93
- Nguồn gốc: Giống đậu tương VX 93 do TSKH.VS. Trần Đình Long, VS. Đào Thế
Tuấn và A.G.Liakhôpkin Trung tâm hợp tác giống cây trồng Việt Xô - Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo năm 1983 [13].


5
- Phương pháp: Giống đậu tương VX93 được chọn lọc cá thể từ 1 giống nhập nội
của Philippin (giống có mã hiệu K7002 trong tập đoàn của VIR) [13].
Được công nhận giống quốc gia năm 1990 theo Quyết định số 369 NN-KHKT/QĐ
ngày 06 tháng 12 năm 1990 [13].
- Những đặc tính chủ yếu:
+ Thời gian sinh trưởng vụ Xuân và Đông là từ 90 - 95 ngày, vụ Hè ở miền núi từ
100 - 105 ngày.

+ Cây cao trung bình 50 - 55 cm, ít phân cành. Hạt dạng bầu dục, vỏ màu vàng nhạt,
rốn hạt nâu nhạt, khối lượng 1000 hạt đạt từ 140 - 150 gram. Năng suất trung bình từ 12 -
15 tạ/ha, thâm canh cao đạt 20 tạ/ha.
+ Khả năng chịu rét tốt, chịu hạn, úng trung bình, chịu nóng kém. Nhiễm bệnh thán
thư nếu bón phân và chăm sóc không tốt [13].
2.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
2.1.4.1. Trên thế giới
Ở nhiều quốc gia trên thế giới cây đậu tương được xem là một trong những loại cây
trồng chiến lược chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích ứng được với nhiều
điều kiện khí hậu và sinh thái nên cây đậu tương được trồng rộng rãi trên khắp thế giới,
tập trung nhiều tại Châu Mỹ và Châu Á [11]. Theo thống kê của Tổ chức Nông nghiệp và
Lương thực Liên hiệp quốc thì diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới trong những
năm trở lại đây luôn có xu hướng tăng, được thể hiện cụ thể dưới bảng sau.
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới trong giai đoạn 2008 - 2012
Năm
Diện tích
(triệu ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lượng
(triệu tấn)
2008 96,451 23,977 231,257
2009 99,324 22,492 223,401
2010 102,614 25,849 265,249
2011 103,599 25,324 262,352
2012 104,997 23,033 241,841
(Nguồn: FAOSTAT, 2012) [24]


6

Mặc dù diện tích gieo trồng có xu hướng tăng tuy nhiên sản lượng lại có sự
biến động qua các năm. Năm 2008 sản lượng là 231,257 triệu tấn đến 2010 sản
lương đạt 265,249 triệu tấn, sản lượng đậu tương của toàn thế giới trong giai đoạn
này tăng 33,992 triệu tấn. Nhưng đến năm 2012 chỉ đạt 241,841 triệu tấn, giảm
23,408 triệu tấn.
2.1.4.2. Tại Việt Nam
Cây đậu tương là loại cây có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông
nghiệp ở nước ta. Trước cách mạng tháng tám năm 1945 diện tích gieo trồng đậu
tương khoảng 32 ha, năng suất đạt 4,1 tạ/ha. Sau khi đất nước thống nhất diện tích
đậu tương của nước ta đã tăng, năng suất đạt 5,1 tạ/ha. Hiện nay cây đậu tương
được trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp, năm 1997 diện tích gieo trồng ở miền núi
phía Bắc là lớn nhất: 46,6%, đồng bằng sông Hồng: 19,3%, vùng Tây Nguyên:
11%, miền Đông Nam Bộ: 10,2%, đồng bằng sông Cửu Long: 8,9%, khu Bốn:
2,3% và vùng Duyên hải miền Trung: 1,6% [11].
Trong những năm gần đây nhờ những chủ trương phát triển mạnh cây đậu
tương, kết hợp với việc ứng dụng các kỹ thuật phân tích sinh học phân tử và công
nghệ sinh học hiện đại phối hợp với các phương pháp truyền thống đã trở nên có
hiệu quả hơn trong chiến lược chọn tạo giống và phát triển cây đậu tương [10]. Sự
tăng lên về diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương ở nước ta được chứng minh
qua bảng số liệu sau:
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam trong những năm gần đây
Năm
Diện tích
(nghìn ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lượng
(nghìn tấn)
2008 192,10 13,93 267,60
2009 147,00 14,64 215,20

2010 197,80 15,10 298,60
2011 181,39 14,69 266,54
2012 120,75 14,52 175,30
(Nguồn: FAOSTSAT, 2012) [24]


