Tối ưu hóa các điều kiện lên men sản xuất chất ức chế Enzym α- glucosidase từ Aspergillus oryzae T6 cho chế biến thực phẩm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




PHẠM THỊ QUỲNH LAI


Tên đề tài:
TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
SẢN XUẤT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM
α
- GLUCOSIDASE
TỪ ASPERGILLUS ORYZAE T6 CHO CHẾ BIẾN THỰC PHẨM



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC





Hệ đào tạo : Hệ chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Khoa : CNSH & CNTP
Lớp : 42 - CNTP
Khoá học : 2010 – 2014

Thái Nguyên, năm 2014



ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




PHẠM THỊ QUỲNH LAI


Tên đề tài:
TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN
SẢN XUẤT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM
α
- GLUCOSIDASE
TỪ ASPERGILLUS ORYZAE T6 CHO CHẾ BIẾN THỰC PHẨM



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Hệ chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm
Khoa : CNSH & CNTP
Lớp : 42 - CNTP
Khoá học : 2010 – 2014
Giảng viên hướng dẫn: 1. ThS. Nguyễn Đức Tiến
Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch
2. ThS. Trần Thị Lý
Khoa CNSH & CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên



Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận, Tôi xin trân
trọng cảm ơn bộ môn
Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường Nông nghiệp- Viện
Cơ điện Nông nghiệp và Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch
đã tạo điều kiện để
tôi hoàn thành khóa luận này.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy ThS. Nguyễn Đức Tiến
và cô ThS. Trần Thị Lý đã hướng dẫn tôi tận tình và chu đáo trong suốt thời gian
học tập và thực hiện bản khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn quan quản lý và các nhân viên đang làm việc tại
bộ môn
Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường Nông nghiệp- Viện Cơ điện
Nông nghiệp

, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện các nghiên
cứu liên quan đến khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô tại Khoa CNSH - CNTP và đặc
biệt các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm - Trường Đại học Nông lâm
Thái Nguyên, các bạn và đặc biệt là những người thân trong gia đình đã động viên,
đóng góp những ý kiến quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày 02 tháng 6 năm 2014
Sinh viên


Phạm Thị Quỳnh Lai

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1 Bảng tiêu chuẩn áp dụng cho sản phẩm bột Touchi Extract [5] 21
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs
của chủng A.oryzae T6 31
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 32
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men đến khả năng
sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 33
Bảng 4.5 Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh
hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 36
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu của môi trường đến khả năng
sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryzae T6 37
Bảng 4.7 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt
chất AGIs 38
Bảng 4.8 Khoảng biến đổi của các yếu tố 40

Bảng 4.9 Bảng thiết kế ma trận 41
Bảng 4.10 Kết quả thiết kế ma trận 42




DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu tạo của enzyme α - glucosidase 5
Hình 2.2 Cấu trúc không gian của enzyme α - glucosidase 5
Hình 2.3 Ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường 6
Hình 2.4 Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính) 14
Hình 2.5 Sản phẩm đậu đen lên men và sản phẩm đậu đen lên men có
hoạt chất AGIs 20
Hình 4.1 Phân tích phương sai ANOVA của mô hình tối ưu lên men 43
Hình 4.2 Phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố tới khả năng
sinh hoạt chất AGIs của chủng A.oryaze T6 43
Hình 4.3 Tương tác giữa độ ẩm với nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 44
Hình 4.4 Tương tác giữa thời gian và độ ẩm tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 45
Hình 4.5 Tương tác giữa thời gian và nhiệt độ tới khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 46





DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

Từ viết tắt Tên đầy đủ
AGIs Ức chế enzyme α-glucosidase
TPCN Thực phẩm chức năng
A.oryzae Aspergillus oryzae
YC20s Czpek Yeast extract Agar
IC
50
Nồng độ ức chế 50% của mẫu
ĐTĐ Bệnh đái tháo đường
Da Dalton
Cfu Colony forming unit



MỤC LỤC
Trang
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Danh mục các chữ viết tắt
Mục lục

