Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) in vtro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




ĐINH TRUNG DŨNG


Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI LAN HỒ ĐIỆP
(Phalaenopsis sp.) IN VTRO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm
Khóa học : 2010 - 2014



Thái Nguyên, năm 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



ĐINH TRUNG DŨNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI LAN HỒ ĐIỆP
(Phalaenopsis sp.) IN VTRO


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm
Khóa học : 2010 - 2014
Người hướng dẫn:
1. ThS. Vi Đại Lâm
(Giảng viên Khoa CNSH - CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên)
2. ThS. Đào Duy Hưng
(Bộ môn công nghệ tế bào, Viện khoa học sự sống)

Thái Nguyên, năm 2014
LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành
đến Ban lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và
toàn thể các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm
đã tạo điều kiện, giúp đỡ để em có thể thực hiện được đề tài này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo Vi Đại Lâm và Th.S
Đào Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề
tài. Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh, chị Bộ môn

Công nghệ Tế bào đã giúp đỡ cung cấp cho em những nguồn tư liệu hết sức
quý báu.
Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn đã luôn
động viên và giúp đỡ tạo điều kiện cho em về cả vật chất lẫn tinh thần trong
thời gian qua.
Trong quá trinh hoàn thành khóa luận em đã có nhiều cố gắng. Tuy
nhiên, khóa luận này không thể tránh khỏi những thiếu sót vì vậy em kính
mong nhận được sự chỉ bảo, góp ý từ phía quý thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 6 tháng 6 năm 2014
Sinh viên



Đinh Trung Dũng


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của cà rốt đến khả năng nhân nhanh của lan Hồ Điệp 24
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh lan Hồ điệp 25
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của khoai tây đến khả năng nhân nhanh lan Hồ Điệp 27
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của VTM B1 đến khả năng nhân nhanh lan Hồ điệp 29
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của VTM B5 đến khả năng nhân nhanh của lan Hồ Điệp . 30
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của VTM B6 đến khả năng nhân nhanh lan Hồ Điệp 32
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hóa tế bào 11
Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phản phân hóa tế bào 11

Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của cà rốt đến khả năng nhân nhanh
lan hồ điệp 24
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân
nhanh lan Hồ Điệp 26
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của khoai tây đến khả năng nhân
nhanh lan Hồ Điệp. 27
Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của Vitamin B1 đến khả năng nhân
nhanh lan Hồ Điệp 29
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của VTM B5 đến khả năng nhân
nhanh lan Hồ Điệp 31
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của VTM B6 đến khả năng nhân
nhanh lan Hồ Điệp 32

DANH CỤM TỪ VIẾT TẮT

ĐC : Đối chứng
CT : Công thức
Kinetin : furfurylaminopurine
IAA : Indole-3-acetic acid
MS : Murachinge and Skoog
NAA : Naphthaleneacetic acid
IBA : Indole-3-butyric acid
GA
3
: Gibberellin
VTM : Vitamin
TB : Trung bình