7
2.2.Ảnh hưởng của cỏ dại và sâu hại đối với quá trình sản xuất đậu tương
2.2.1. Ảnh hưởng của cỏ dại
2.2.1.1. Đặc tính của cỏ dại
Cỏ dại là loài thực vật có khả năng thích nghi với điều kiện ngoại cảnh, có tính
chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt của khí hậu và thổ nhưỡng, thường mọc tự
nhiên trên đồng ruộng, vườn tược, ven đường, bãi đất hoang. Cỏ dại có một số đặc
điểm nổi bật có thể phân biệt với cây trồng và thích ứng với nhiều điều kiện khắc
nghiệt của môi trường sống để tồn tại.
Cỏ dại có nhiều hình thức sinh sản cùng với khả năng nhân giống cao. Cỏ dại
có thể ra hoa kết hạt quanh năm, luôn hiện diện trên đồng ruộng với diện tích lớn
gây trở ngại cho các hoạt động sản xuất của con người. Nhiều loài cỏ vừa sinh sản
hữu tính vừa vô tính làm cho khả năng lan truyền càng mạnh và mỗi khi điều kiện
tự nhiên thay đổi thì có ít nhất một hình thức sinh sản để lan truyền về sau [1], [14].
Cỏ dại có khả năng phát tán rộng. phát triển không tập chung vì vậy gây
khó khăn và tốn kém cho công tác phòng trừ. Người ta đã phát hiện có sự xâm
nhập của cỏ dại từ Châu Âu sang Châu Mĩ và ngược lại, từ lục địa Âu, Á sang
Châu Mĩ, Đại Tây Dương và Thái Bình Dương. Do vậy, phải tìm cho được
nguồn gốc của cỏ dại xuất phát từ đâu thì mới có thể đề xuất biện pháp phòng trừ
có hiệu quả [1], [15], [18].
2.2.1.2. Tác hại của cỏ dại đối với cây trồng
Cỏ dại không chỉ gây cản trở hoạt động sản xuất nông nghiệp và làm gia tăng
chi phí sản xuất mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của cộng đồng và gây khó khăn
cho việc bảo trì các công trình xây dựng, nhà cửa, cảnh quan.v.v…

Theo tài liệu của FAO, thiệt hại do cỏ dại gây ra hàng năm trên thế giới có thể
nuôi sống 100 triệu người mỗi năm. Kết quả nghiên cứu của tổ chức môi trường
"Land Care of New Zealand" cho thấy cỏ dại gây ra thiệt hại 95 tỷ đô la Mỹ mỗi
năm do làm giảm sản lượng lương thực thực phẩm trên toàn cầu trong khi bệnh cây,
côn trùng và các động vật có xương sống (không kể con người) gây tổn thất 85,46
và 2,4 tỷ đô la Mĩ. Với thời giá hiện nay, 95 tỷ đô la có thể mua được 380 triệu tấn
lúa mì, hơn phân nửa sản lượng lúa mì toàn thế giới dự kiến đạt được trong năm


8
2009. Trong số 95 tỷ đó thì có khoảng 70 tỷ thiệt hại gây ra ở các nước nghèo [1].
Những sự thiệt hại về kinh tế có thể lớn hơn nữa nếu tính đến khía cạnh là hơn phân
nửa thời gian mà nông dân lao động trên đồng ruộng là dành cho công việc nhổ cỏ.
Cỏ dại tranh chấp các điều kiện sinh sống của cây trồng (ánh sáng, nước, dinh
dưỡng và cardon dioxide) dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng [1]. Một vài loài cỏ
dại có khả năng hạn chế sự cạnh tranh của các loài khác bằng cách tiết ra các hóa
chất độc hại ức chế sự sinh trưởng, phát triển bình thường của các loài thực vật khác
gọi là hiện tượng“allelopathy” (sự cảm nhiễm qua lại). sự sinh trưởng, phát triển
của cây trồng giảm mạnh trong những trường hợp này [15]. Cỏ dại là nơi trú ẩn của
sâu bệnh hại và là nơi trú ẩn của chuột. Các loài cỏ dại cùng họ, bộ với cây trồng là
kí chủ rất tốt của sâu bệnh hại trên những cây trồng tương ứng [14].
Cỏ dại ảnh hưởng đến chất lượng nông sản. Có một số loài cỏ dại nếu gia súc
ăn phải sẽ làm giảm chất lượng sữa và thịt (Parthenium, tỏi dại làm giảm chất lượng
thịt và sữa và có thể làm cho sản phẩm không tiêu thụ được) [14].
2.2.1.3. Biện pháp phòng trừ cỏ dại
Công tác phòng ngừa sự lây lan và xâm nhiễm của cỏ dại có thể được thực
hiện bằng nhiều cách như: Cơ học, hóa học và sinh học.
* Biện pháp cơ học
- Làm cỏ
Biện pháp sử dụng các công cụ thô sơ như cuốc, xẻng, dao, nạo, liềm … đã