Phần 1 MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu nghiên cứu 2
Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng 3
2.2. Enzyme α - glucosidase 4
2.4. Hoạt chất AGIs 5
2.4.1. Cơ sở khoa học của việc sử dụng hoạt chất đến quá trình trao đổi đường

trong cơ thể người 5
2.4.2.1. Hoạt chất AGIs tổng hợp bằng hóa học 7
2.4.2.2. AGIs tổng hợp tự nhiên 8
2.4.3. Tính an toàn của hoạt chất AGIs 11
2.4.3.1. Tính an toàn của hoạt chất AGIs đối với các enzyme tiêu hóa 11
2.4.3.2. Tính an toàn của của chất AGIs đối với người tiểu đường và béo phì 11
2.4.3.3. Tính an toàn về độc tố cấp tính 12
2.4.3.4. Tính an toàn về độc tố mãn tính 12
2.5. Giới thiệu về A.oryzae 12
2.5.1. Đặc điểm phân loại A.oryzae 13
2.5.2. Nguồn dinh dưỡng A.oryzae 14
2.6. Qúa trình Lên men của chủng A.oryzae 15
2.6.1. Lên men bề mặt 16
2.6.2. Nguyên liệu cho quá trình lên men 16
2.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt A.oryzae 17
2.7. Tình hình nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs 19

2.7.1. Tình hình nghiên cứu, thử nghiệm AGIs từ đậu lên men trên thế giới . 19
2.7.2. Tình hình nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng hoạt chất AGIs từ đậu
lên men ở Việt Nam 21
Phần 3 ĐỐI TƯỢNG,NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Đối tượng nghiên cứu 23
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng 23
3.3.1. Hóa chất 23
3.3.2. Thiết bị sử dụng 23
3.4. Nội dung nghiên cứu 24
3.4.1. Nghiên cứu quy trình lên men sinh hoạt chất AGIs bởi chủng A.oryzae
T6 24
3.4.1.1. Xác định pH môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của chủng

A.oryzae T6 24
3.4.1.2. Xác định độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của
chủng A.oryzae T6 24
3.4.1.3. Xác định nhiệt độ môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của
chủng A.oryzae T6 24
3.4.1.4. Xác định độ thoáng khí môi trường đến khả năng sinh hoạt chất AGIs
của chủng A.oryzae T6 24
3.4.1.5. Xác định lượng nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh hoạt chất AGIs
của chủng A.oryzae T6 24
3.4.1.6. Xác định tỷ lệ nguyên liệu môi trường đến khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 24
3.4.1.7. Xác định thời gian lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIscủa chủng
A.oryzae T6 24
3.4.2. Sử dụng phần mềm tối ưu Desgin Expert lập ma trận và tiến hành tối ưu
điều kiện lên men 24
3.5. Phương pháp nghiên cứu 24
3.5.1. Phương pháp vi sinh 24
3.5.1.1. Xác định hoạt tính AGIs theo phương pháp của Yamaki và Mori cải tiến 24
3.5.1.2. Phương pháp xác định độ ẩm 25
3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 26

3.5.2.1. Nghiên cứu quy trình lên men sinh hoạt chất AGIs bởi chủng
A.oryzae T6 26
3.5.2.2. Tối ưu một số yếu tố công nghệ lên men bề mặt tạo chất kìm hãm α -
glucosidase theo quy hoạch thực nghiệm 29
3.5.3. Phương pháp xử lý số liệu 30

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
4.1. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hình thành hoạt chất AGIs
trong quá trình lên men 31

4.1.2. Nghiên cứu xác định độ ẩm môi trường đến khả năng sinh hoạt chất
AGIs của chủng A.oryzae T6 32
4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men đến khả năng sinh
AGIs của chủng A.oryzae T6 33
4.1.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí trong quá trình lên men đến khả năng
sinh AGIs của chủng A.oryzae T6 34
4.1.5. Ảnh hưởng lượng giống nấm mốc ban đầu đến khả năng sinh AGIs của
chủng A.oryzae T6 35
4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu của môi trường đế khả năng sinh hoạt
chất AGIs của chủng A.oryzae T6 36
4.1.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh hoạt chất AGIs của
chủng A.oryzae T6 38
4.2.Giải bài toán tối ưu 39
Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47
5.1. Kết luận 47
5.2. Kiến nghị 47