MỤC LỤC

Trang
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích của đề tài 2
1.3. Yêu cầu của đề tài 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu chung về cây lan Hồ Điệp 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
3
2.1.2. Đặc điểm thực vật họ lan Hồ Điệp
3
2.1.3. Phân bố và sinh thái
5
2.1.4. Các phương pháp nhân giống Lan Hồ Điệp
7
2.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 8
2.2.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
8
2.2.2.
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
10
2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
12
2.3. Tình hình nghiên cứu lan Hồ Điệp trên thế giới và Việt Nam 18
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
18
2.3.2. Tình hình nghiên cứu lan Hồ Điệp ở Việt Nam
19
PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1. Đối tượng nghiên cứu 20
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20
3.3. Nội dung nghiên cứu 20
3.4. Phương pháp nghiên cứu 20
3.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng một số chất dinh dưỡng (nước
dừa, khoai tây, cà rốt) trong giai đoạn nhân nhanh
21
3.4.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số VTM (B1, B5, B6)
đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hồ Điệp
22
3.4.3. Các Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá và thu thập số liệu sau 60 ngày nuôi cấy
23
3.5. Xử lý số liệu 23
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cà rốt đến khả năng nhân nhanh
của lan Hồ Điệp 24
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân
nhanh của lan Hồ điệp 25
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của khoai tây đến khả năng nhân nhanh
lan Hồ Điệp 27
4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của VTM B1 đến khả năng nhân nhanh
của lan Hồ điệp 29
4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của VTM B5 đến khả năng nhân nhanh
của lan Hồ Điệp 30
4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của VTM B6 đến khả năng nhân nhanh
lan Hồ Điệp 32
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
5.1. Kết luận 34
5.2. Kiến nghị 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Trong thế giới các loài hoa, hoa lan là một trong những loài hoa đẹp
nhất. Hoa lan được coi là loài hoa tinh khiết, hoa vương giả cao sang, vua của
các loài hoa [13]. Hoa lan không chỉ là một loài hoa có vẻ đẹp rực rỡ về màu
sắc, mà còn đẹp về cả hình dáng, đường nét của cánh hoa tao nhã, đến những
hình dạng thân, lá cành duyên dáng, ít có hoa nào sánh nổi. Hơn nữa, hoa lan
là một loài hoa đẹp có giá trị kinh tế văn hóa cao và được rất nhiều người ưa
chuộng. Chính vì thế, hoa lan không chỉ chiếm ưu thế trong đời sống tinh thần
của con người mà chúng còn trở thành một mặt hàng mang lại nguồn thu lớn.
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của kinh tế, xã hội, nhu cầu sử dụng hoa
nói chung và hoa lan nói riêng ở Việt Nam cũng tăng nhanh. Hoa không chỉ
dùng trong những dịp lễ tết mà nhu cầu về hoa trong cuộc sống thường ngày
của người dân cũng rất lớn. Bên cạnh yêu cầu về số lượng thì chất lượng hoa
cũng đòi hỏi ngày càng cao. Hoa lan trên thị trường Việt Nam hiện nay chủ
yếu là được nhập về từ Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc… Điều đó cho thấy,
sản xuất hoa lan ở Việt Nam chưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường. Cụ
thể là: chủng loại chưa đa dạng, kỹ thuật trồng hoa còn yếu nên năng suất và
chất lượng chưa cao.
Lan Hồ Điệp (phalaenopsis sp) là một trong những loại lan được trồng
phổ biến trên thế giới. Hồ Điệp được mệnh danh là hoàng hậu của các loài

phong lan. Đây là loài lan có hoa to, thời gian ra hoa kéo dài 2 - 3 tháng, hình
dáng đẹp, màu sắc phong phú, hoa rất bền, cho hoa quanh năm. Mấy năm gần
đây, thị trường hoa lan Hồ Điệp có sức tiêu thụ lớn hơn bất kỳ một loại hoa
nào khác và được bán với giá cao nhưng không đáp ứng được nhu cầu của thị
trường. Mặt khác, trong quá trình nuôi trồng thử nghiệm, lan Hồ điệp có khả
năng thích nghi cao với điều kiện khí hậu Miền Bắc nước ta, có khả năng phát
triển trên quy mô công nghiệp và cho hiệu quả kinh tế cao [10]. Tuy nhiên,
thực tế sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam nói chung còn gặp nhiều khó khăn
do thiếu giống tốt, kỹ thuật chưa đồng bộ, cơ sở vật chất nghèo nàn… hơn

2
nữa, các địa điểm sản xuất hoa còn manh mún, lẻ tẻ, số lượng và chất lượng
hoa chưa đáp ứng được nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, cũng như góp phần phát triển ngành nuôi
trồng lan, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘‘Nghiên cứu ảnh hưởng của
một số yếu tố đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.)
in vtro”.
1.2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh của lan Hồ Điệp bằng phương pháp
nuôi cấy mô tế bào.
1.3. Yêu cầu của đề tài
Xác định được ảnh hưởng của một số chất dinh dưỡng (nước dừa,
khoai tây, cà rốt) đến khả năng nhân nhanh lan Hồ Điệp.
Xác định được ảnh hưởng của một số VTM (B1, B5, B6) đến khả năng
nhân nhanh lan Hồ Điệp.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học:
+ Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào xác định môi trường thích
hợp nhất cho quá trình nhân nhanh của lan Hồ Điệp.
+ Kết quả thực hiện đề tài cung cấp các dẫn liệu góp phần hoàn

thiện quy trình sản xuất lan Hồ Điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thực vật.
- Ý nghĩa thực tiễn:
Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào,
làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu
cung cấp giống lan Hồ Điệp ra thị trường.