được ứng dụng ở các cấp độ khác nhau trong việc kiểm soát cỏ dại. Biện pháp làm
cỏ bằng tay cho hiệu quả trừ cỏ cao và triệt để nhất, hạn chế gây tổn thương đến cây
trồng đồng thời kết hợp với xới xáo, phá váng trong quá trình nhổ cỏ đã tạo điều
kiện cho cây trồng sinh trưởng tốt, do đó năng suất cây trồng cao hơn so với các
biện pháp khác. Làm cỏ bằng tay có nhược điểm là hạn chế về mặt nhân lực, không
loại trừ được các loài cỏ đa niên có thân nằm sâu trong đất, chỉ có khả năng áp dụng
trên đồng ruộng nơi cây trồng được gieo trồng thẳng hàng, bên cạnh đó biện pháp
này dễ gây tổn thương cho cây trồng, đặc biệt là giai đoạn cuối [1], [15].
- Làm đất
Các hoạt động làm đất như cày, bừa, trục, san phẳng mặt ruộng đều trực tiếp
hoặc gián tiếp tiêu diệt cỏ dại đặc biệt là cỏ đa niên [15]. Ưu điểm của làm đất là:


9
tiêu diệt nhanh và triệt để cỏ dại, diệt cỏ an toàn tăng cường sự sinh trưởng của cây
trồng, có thể diệt toàn bộ các loài cỏ dại. Tuy nhiên, không phải lúc nào cũng có thể
tiến hành làm đất kiểm soát cỏ dại được, chẳng hạn như khi cây trồng quá lớn, gieo
trồng không thành hàng lối, cỏ bám cuốn vào cây trồng, đất quá ẩm [1].
- Ngâm nước ruộng
Cho nước ngập ruộng là một biện pháp thường được sử dụng để kiểm soát cỏ
trong ruộng lúa và cỏ đa niên bò. Tuy nhiên phương pháp này không thể áp dụng
được với tất cả các loài cỏ dại sinh sản vô tính vì mầm ngủ của nhiều loài cỏ dại
sống tiềm sinh và vẫn có thể sống sót sau khi bị ngâm ngập trong nước [1].
- Dùng lửa
Việc dùng lửa đề phòng trừ cỏ dại được áp dụng khi trên đồng ruộng không có
cây trồng, lúc khai hoang, lúc làm đất trước khi gieo trồng hoặc trong mùa khô sau
khi đã thu hoạch nông sản để diệt cỏ và sâu bệnh có trong tàn dư cây trồng. Lửa có
thể làm chết các bộ phận trên mặt đất và một phần các cơ quan sinh sản vô tính và
hạt cỏ dại ở trong đất [15].
- Che phủ mặt đất

Che phủ mặt đất bằng các vật liệu khác nhau có tác dụng kiểm soát cỏ dại
thông qua việc ngăn cản không cho ánh sáng lọt xuống mặt đất để hạt và mầm ngủ
của cỏ dại không nảy mầm được, mầm cỏ đã mọc không đủ ánh sáng để lớn lên và
vượt ra khỏi lớp che phủ. Vật liệu che phủ mặt đất có thể là các vật liệu tự nhiên
(rơm rạ, cỏ khô, bọt giấy, mạt cưa …) hay nhân tạo (giấy hay màng phủ polyethen,
plastic màu đen) [15].
* Biện pháp hóa học
- Sử dụng thuốc trừ cỏ
Phương pháp này đem lại hiệu quả cao và tương đối triệt để, nhiều loại thuốc
có phổ tác động rộng, diệt được hầu hết các loại cỏ mà lại an toàn đối với cây trồng.
Đỡ tốn chi phí và công lao động, có thể áp dụng trên diện tích rộng lớn trong một
thời gian ngắn [1], [15].
* Biện pháp sinh học
- Côn trùng diệt cỏ


10
Côn trùng diệt cỏ là tác nhân sinh học được sử dụng rộng rãi để kiểm soát
nhiều loài cỏ nguy hiểm trên thế giới. Thành công đầu tiên của tác nhân sinh học
trong việc diệt trừ cỏ dại đựoc biết đến vào năm 1902 trên cây trâm ổi (ngũ sắc
Lantana camara) tại đảo Hawaii. Các thử nghiệm đã chỉ ra một số loài côn trùng
rất hiệu quả trong việc kiểm soát loài cỏ này, bao gồm: ấu trùng của
Crocidosema lantana (bướm sâu cuốn lá) (đục vào trong cuống hoa, nằm trên đế
của cụm hoa và ăn hoa quả), ấu trùng của ruồi ăn hạt Agromyza lantana ăn quả
và làm cho quả khô để hạn chế chim mang hạt đi phát tán nơi khác, ấu trùng của
bướm Theclaechion và Thecla bazochi phá hủy hoa ngăn không cho cây kết hạt,
giảm khả năng sinh sản [1].
Ở nước ta, Viện BVTV đã tiến hành nhân thả thành công 2 tác nhân sinh học
là sâu đục thân Carmenta mimosa để trừ cây mai dương Mimosa pigra và bọ cánh
cứng Neochetina bruchi để trừ cây lục bình Eichornia crassipes [15].