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ăn uống là một nhu cầu thiết yếu của con người. Tuy nhiên việc ăn
uống không khoa học có thể dẫn con người đối mặt với nhiều nguy cơ khác
nhau, đặc biệt trong số đó con người phải đối mặt với nhiều căn bệnh mãn
tính như bệnh béo phì, tim mạch, ung thư,…Trong đó phải kể đến bệnh đái
tháo đường (ĐTĐ).
Theo dự báo của Hiệp hội đái tháo đường Quốc tế IDF,trong một thập

kỉ trở lại đây, bệnh đái tháo đường có xu hướng phát triển nhanh chóng. Ước
tính năm 2010, thế giới có khoảng 221 triệu người mắc bệnh đái tháo đường
và dự báo đến năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (chiếm khoảng 6% dân số
toàn cầu). Tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường ở các nước phát triển khoảng
42%, tỷ lệ này tăng lên 170% ở các nước đang phát triển (Việt Nam) [35].
Hiện thuốc điều trị cho người bệnh ĐTĐ có nhiều tiến bộ song vẫn còn nhiều
hạn chế nên việc sử dụng sản phẩm thực phẩm chức năng, thuốc có hoạt chất
sinh học từ vi sinh vật giúp kiểm soát đường huyết đang rất được quan tâm.
Nhiều công trình khoa hoc đã chứng minh, việc sử dụng hoạt chất ức chế
enzyme α - glucosidase(AGIs) để ngăn cản sự tạo thành monosaccharide là
cách tốt nhất để phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường.
Chất AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau: chiết
xuất từ thực vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường sinh
học nhờ các vi sinh vật. Tuy nhiên để sản xuất chất AGIs trên quy mô lớn
bằng con đường chiết xuất tự nhiên hay hóa học lại rất tốn kém,phức tạp và
có thể gây một số tác dụng phụ như rối loạn chức năng gan và các triệu
chứng đau dạ dày cho người sử dụng. Do vậy việc sản xuất hoạt chất AGIs
bằng vi sinh vật tiêu biểu như Aspergillus oryzae (A.oryzae) đang thu hút sự
quan tâm của các nhà khoa học cũng như nhà sản xuất vì chúng sử dụng an
2
toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ thể sống. Đặc biệt trong những
năm gần đây, có nhiều công trình công bố về đậu lên men bởi chủng A.
oryzae cho chất trích ly AGIs, làm giảm lượng đường huyết, giảm cholesterol
và chống oxi hóa, sử dụng an toàn và không thấy có tác dụng phụ qua các thử
nghiệm lâm sàng trên chuột và người [
3
].
Trên cơ sở đề tài cấp thành phố mã số 01C-06/05-2011-2 Số Quyết
định: 73/2010/QĐ-UBND, đề tài:“Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng
sinh tổng hợp hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase và thử nghiệm sản

xuất thực phẩm chức năng”do Nguyễn Đức Tiến làm chủ nhiệm đề tài, được
sự đồng ý của chủ trì đề tài, Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và Môi trường
Nông nghiệp- Viện Cơ điện Nông nghiệp và Bộ môn Công nghệ Sau thu
hoạch. Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện lên men sản xuất hoạt chất ức chế
AGIs, từ đó chọn ra các yếu tố quan trọng để thực hiện quá trình tối ưu nhằm
tạo ra hoạt tính ức chế cao cho chế biến thực phẩm.
Từ những lý do trên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Tối ưu hóa các
điều kiện lên men sản xuất chất ức chế Enzym α- glucosidase từ
Aspergillus oryzae T6 cho chế biến thực phẩm”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu quá trình lên men (nhiệt độ, pH, độ ẩm, độ thoáng khí,tỷ lệ
nguyên liệu bổ sung, thời gian lên men và lượng nấm mốc ban đầu. Từ đó tối
ưu hóa điều kiện lên men để lượng hoạt chất ức chế Enzym α - glucosidase
tạo ra là lớn nhất làm cơ sở cho việc sản các sản phẩm chức năng.
1.3. Yêu cầu nghiên cứu
- Xác định được ảnh hưởng các điều kiện lên men cho sinh tổng hợp
hoạt chất AGIs: pH, nhiệt độ, độ ẩm, độ thoáng khí, lượng mốc bổ sung, tỷ lệ
cám gạo, thời gian.
- Tối ưu điều kiện lên men bằng phần mềm Desgin Expert 7.0.
3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng
Khái niệm thực phẩm chức năng (functional food) được người Nhật sử
dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có
chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao
sức khoẻ cho người sử dụng. Theo Viện Khoa học và Đời sống quốc tế
(International Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng (TPCN)
là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình
trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là giá trị dinh dưỡng mà