3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về cây lan Hồ Điệp
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
2.1.1.1. Nguồn gốc
Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius
đặt tên là Angraecum album. Năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum
amabile; và năm 1825 Blume một nhà thực vật Hà Lan định danh một lần nữa
là Phalaenopsis amabilis và tên đó được dùng cho đến ngày nay.Tên gọi này
bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “con bướm” và
Opsis có nghĩa là “giống như”. Lan Hồ Điệp là loài lan có hoa giống bươm
bướm phất phơ rất đẹp [24].
Hồ Điệp các giống nguyên thủy được tìm thấy trong khu vực nhiệt đới
của châu Á và các quần đảo thuộc Thái Bình Dương; Ranh giới phân bố phía
tây ở Sli Lanka và Nam Ấn; Phía bắc là Vân Nam Trung Quốc, Đài Loan;
Phía nam là vùng Bắc Australia [24].
2.1.1.2. Phân loại khoa học.
Theo hệ thống thực vật học mới nhất về cây hoa Lan được phân loại
như sau [9]:

Giới Plantae
Ngành Magnoliophyta
Lớp Liliopsida
Phân lớp Liliidae
Bộ Orchidales
Họ Orchidaceae
Chi Phalaenopsis
Loài Phalaenopsis sp
2.1.2. Đặc điểm thực vật họ lan Hồ Điệp
- Rễ
Hệ rễ có dạng tròn, to mập, có nhánh hoặc không phân nhánh, rễ thường
có màu trắng, màu rễ có màu xanh, màu vàng trắng hoặc màu đỏ tối, rễ của

4
lan Hồ điệp thường mọc tràn ra ngoài chậu, buông lơ lửng ra không khí, có
lợi cho việc hút Oxy và nước, một số nghiên cứu cho rằng rễ của Lan Hồ
Điệp còn có khả năng quang hợp [10].
- Thân
Lan Hồ Điệp thuộc loại Lan đơn thân, tức là thân của nó rất ngắn không
có giả hành, cũng không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt, Lan đơn thân sinh trưởng
rất chậm, thân chính trong môi trường thuận lợi hàng năm lại mọc ra lá mới,
chúng mọc theo phương thẳng đứng, còn cành hoa thì mọc ở rìa thân hoặc
nảy ra từ nách lá, cây Lan Hồ Điệp rất khó ra chồi nhánh, nên không dùng
phương pháp tách cây để nhân giống. Thân ngoài tác dụng giữ cho cây thẳng
đứng, còn có chức năng tích trữ chất dinh dưỡng và nước cho cây [10].
- Lá
Lá của Hồ Điệp to dầy, đầy đặn và mọc đối xứng, ôm lấy thân cây. Số lá
trên cây không nhiều, thường một cây trưởng thành có từ 4 lá trở lên, màu sắc
lá gồm 3 loại: lá màu xanh, mặt trên lá và mặt dưới lá màu đỏ tía, mặt trên của
lá đốm và mặt dưới lá màu đỏ tía. Căn cứ vào màu sắc của lá có thể phân biệt