- Chăn thả gia cầm
Cỏ dại trong vườn cây đa niên có thể được kiểm soát bằng phương pháp thả
nuôi gia cầm. Việc sử dụng 1000 - 1.500 con vịt/ha trong hệ thống canh tác lúa
vịt cho hiệu quả phòng trừ cỏ dại cao hơn so với công thức xử lý thuốc diệt cỏ 2
lần/vụ [1], [15].
- Nấm
Người ta đã phân lập được nhiều loài nấm kí sinh trên cỏ. Cây keo đậu có thể
bị tiêu diệt khi chích dung dịch bào tử nấm Cephalosporious sp., nấm Rhizoctonia
sp. gây cháy lá trên lục bình cũng được nghiên cứu để kiểm soát loài cỏ dại này [1].
- Thuốc diệt cỏ sinh học (bioherbicides)
Thuốc diệt cỏ sinh học thường là vi sinh vật gây bệnh có trong tự nhiên được
phân lập, nuôi cấy và nhân lên với số lượng lớn để áp dụng cho các loài cỏ mà con
người định kiểm sóat [1], [4].
- Trồng cây cạnh tranh
Sử dụng những loài cây trồng nảy mầm nhanh, tán lá phát triển rộng, hiệu
suất quang hợp cao có thể cạnh tranh hiệu quả với cỏ dại, chẳng hạn như cây
đậu bò (cowpea), cỏ linh lăng (Medicago sativa L.), cỏ ba lá Ai Cập (Trifolium
alexandrinum L.) [1], [15].


11
2.2.2. Ảnh hưởng của sâu hại
2.2.2.1. Tác động của sâu hại đến sản xuất nông nghiệp
Sâu hại thường phát triển rất nhanh và gây hại tập chung tạo ra tổn thất lớn
cho sản xuất nông nghiệp. Ước tính trên toàn cầu ~10% sản lượng nông nghiệp
hằng năm bị phá hủy bởi sâu hại mặc dù đã có các biện pháp phòng trừ bảo vệ
thực vật [23]. Đa dạng về chủng loại cùng với số lượng khổng lồ khiến cho công
tác phòng trừ gặp nhiều khó khăn, ước chi phí cho quản lý dịch hại của toàn thế
giới lên tới hàng chục tỷ USD. Chỉ riêng chi phí để kiểm soát các loại sâu bướm
gây hại cho cây trồng đã chiếm khoảng 4 tỷ USD đến 5 tỷ USD [28].

2.2.2.2. Một số loài sâu hại chính trên cây đậu tương
- Sâu cuốn lá (Lamprosema indicate F)
+ Vòng đời:
Vòng đời của sâu trong vụ Đông - Xuân kéo dài 40 ngày.
+ Đặc điểm: Sâu cuốn lá thuộc bộ Lepidoptera. Sâu này là loài đa thực,
gây hại nhiều cây kí chủ của họ đậu đỗ nhưng hại nặng trên đậu đũa, đậu vàng,
đậu trạch, đậu bở…[4].
Sâu cuốn lá đậu thuộc bộ cánh vẩy. Cánh trước hình tam giác, màu vàng
nâu và nâu xám, trên cánh có 3 đường vân đen chạy dọc từ bờ trước ra bờ sau.

Hình 2.1. Vòng đời của sâu cuốn lá đậu tương
a: Sâu trưởng thành, b: Trứng sâu, c: Sâu non, d: Nhộng


12
Cánh sau có màu nhạt hơn, giữa cánh có 2 vệt đậm. Bụng thon nhọn, màu cá
vàng có vân ngang trắng xám [4]. Trứng tròn và rất dẹt, màu trắng vàng, đường
kính khoảng 0,5 mm, có phủ lớp sáp trong. Tổ sâu thường ở các tầng lá phía
trên, mỗi tổ thường có từ 2 - 9 sâu, nhưng có khi chỉ thấy một sâu. Sau khi ăn
hết biểu bì lá trong tổ, sâu chuyển sang lá khác nhả tơ làm tổ mới để sống. Sâu
đẫy sức hóa nhộng ngay trong tổ, đuôi nhộng đính treo vào mặt lá [4]
+ Giai đoạn gây hại: Sâu non cuốn lá đậu ăn chất xanh lá, làm ảnh hưởng đến
quang hợp của cây. Khi sâu phát triển với mật độ cao gây thiệt hại rõ rệt, cây còi cọc,
chậm lớn. Nếu sâu hại vào thời kì ra hoa thì hoa bị rụng sớm, quả ít, năng suất thấp [4].
- Sâu đục quả (Maruca vitrata Geyer)
Hình 2.2. Sâu đục quả đậu tương
+ Đặc điểm: Sâu đục quả thuộc bộ Lepidoptera. Phân bố rộng khắp ở những nơi
trồng đậu ăn quả, đặc biệt là những nơi trồng đậu đũa, đậu xanh, đậu côve, điền thanh [4].
Trứng có hình bầu dục với kích thước là 0,7 x 0,5 mm [4]. Nhộng có kích
thước 13 - 15 x 2,5 mm. Nhộng mới hình thành có màu xanh nhạt, về sau chuyển