nó mang lại". Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa TPCN: Là thực phẩm dùng để hỗ
trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng,
tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ
gây bệnh [9]. Nói chung TPCN dùng để chỉ những chế phẩm thực phẩm chứa
các chất có hoạt tính sinh học cao, có dược tính từ động vật, thực vật, vi sinh
vật, một số chất tổng hợp giống các hoạt chất tự nhiên như vitamin, hương
liệu v.v… Có tính chất thiết dụng gần giống thuốc, nhưng không thay thế
thuốc điều trị. Hiện nay, TPCN đang được các chuyên gia đánh giá là một xu
thế dinh dưỡng của thế kỷ 21, đáp ứng một phần quan trọng về nhu cầu dinh
dưỡng và sức khỏe con người trong cuộc sống hiện đại. Các nước phát triển
có xu hướng ưa chuộng sử dụng TPCN hơn sử dụng thuốc trong hỗ trợ điều
trị và phòng bệnh [36].
TPCN được phân thành nhiều nhóm, phụ thuộc tác dụng của sản phẩm
như TPCN cho người có đường huyết cao, TPCN cho người có cholesterol
trong máu cao, TPCN cải thiện tiêu hóa….Tuy nhiên, TPCN có tác dụng giảm
đường huyết luôn được quan tâm trong hệ thống phân loại và được xếp thành
một nhóm chính.
4
TPCN hiện nay rất phong phú và đa dạng. Loại TPCN được kể đến
đầu tiên là những thực phẩm mà khi ở dạng tự nhiên đã có những hoạt chất
với lượng lớn có lợi cho đối với cơ thể như chè xanh chứa catechin có tác
dụng giảm béo, giảm lượng cholesterol trong máu; màng gạo chứa Gamma
Oryzanol có tác dụng chống oxy hoá, chống viêm loét Tiếp đó là các
nhóm thực phẩm có ít hoạt chất hơn như các sản phẩm từ sữa kích thích
tiêu hóa, điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễn dịch, phải bổ sung hoặc
tinh chế cô đặc lại ở dạng dễ sử dụng, hay gây biến đổi gene để tăng hàm
lượng một số chất có lợi (thực phẩm có bổ sung vitamin E, làm đẹp da,
chống ôxi hóa). Các công bố về tác dụng của các chức năng của TPCN và
các thành phần của nó đã được cơ quan quản lý xác nhận và công nhận
rộng rãi.Vấn đề TPCN ở Việt Nam còn rất mới, mới cả về tên gọi, hình

thức, phương thức và mới cả về quản lý [12].
2.2. Enzyme α- glucosidase
Enzyme α - glucosidase là một enzyme có hoạt tính exohydrolysis từ
đầu khử đến đầu không khử của oligosaccharides chứa các α - D - glucose
nối với nhau bằng liên kết 1 - 4 glycosides. Enzyme α - glucosidase có thể
có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa
động vật Việc khác nhau về nguồn gốc α - glucosidase có thể dẫn đến sự
khác biệt về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của
enzyme Những thông số cơ này chỉ có thể thu nhận được qua thực
nghiệm trên một enzyme α - glucosidase cụ thể. Cấu tạo của enzyme α -
glucosidase tương tự như của maltose
5

Hình 2.1 Cấu tạo của enzyme α-glucosidase
Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen
mã hóa lysosomal alpha-glucosidase dài khoảng 20 kb.

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase
2.3.Hoạt chất AGIs
2.3.1. Cơ sở khoa học của việc sử dụng hoạt chất đến quá trình trao đổi
đường trong cơ thể người
Bệnh ĐTĐ haycòn gọi là bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn
chuyển hóacacbonhydrate khi hoocmon insulin của tuyến tụy bị thiếu hay
giảm tác động vào cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7
mmol/l.ĐTĐ liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid, lipid, protid và điện
giải. Những rối loạn này thường dẫn tới hôn mê và tử vong trong thời gian
6
ngắn nếu không được điều trị kịp thời. Tăng đường huyết kéo dài sẽ gây ra rất
nhiều biến chứng nguy hiểm ở nhiều phủ tạng đặc biệt là mắt, bệnh tim mạch
vành, tai biến mạch máu não, suy thận…[35].