màu sắc của hoa. Mặt trên của lá không có khí khổng, chỉ có mặt dưới của lá
mới có khí khổng. Lan Hồ Điệp là loại thực vật CAM đây là lý do khiến cho
Lan Hồ Điệp không có giả hành nhưng lại có khả năng chịu hạn tốt [10].
- Hoa
Cành hoa của Lan Hồ Điệp mọc ra từ nách lá, thường mọc ra từ nách lá
thứ 3 hoặc thứ 4. Các cành có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh tùy
theo giống. Để đánh giá và thưởng thức hoa người ta thường dùng hai khái
niệm “hoa đều đặn” hoặc “cực kỳ đều đặn” để hình dung hoa. Hoa đều đặn là
chỉ hoa có cánh hoa to rộng, giữa các cánh hoa không có khe hở hoặc khe hở
rất nhỏ, cánh môi trải xuống tạo dáng hình elip, tất cả bông hoa tạo nên dáng
hình tròn, còn cực kỳ đều đặn là chỉ hoa có dáng rất tròn, các bên và cánh hoa
đều chồng khít lên nhau, không có khe hở. Nếu giữa các cánh hoa có các khe
hở hoặc khe hở khá lớn thì xếp vào “ hoa không đều đặn” [10].
- Quả và hạt
Hoa Lan Hồ Điệp chỉ tạo quả qua thụ phấn nhân tạo hoặc thụ phấn nhờ
côn trùng. Vỏ quả có hình que, phát triển chậm, thường phải qua 4 tháng mới

5
chín và tách vỏ. Số lượng hạt trong một quả khác nhau do sự khác nhau về
cây bố, mẹ đem thụ phấn. Những hạt của chúng thường rất nhỏ, có dạng bột,
không có phôi nhũ, trong điều kiện tự nhiên rất khó tự nảy mầm thành cây
con, thường phải gieo hạt trong môi trường vô trùng thích hợp mới có thể thu
được cây con với số lượng lớn [9].
2.1.3. Phân bố và sinh thái
2.1.3.1. Phân bố
Qua lịch sử biến đổi, cho đến ngày nay người ta đã biết họ lan đã có một
số lượng lớn loài rất lớn khoảng 15.000 - 35.000 loài phân bố chủ yếu ở 68
0

vĩ bắc đến 56

0
vĩ nam. Tuy nhiên, phân bố chính của họ này là ở trên các vĩ
độ nhiệt đới, đặc biệt là Châu Mỹ và Đông Nam Á. Ngay ở vùng nhiệt đới, họ
lan cũng phân bố rộng khắp từ vùng đầm lầy, sát hồ, biển qua các đồi núi thấp
đến các đồi núi cao. Theo Briger (1971), vùng Bắc bán cầu có 75 chi và 900
loài, vùng Nam bán cầu có 40 chi và 500 loài, toàn Châu Âu có 120 loài, Bắc
Mỹ có 170 loài [13].
Họ lan phân bố nhiều nhất ở vùng nhiệt đới với 250 chi và 680 loài. Các
chi đặc sản ở Châu Mỹ gồm: Cattleya (60 loài), Epiddenrrum (500
loài),Odontoglossum (200 loài). ở vùng ôn hòa, số lượng giảm xuống một
cách rất nhanh chóng và rõ rệt. Bắc bán cầu có 75 chi và 900 loài, Nam bán
cầu có khoảng 40 chi và 500 loài. Khảo sát sơ bộ ở Việt Nam, chi
Dendrobium có khoảng 89 loài, Paphiopedium có 25 loài, Aerides có 5 loài,
chi Cymbidium có 20 loài, chi Phalaenopsis có 7 - 8 loài… [9].
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu và vị trí thuận lợi cho sự phát triển
của nhiều loài lan, Trong những năm qua, chúng ta đã nhận được khá nhiều
loài tốt trong các giống lan nhiệt đới và xứ lạnh: Phalaenopsis, Cattleya,
Đẻnobium, Vanda, Miltonia, Odontoglossum, Epidendrum và Cymbidium.
Trong số các giống này, có nhiều loài rất đẹp và được thế giới ưa chuộng.
2.1.3.2. Sinh thái
- Nhiệt độ
Lan Hồ Điệp là loại Lan có thể phát triển ở nhiệt độ tối thiểu 22
o
C -
25
o
C ban ngày và 18
o
C vào ban đêm. Nhiệt độ lý tưởng để cây phát triển tốt
là 25

o
C - 27
o
C. Giai đoạn ươm cây thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 23
0
C.