thành màu nâu vàng, mép sau các đốt bụng thường có màu sẫm, gai đuôi hơi cong
về phía bụng. Sâu non có 5 tuổi. Sâu non tuổi 1 - 2 sống trong hoa đậu. Từ tuổi 3 trở
đi, sâu non đục vào quả và sống trong quả cho đến khi đẫy sức. Trứng có màu trắng
trong, về sau chuyển sang màu trắng ngà. Sâu non mới nở nhỏ, màu trắng đục, đầu
có màu tối, màu sắc thay đổi tùy thuộc vào môi trường xung quanh. Ở tuổi cuối
cùng khi đẫy sức sâu non có kích thước là 15 - 17 x 3mm. Cơ thể hình trụ tròn 2
đầu thon nhỏ, đầu có màu vàng úa, toàn thân màu trắng ngà. Từ đốt ngực thứ 2 đến
đốt bụng thứ 8 trên mặt lưng có nhiều vết màu nâu sẫm hình chữ nhật. Có 3 đôi


13
chân ngực và 4 đôi chân bụng [4]. Bướm trưởng thành có thân dài 11 - 12 mm. Sải
cánh rộng là 24 - 25mm. Thân có màu vàng xám như đồng hun. Đầu nhọn, mắt kép
màu nâu, gụ, râu hình sợi chỉ. Cánh trước dẹp dài, giữa cánh có nhiều vệt trong suốt
không phủ vẩy. Vệt rộng nhất nằm ở phía ngoài từ mép trước đến giữa cánh, vệt
nhỏ nhất hình tam giác. Cánh con đực nhọn, ít lông. Bụng con cái phía cuối có
nhiều lông màu vàng dài [4].
+ Vòng đời: Kéo dài 19,5 - 50,5 ngày. Ở điều kiện nhiệt độ 17 - 30
o
C, ẩm độ
78 - 83%, thời gian phát dục của trứng là 2,5 - 9 ngày, của sâu non là 9 - 20 ngày,
của nhộng là 6 - 19 ngày. Bướm trưởng thành vũ hóa và hoạt động vào ban đêm.
Thời gian trước đẻ trứng của bướm là 2 - 5 ngày. Trứng được đẻ trên nụ, hoa và búp
non, một con trưởng thành cái đẻ được 45 - 120 quả trứng [4]. Sâu đục quả đậu phát
sinh quanh năm. Mật độ sâu thay đổi tùy thuộc vào thức ăn, thời tiết và kỹ thuật
canh tác. Ở vùng đồng bằng sông Hồng, hàng năm sâu đục quả có mật độ cao nhất
vào thời gian nửa đầu tháng 5, thấp nhất từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau [4].
+ Giai đoạn gây hại: Là giai đoạn sâu non gây hại ở trong quả, chúng ăn hết
các khoang và hạt quả, sau đó chúng lại sang quả khác, làm năng suất giảm [4].
2.3. Tình hình sản xuất cây đậu tương đổi gen trên thế giới và Việt Nam

2.3.1. Trên thế giới
Đậu tương chuyển gen đầu tiên được trồng ở Mỹ, Canada năm 1996, sau 11 năm,
đậu tương chuyển gen đã có mặt tại 10 quốc gia với tổng diện tích trồng lên tới 65,8 triệu
ha, chiếm 53% diện tích đất trồng cây công nghệ sinh học trên toàn thế giới [25]. Trong
năm trở lại đây, diện tích cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng, trong năm thứ 17 với tốc độ
tăng trưởng bền vững của 6% hoặc 10 triệu ha (25 triệu mẫu Anh), đạt 170,300,000 ha hay
420 triệu mẫu Anh. Cây trồng chuyển gen đã thiết lập một tiền lệ trong đó các khu vực
chuyển gen đã phát triển ấn tượng mỗi năm trong 17 năm qua, với gần như một sự gia tăng
gấp 100 lần đáng chú ý kể từ khi bắt đầu thương mại hóa vào năm 1996. Như vậy, cây
trồng chuyển gen được coi là công nghệ cây trồng thông qua nhanh nhất trong lịch sử nông
nghiệp hiện đại. Trong năm 2012, tổng cộng 17,3 triệu nông dân (tăng từ 16,7 triệu trong
năm 2011) đã trồng được loại cây trồng chuyển gen tại 28 quốc gia, trong đó hơn 90% hay
15 triệu người nông dân và nghèo tài nguyên từ các nước đang phát triển. Mức tăng cao
nhất trong bất cứ nước nào, trong sự phát triển diện tích trồng tuyệt đối là Brazil với 6,3
triệu ha và tăng tỷ lệ cao nhất là Nam Phi với một sự gia tăng 26%, đạt 2,9 triệu ha [21].


14
Tóm lại, trong giai đoạn 1996 - 2012, cây trồng chuyển gen đã được trồng
thành công ở diện tích lũy kế của 3530 triệu ha (8,72 tỷ mẫu Anh). Tăng 6,3% về
diện tích, tức 10,3 triệu ha (25 triệu mẫu Anh) giữa năm 2011 và 2012.
Bảng 2.3. Cây trồng chuyển gen trên thế giới từ 2006 đến 2012
Năm Hecta (triệu ha) Mẫu Anh (triệu mẫu Anh)
2006 102,0 250,0
2007 114,3 282,0
2008 125,0 308,8
2009 134,0 335,0
2010 148,0 365,0
2011 160,0 395,0
2012 170,3 420,8

Tổng 1427,3 3531,8
(Nguồn Clive James, 2012) [21]
2.3.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, chuyển gen vào cây đậu tương mới được đưa vào nghiên cứu
dựa trên công nghệ sinh học mấy năm gần đây. Bắt đầu từ những nghiên cứu từ
việc tách dòng gen chịu hạn phục vụ cho công tác chuyển gen của Đinh Thị
Ngọc và cs (2008) [10]. Hiện nay đã có một số thử nghiệm để tối ưu hóa quá
trình tái sinh cũng như chuyển gen của đậu tương.
Bên cạnh đó quá trình chuyển gen cũng được nghiên cứu, theo Trần Thị
Cúc Hòa và cs (2008) [8] đã tiến hành biến nạp gen chỉ thị bar/gus vào 91
giống đậu tương để tìm ra 5 giống có tiềm năng để sử dụng cho chuyển nạp
gen, trong đó có giống đậu tương PC19 đã sử dụng làm giống chuyển gen.
Việc biến nạp vào nốt lá mầm thông qua A.tumefaciens mang vector nhị thể
pZY102/pTF102 chứa gen bar, gen gus A và gen kháng glufosinate. Qua phân
tích Southern Blot các cây T0 cho thấy hiệu quả chuyển nạp gen là 1 - 3%.
Đây là một trong những bước đầu thuận lợi cho các nghiên cứu chuyển gen
hữu dụng vào cây đậu tương ở Việt Nam.


15
Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương
và thu được một số kết quả khả quan.
2.4. Tìm hiểu về gen bar (kháng thuốc diệt cỏ) và gen cry1Ac (kháng sâu)
2.4.1. Tìm hiểu về gen bar
2.4.1.1. Giới thiệu về gen bar
Gen bar - gen kháng thuốc diệt cỏ được phân lập từ hệ DNA của S.
Hygroscopicus [19], gen được nhân dòng thứ cấp trong E.Coli W3110iq sử dụng
vector pUC19. Trong W3110iq, quá trình phiên mã được thực hiện bởi promoter Lac
bị lìm hãm mạnh nhưng có thể cảm ứng với isopropylthiogalactoside. Gen tạo ra bằng