6
Giai đoạn phân hóa hoa đòi hỏi phải có sự cách biệt khá cao về độ chênh lệch
nhiệt độ ngày/đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là 25
0
C, ban đêm là
18
0
C - 20
0
C, kéo dài 3- 6 tuần rất có lợi cho sự phân hóa của hoa [10].
Lan Hồ Điệp không chịu được điều kiện quá nóng hay quá lạnh, lại
không cần nhiều ánh sánh cho nên thích hợp trồng trong nhà hay trong nhà
kính. Khi cây đang ra nụ, nhiệt độ hay độ ẩm thay đổi bất thường sẽ làm cho
nụ hoa héo rụng [10].
- Độ ẩm
Lan Hồ Điệp chịu ẩm cao, cần ẩm độ 50 - 80 % nhưng không chịu nhiều
nước. Giàn che lan cần phải thích hợp che được 70% nắng. Lan Hồ Điệp cần
nhiều ẩm hơn nước tưới.
- Ánh sáng
Lan Hồ Điệp cần ánh sáng yếu vì đây là loài ưa bóng mát, biên độ khá
rộng 5000 - 15000m/m
2
, ánh sáng chỉ cần 20% - 30% là đủ. Tuy nhiên

không trồng Lan Hồ Điệp ở nơi quá râm mát vì ánh sáng rất cần cho sự sinh
trưởng và trổ hoa. Ánh sáng khuếch tán vừa phải rất tốt; nếu chiếu sáng
được 12h - 16h mỗi ngày, 12h cho cây lớn và 16h cho cây nhỏ thì cây sẽ
phát triển tốt hơn.
Trồng Hồ Điệp trong nhà kính cần có hệ thống làm mát, ánh sáng nhân
tạo thích hợp để lan phát triển tốt; còn trồng trong nhà thì cần để lan ở gần
cửa sổ có ánh nắng hoặc không cũng được [10].
- Độ thông thoáng
So với các loài Lan khác, sự thông thoáng rất cần thiết cho lan Hồ Điệp.
Lan Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phỏng lá), sự thông thoáng giúp lá cây
mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều.
Ở nước ta vào mùa mưa Lan Hồ Điệp tăng trưởng mạnh, nhưng những giọt
mưa nặng hạt có thể làm thối đọt cây; do đó để ngăn ngừa tình trạng trên lan
cần phải được che chắn cẩn thận. Cần cung cấp đủ nước cho cây tránh sự héo
rũ, nhăn lá vào mùa gió nhiều và mùa nắng [10].
- Nhu cầu nước tưới
Lan Hồ điệp là cây đơn thân nên không có giả hành để dự trữ dinh
dưỡng và nước, hơn nữa nước thường tập trung ở lá vì lan Hồ Điệp có lá lớn,

7
diện tích tiếp xúc nhiều nên rất dễ thoát hơi nước và chúng không có mùa
nghỉ vì thế phải cung cấp cho cây một lượng nước đầy đủ.
Tránh để Lan quá khô vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày: sáng, trưa,
chiều. Chú ý khi tưới nước vào buổi trưa phải tưới thật đẫm để tránh nắng sẽ
làm sốc cây Lan. Mùa mưa thì tuỳ theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho
phù hợp, có thể khoảng 10 ngày tưới một lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá
cây sẽ khô, tránh nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị thối và cây sẽ chết [8].
- Dinh dưỡng
Lan Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có
mùa nghỉ. Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao và đừng tưới lên