cách nhân dòng thứ cấp vùng BamHI được phân lập ban đầu từ Streptomysete, pBG4,
từ vị trí của BamHI của pUC19 tạo pBG195 và pBG196 W3110iq có hoạt tính kháng
bialaphos yếu khi nó chứa pBG196, tuy nhiên làm tăng mức độ kháng chất không thể
cảm ứng bằng isopropylthiogalactoside. Với W3110iq/ pBG195, hàm lượng kháng
chất có thể cảm ứng từ 0.005 đến hơn 0.05 mg/l [19].
Gen bar (bialaphos resistance) mã hóa phosphinothricin acetyl transferase
(PAT) khử độc phosphinothricin làm cho glutamine synthase (GS) không bị ức chế.
Phosphinothricin là thành phần mang hoạt tính thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate có tên
thương mại là Basta, Liberty, Ignite,…. Phosphinothricin có cấu trúc tương tự
glutamin, cấu trúc này cũng giống như cấu trúc của bialaphos (PPT), một kháng
sinh Streptomyces. Tác động của phosphinothricin là ức chế glutamine synthase
(GS), một enzyme chủ chốt trong quy trình khử độc ammoni hình thành trong quá
trình trao đổi hình thành chất nitơ trong thực vật. Tính kháng glufosinates được thực
hiện thông qua gen mã hóa PAT có nguồn gốc từ các loài xạ khuẩn như
Streptomyces hygroscopicus hay S. Viridochromogen [7]. Khi chuyển loại gen này
vào cây giúp hoạt động trao đổi chất của cây diễn ra bình thường không bị tác động
của nhóm thuốc diệt cỏ trên.
2.4.1.2. Cơ chế hoạt động của gen kháng thuốc diệt cỏ
- Ngăn cản không cho cây hấp thu thuốc diệt cỏ
- Vô hiệu hóa các enzyme kích hoạt của thuốc diệt cỏ
- Ức chế tác động của thuốc trừ cỏ đối với các protein mục tiêu trong cây trồng.
- Kích thích protein mục tiêu kháng lại thuốc trừ cỏ của cây trồng.


16
Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyltransferase
(PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT). Gen bar được tạo
dòng đầu tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus.
Phương pháp đơn giản nhất để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp
trực tiếp. Mô, tế bào hoặc cây chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ

phosphinothricin khác nhau và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối
chứng đặt trên cùng môi trường.
2.4.2. Tìm hiểu về gen kháng sâu cry1Ac
2.4.2.1. Giới thiệu về gen kháng sâu cry1Ac
Các chủng khác nhau thuộc loài Bacillus thuringensis sinh ra hai loại chất độc
chính, đó là chất độc tinh thể (cry) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau (đây
cũng là một trong những dấu hiệu dùng để phân loại các nhóm Bt) và các chất độc
phân giải tế bào (cyt) có tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng cry làm tăng tác dụng của
tinh thể độc.
Nhóm chất độc cyt bao gồm các ngoại độc tố α, β, γ. Nhóm ngoại độc tố β là
loại ngoại độc tố của Bt được nghiên cứu kỹ nhất. Độc tố này có tính bền nhiệt được
tạo ra trước khi tinh thẻ độc hình thành. Ngoại độc tố β có cấu trúc tương tự như
ATP, có tác dụng cạnh tranh với ATP, làm ức chế hoạt động của ARN -
polymerase. Tác dụng của độc tố này còn phụ thuộc vào đối tượng, liều lượng sử
dụng và cách thức gây độc, gây độc qua tiêm cho hiệu quả mạnh hơn là qua đường
tiêu hóa [16].
Nhóm chất độc tinh thể (cry) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau. So với
các nhóm ngoại độc tố khác, tinh thể độc cry được tạo ra với lượng lớn hơn nhiều
và có hiệu quả chính gây độc cho côn trùng. Trong số các nghiên cứu về độc tố cry,
cry1Ac là một trong những protein cry được nghiên cứu kỹ, nổi bật với đặc tính
kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng bộ cánh vẩy, đặc biệt là được sử dụng trong
việc bảo vệ nông nghiệp.
Tinh thể độc cry còn được gọi là nội độc tố δ. Tinh thể là một loại protein có
kích thước khoảng 0,6 x 0,02µm có thể chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào.
Ngoài thành phần protein, tinh thể còn có nhiều nguyên tố khác như Ca, Mg, Fe, Si,
Zn hay Al Tinh thể độc được bắt đầu tạo ra khi khởi đầu quá trình hình thành bào


17
tử, được dần tích lũy từ chính protein trong tế bào có liên hệ mật thiết với màng bào

tử. Khi được kết tinh thành tinh thể có nhiều hình dạng khác nhau: hình thoi, hình
tháp, hình ovan, hình lập phương hoặc có hình dạng không xác định trong đó chủ
yếu là hình thoi. Tinh thể không hòa tan trong nước, hoặc các chất hữu cơ
(chloroform, acetol,…) nhưng có thể hòa tan trong dung dịch kiềm. Tinh thể có thể
ổn định trong các dung dịch có phạm vi pH rộng (4 - 12), có thể bị biến tính trong
acid trichloaxetic, chlorua thủy phân. Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính
chịu nhiệt nhất định (ở 65
0
C có thể giữ được 1 giờ, 80
0
C có thể giữ được 20 phút) [16].
Ngoài δ - endotoxin các tế bào vi khuẩn Bacillus còn có khả năng tổng hợp
những loại protein độc đối với côn trùng ngay trong giai đoạn sinh trưởng dinh
dưỡng của tế bào. Loại protein đó được gọi là protein sinh dưỡng diệt sâu -
Vegetative insecticidal protein (Vip) [2].
Gen ức chế enzyme dịch tiêu hóa: Dịch tiêu hóa của côn trùng có chứa
amylase để tiêu hóa chất bột và protease để tiêu hóa protein. Có những loại gen mã
hóa protein ức chế hoạt tính amylase (AI) và gen mã hóa protein ức chế hoạt tính
trysin (TI). Khi sử dụng những gen này để chuyển vào cây trồng cũng thu được kết
quả tạo ra tính kháng côn trùng ở chúng. Chất ức chế amylase có thể rất độc đối với
côn trùng do khả năng kìm hãm tiêu hóa tinh bột. Trong tự nhiên các chất ức chế
proteinase và α - amylase thường được tạo ra ở các vết thương như một phản ứng tự
vệ của cây chống lại côn trùng [2].
Gen mã hóa lectin (Galanthus Nivalis Agglutinin - GNA): Lectin là một phức
hợp nhiều protein khác nhau về cấu trúc phân tử và đặc tính sinh hóa và tính đặc
hiệu trong liên kết với carbonhydrate. Loại lectin GNA gắn kết mannose được xác
định là độc với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ Homotera, Coleoptera và
Lepidoptera. Năm 1991, gen gna được phân lập, biến đổi và biến nạp vào nhiều loại
cây trồng khác nhau nhằm tạo ra tính ngán ăn đối với côn trùng trích hút. Tác dụng
độc đối với côn trùng của lectin là do chúng có tác dụng tiêu hủy đối với

glycoprotein của đường tiêu hóa [2].
Gen mã hóa chitinase: Chitinase có tác dụng độc đối với côn trùng nếu nó phát
huy được tác dụng phân hủy lớp chitin bảo vệ niêm mạc khi kết hợp với những gen
khác tính kháng côn trùng cùng được cải tiến… [2].


18
Gen mã hóa protein độc tố: Từ những năm 1930 các nhà khoa học Đức đã
phát hiện ra loài vi khuẩn Bacillus thuringensis. Có khả năng tạo ra một loại protein
độc dạng tinh thể gọi là δ - endotoxin có thể giết chết nhiều loại côn trùng khi tế bào
vi khuẩn tạo bào tử. Tới nay có đến 6000 chủng Bt đã được phân lập và hàng trăm
dạng khác nhau của độc tố được phát hiện [2].
Vi khuẩn Bacillus được dùng trong thuốc trừ sâu sinh học trên hầu hết các
quốc gia. Bước tiến mới của công nghệ sinh học là chuyển trực tiếp gen cry vào
cây trồng để chúng tự sản xuất ra độc tố. Khi biểu hiện được gen độc tố của Bt trong
cây trồng thì có nghĩa là đã chuyển được tính kháng sâu cho chúng. Tuy nhiên gen
cry dùng cho cây thường là gen đã được thay đổi mã di truyền để cho chúng hoạt
động biểu hiện tốt trong thực vật. Để có hiệu quả các gen này cần được biểu hiện
trong bộ phận của cây mà côn trùng (sâu non và bọ trĩ trưởng thành) ưa ăn [2].
2.4.2.2. Cơ chế hoạt động của gen kháng sâu cry1Ac
Vi khuẩn Bt gây độc cho côn trùng qua con đường tiêu hóa. Bào tử nảy mầm
dẫn đến sự sinh sản của vi khuẩn trong cơ thể vật chủ làm cho côn trùng chết, song
yếu tố chính làm cho côn trùng chết nhanh chóng lại là chất độc do vi khuẩn sinh ra
[11]. Các chất ức chế tác dụng lên bộ phận tiêu hóa. Trong điều kiện bình thường
tinh thể độc không hòa tan. Khi đi vào ruột giữa của sâu, nơi có pH kiềm cao (>9,5)
làm cho tinh thể độc tan ra. Độc tố Bt gắn vào glycoprotein niêm mạc ruột, khi được
hoạt hóa các protein tinh thể độc này có ái lực với các chất nhận glycoprotein tại
những vị trí đặc hiệu trên màng của vi nhung mao trên tế bào biểu mô ruột giữa ấu
trùng sâu. Sau đó, đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng, làm mất cân bằng ion
nội bào của tế bào biểu mô và làm cho chúng bị phân giải, đặc biệt là đoạn ruột giữa

làm cho ruột bị thủng, rò rỉ dịch tiêu hóa vào đường máu gây nên hiện tượng bị
loãng dịch tiêu hóa và nhiễm trùng máu ở côn trùng [2]. Ngoài ra, khi gắn vào niêm
mạc ruột tác động của độc tố Bt còn làm cho pH trong ruột bị giảm xuống bằng với
pH nội môi trong huyết tương. Độ pH thấp này cho phép các bào tử nảy mầm, xâm
chiếm vật chủ và cuối cùng là gây chết [16].