ngọn cây, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Tùy từng độ tuổi
của cây mà ta có lượng phân cần bón với tỷ lệ NPK thích hợp. Ngoài việc
dùng phân vô cơ, ta còn có thể tưới xen kẽ thêm phân hữu cơ với nồng độ
loãng có pha thêm thuốc trừ nấm.
Lan Hồ Điệp cần bón phân với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần
trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu, vitamin B1 kích
thích ra rễ Các chất dinh dưỡng cần thiết nhất là Đạm (N), Lân (P), Kali (K)
và Canxi (Ca). Sự thiếu các chất dinh dưỡng này có thể làm ảnh hưởng đến sự
tăng trưởng, phát triển và làm giảm năng suất hoa [10].
2.1.4. Các phương pháp nhân giống Lan Hồ Điệp
- Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt
Do hạt lan nảy mầm hết sức khó khăn nên phương pháp này ít được áp
dụng cả trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này chỉ sử dụng chủ
yếu trong việc lai tạo, nhằm chọn tạo ra những giống mới có nhiều đặc tính
mong muốn của con người.
Với mong ước tạo ra những cây lan lai từ các cây tự nhiên của địa
phương từ năm 1990, nhóm cán bộ kỹ thuật của Đà Lạt đã bắt đầu thực hiện
các phép lai đầu tiên trên cơ sở chon lọc những cây bố mẹ mang các đặc tính
ưu việt. Kết quả là đã thành công 2 cặp lai:
Renanthera evrarfiiGuillaum x Renathera imschootiana Rofle
Renanthera evrarfiiGuillaum x Vada denisonia Bens.et Rchb.f.
- Nhân giống bằng phương pháp tách chiết

8
Đây là phương pháp đơn giản dễ làm không tốn kém nhưng hệ số nhân
giống không cao. Theo Việt Chương, Nguyễn Việt Thái (2002), thời điểm tốt
nhất cho việc tách chiết là vào đầu tháng mùa mưa, khí trời mát mẻ cây đang
đà phát triển [14].
- Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
Với công nghệ nuôi cấy in vitro, trong thời gian ngắn có thể sản xuất một

số lượng lớn các cây giống khỏe, đồng đều và sạch bệnh. Theo PGS. TS.
Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2005) [10], cây hoa lan dễ nhân trong ống
nghiệm và có hệ số nhân giống cao. Cùng với trường Đại học Nông nghiệp I,
Trung tâm Hoa cây cảnh kết hợp với Bộ môn Nuôi cấy mô tế bào của viện Di
truyền Nông Nghiệp đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết
sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh và khả năng ra rễ của chồi. Kết quả đã
đưa ra được quy trình nhân giống lan Hồ Điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô
tế bào. Tác giả Hoàng Ngọc Thuận và cộng sự (2007) cho rằng: ngày nay, việc
nhân giống lan bằng hạt trong môi trường in vitro khá phổ biến ở nhiều phòng
thí nghiệm của Việt Nam với các ưu điểm sau: thời gian cho cây con nhanh, hệ
số nhân giống cao, giá thành giống hạ, cây sinh trưởng nhanh… [15].
2.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề
xướng thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều
đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hoá đều mang các thông tin
di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những
đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” [3].
Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một
tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển
thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy tế bào đã phân
lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông
cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm như:
Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công [20].
Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp
lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây

9
hoà thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh

trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại,
mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới [21].
Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào
thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi
trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men.
Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các
vitamin nhóm B (B1, B3, B6) [22].
Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được
sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van
Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến
sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà [31]. Cũng trong thời gian này,
nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin như NAA, 2,4-D
đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA
đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật mà
trước đó rất khó nuôi cấy [4].
Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào
môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có
tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt [20]. Một năm sau, Skoog
và cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine
và đặt tên là kinetin. Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác
dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với Kinetin gọi chung
là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là
zeatin có trong mầm ngô. Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân
chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt
đã phơi khô [22].
Trong khoảng thời gian từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn
được phát triển và hoàn thiện dần. Năm 1956, Nickell đã duy trì được sự sinh
trưởng liên tục huyền phù cây đậu trắng. Melcher và Beckman đã nuôi các tế
bào đơn trong các bình dung tích lớn có xục khí và bổ sung chất dinh dưỡng
định kỳ.

10
Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các
protocorm từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có
thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh. Cùng năm đó,
Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần
(protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym
xenlulaza. Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy
túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội thành
công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng
góp rất lớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống [6].
Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng
của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và
Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được
xenlulozơ. Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast
của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai
xa ở thực vật [6].
Ngày nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong
nhân giống nhiều loại thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào
cây trồng
2.2.2.
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
* Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào
Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến
hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng.
Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy,
mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình
phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ
chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp

điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một
cơ thể hoàn chỉnh.
Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham. Unio) đã thành công khi thực
nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế

11
bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô
tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [6].
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã
hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh
từ một tế bào riêng rẽ.
* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Ví dụ:
Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm
nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng.
Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:


Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hóa tế bào
Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng
vẫn không mất đi khả năng phân chia của mình. Trong điều kiện thích hợp,
các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá
trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào (ngược lại với quá trình phân hoá tế
bào). Sơ đồ hoá như sau:

Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phản phân hóa tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,
phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hoá (mà trước đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạng thái
mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào.

Tế bào phôi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chuyên hoá


Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
Phân hoá tế bào


12
Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các
tế bào xung quanh. Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho các gen được
hoạt hoá. Quá trình phân hoá được xảy ra theo một chương trình định sẵn [6].
2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.3.1. Lựa chọn mẫu cấy
Việc lựa chọn mẫu nuôi cấy có ý nghĩa rất lớn đến sự sinh trưởng, phát
triển của mẫu trong suốt quá trình nuôi cấy. Nên việc lựa chọn mẫu cấy cần
phải thực hiện một cách thận trọng để có kết quả nuôi cấy tốt nhất.
Tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các

cấu trúc mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình
thái khác nhau. Mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường
nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra
mô non trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm
bệnh ít hơn [6].
Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỷ lệ sống càng thấp và các mô có
nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc
từ chồi nách [20].
2.2.3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô tế bào có thành phần thay đổi tuỳ theo loài
thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô,
cơ quan nhưng mục đích nuôi cây không giống nhau, môi trường sử dụng
cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn
sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [6].
Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần
thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường
của cây.
Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự
thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật
liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt
đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối
tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.

13
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng
cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất
phổ biến như MS. Ví dụ, môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962) là môi
trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi
trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm. Hay môi trường

Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương,
được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần.
Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng
đều gồm một số thành phần cơ bản sau [1]:
+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
+ Nguồn cacbon.
+ Các Vitamin và aminoacid.
+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường.
+ Các chất điều hòa sinh trưởng.
* Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan
trọng. Ví dụ, magie là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế
bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, Amino axit và protein. Ngoài
ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số
enzym cần thiết cho hoạt động sống của tế bào.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi
cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym.
Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi
trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật. Ví dụ: K, Ca rất quan
trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào.
- Các nguyên tố khoáng đa lượng:
Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức
là trên 30mg/l. Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg và Ca. Riêng Na và Cl
cũng được sử dụng trong một vài môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng.
+ Nitơ (N): Được sử dụng ở hai dạng NO
3
-
và NH
4
+

riêng rẽ hoặc phối
hợp với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành

14
ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR). Ammonium được tế
bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như
amino acid. Điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì
sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Nguyên nhân chính
là do quá trình trao đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi
độ pH của môi trường. Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat và
ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây
đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp.
+ Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO
4
-2
. Các dạng ion khác
như SO
3
hoặc SO
2
thường kém tác dụng, thậm chí còn độc.
+ Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho
rất cao. Phospho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid
nucleic. Ngoài ra khi phospho ở dạng H
2
PO
4
-
và HPO
4

-2
còn có tác dụng như
một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình
nuôi cấy.
- Các nguyên tố vi lượng:
Là những nguyên tố được sử dụng ở nông độ thấp hơn 30 ppm. Đó là
Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co.
+ Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thường tạo
phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp
này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế
bào. Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrat hoặc với ETDA
(Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). Từ các phức chất này Fe được giải phóng
ra trong một phạm vi pH khá rộng.
+ Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự
do và DNA tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn
đến kém phân bào.
+ Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây lên biểu hiện như thừa Auxin
vì thực chất B làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô
nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng
nước, kém tái sinh [1].

15
* Nguồn cacbon
Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu trong bất
kỳ môi trường dinh dưỡng nào. Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp
năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu
của môi trường [4].
Loại đường được sử dụng phổ biến là saccarozơ với hàm lượng từ 2-
6% (W/v). Những loại đường khác như: fructozơ, glucozơ, maltozơ,
rafinozơ chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt. Trong nuôi cấy chồi cây

dâu tằm (mulberry bud), môi trường có fructozơ cho kết quả tốt hơn những
loại đường khác [6].
* Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in
vitro ở các loài khác nhau là khác nhau.
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
Vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh
trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại Vitamin
và amino axít. Trong các loại Vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất
cho sự phát triển của thực vật. Axit nicotinic (B3) và Pyridoxune (B6) cũng có
thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô.
* Các chất bổ sung
Nước dừa: Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô
thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1944) [17]. Sau đó, tác
dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã
được nhiều tác giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp
chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [18].
Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở
nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc
sau bảo quản. Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các
protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh.
Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của
mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quản
lạnh. Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn.

16
Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích
thích phân hóa và nhân nhanh chồi.
Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát
triển của mô và tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong

nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp.
Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1 - 1%)
hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (xanh) nhằm tăng
cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy.
Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để
làm rắn hoá môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 - 1%, đây là loại
tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường
hoặc bị chết vì thiếu O
2
nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [1].
* Các chất điều tiết sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng không thể thiếu trong các quá trình nuôi
cấy mô thực vật là các chất thuộc hai nhóm Auxin và Cytokinin.
Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng
của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế
ngọn [24]. Các chất thuộc nhóm Auxin thường được sử dụng là: NAA, IAA
và 2,4D. Trong đó, IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và
điều khiển sự hình thành rễ. NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và
mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của
nitơ [2]. Tuy nhiên, nồng độ quá cao của Auxin đôi khi cũng kìm hãm sự phát
triển của rễ. Mặt khác, một số loài như đậu, cà chua, có khả năng tạo rễ
trong môi trường không có Auxin. Còn 2,4D được sử dụng có hiệu quả với
mục đích tạo mô sẹo ở thực vật và không dùng trong môi trường tái sinh cơ
quan [4],[19].
Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân
chia tế bào, biệt hoá chồi và có tác dụng rõ rệt đối với sự phát triển chồi từ mô
sẹo nuôi cấy. Các cytokinin thường gặp là Kinetin và BAP, cả hai đều có tác
dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân
sinh và làm hạn chế sự hoá già của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng

17
lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm
tăng cường hoạt tính của một số enzym [4].
Tác động phối hợp của Auxin và Cytokinin có tác dụng quyết định đến
sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của
Skoog cho thấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin cao thì thích hợp cho hình thành rễ,
thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi và ở mức cân bằng thì thuận lợi cho
sự phát triển của mô sẹo [4].
Ngoài Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật người ta
còn sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng khác như: Gibberillin (thông dụng
nhất là GA
3
), Abscisic acid (ABA). Sự có mặt của GA
3
trong nuôi cấy sẽ tăng
cường quá trình vươn thân chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật.
ABA chỉ được sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự sinh trưởng của
chồi, tham gia bảo quản lương thực và quỹ gen in vitro [6].
2.2.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và sinh
trưởng của mô nuôi cấy.
- Nhiệt độ
Mô nuôi cấy phát triển tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ thích hợp với nó
nhưng phải được duy trì một cách ổn định.Trong các phòng nuôi cấy mô, tế
bào thực vật người ta thường duy trì nhiệt độ của phòng nuôi cấy từ 25-28
0
C
nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [6]. Đây là nhiệt độ phù hợp với đa số các loài
thực vật.
- Ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như chu kỳ, cường độ, thành phần quang phổ ánh sáng [20]. Cường độ ánh
sáng từ 2000 - 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô
khác nhau.
- Độ pH
pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi
5,5 - 6,0. pH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH
lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng [6].