Theo phân loại Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization -
WHO), năm 1999, bệnh ĐTĐ phân thành hai nhóm sau:
Bệnh ĐTĐ typ1 hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin (nồng độ insulin
giảm thấp hoặc mất hoàn toàn): Do tổn thương hay suy giảm chức năng tế bào
beta của tuyến tụy, tuyến tụy không hoạt động tạo ra đủ insulin để cân bằng
đường huyết nên bệnh nhân cần phải tiêm hoặc uống insulin.
Bệnh ĐTĐ typ 2 hay còn gọi là ĐTĐ không lệ thuộc insulin: Do kháng
insulin kết hợp với khả năng bài tiết insulin giảm. ĐTĐ typ 2 chiếm tỷ lệ chủ
yếu của bệnh tiểu đường, cơ thể người bệnh vẫn tiết ra insulin nhưng không đủ
khiến đường chỉ lưu hành trong máu mà không đưa vào tế bào. Điều trị bệnh
này, người bệnh áp dụng chế độ ăn uống hợp lý có thể kiểm soát được bệnh.


Hình 2.3 Ảnh hưởng của chất AGIs đến quá trình trao đổi đường

Tinh bột
Saccarose ( Glucose+Fructose)
Maltose (Glucose +Glucose)
Ch
ấ
t
ứ
c ch
ế

α-glucosida
se
Ch
ấ
t

ứ
c ch
ế

Glucose Glucose Fructose
Glucose

Glucose huyết
Amylase

7
Từ các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc
sử dụng hoạt chất AGIs để điều trị bệnh đái tháo đường như sau: Tinh bột
hoặc đường (sucroza) là một chất dinh dưỡng quan trọng còn được gọi là
cacbonhydrat. Cấu tạo của nó gồm hai hay nhiều monosaccharit (glucoza
hoặc fructoza). Để cơ thể hấp thụ được, cacbonhydrate sẽ bị phân cắt hoàn
toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống enzyme tiêu hóa. Dưới tác dụng
của enzyme α - glucosidase chúng sẽ phân cắt thành các monosaccharide tại
ruột non.Chất AGIs có thể kìm hãm hoạt tính enzyme α-glucosidase nên ngăn
cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp
insullin diễn ra dễ dàng hơn[23].
Enzyme α - glucosidase (α - glucosidase glucohydrolase) là một exo -
enzyme thủy phân hydratcacbon và giải phóng ra α - glucosidase từ đầu
không khử của cơ chất. Enzym này phổ biến trong vi sinh vật, thực vật, mô
động vật. Các chất kìm hãm enzyme α - glucosidasetồn tại phổ biến như: Hợp
chất đa vòng polyhydroxylated N - substituted, polyhydroxylated
cycloalkenes và oligomers của các phân tử giống như phân tử đường [36].
2.3.2. Nguồnthu nhận AGIs
Hoạt chấtAGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như:
trích ly từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng

con đường vi sinh vật.
2.3.2.1. Hoạt chất AGIs tổng hợp hóa học
AGIs tổng hợp hóa học đã được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều trên
thế giới. Nó được tổng hợp theo phương pháp hóa học dựa trên cấu trúc của
các AGIs tự nhiên. Năm 1986, dihydroacabose đã được tổng hợp cho thấy khả
năng kìm hãm α-glucosidase tương tự như acarbose (psedotetrasaccharide có
khả năng kìm hãm α - glucosidase). Năm 2005, Woo và cộng sự đã được tổng
hợp cho thấy khả năng kìm hãm α - glucosidase dựa vào cấu trúc hóa học của
chalcones (chất kìm hãm α - glucosidase từ một số loại lá cây ăn được ở Hàn
8
Quốc), cho khả năng kìm hãm α-glucosidase rất mạnh [30].Ngoài ra một số
chất hóa học cũng được ghi nhận có khả năng kìm hãm α - glucosidase như
sulfonamide, các dẫn xuất của xanthone và deoxy salacious. Tuy nhiên, các
chất này đã gây ra một số tác dụng như rối loạn chức năng gan và các triệu
trứng về đau dạ dày cho người sử dụng [31
].
Vì vậy gần đây, việc tổng hợp
AGIs theo con đường tự nhiên được quan tâm nhiều hơn do các đặc tính ưu
việt mà nó đem lại như giá thành thấp tính an toàn.
2.3.2.2. Hoạt chất AGIs tổng hợp tự nhiên
Đây là các AGIs dược chiết xuất từ thực vật, động vật, một số loại thực
phẩm từ sự lên men bởi vi sinh vật.
a. ChấtAGIs từ thực vật
AGIs có thể thu nhận từ nhiều phần khác nhau của thực vật. Đây là nguồn
thu nhận phong phú và đa dạng nhất.
Năm 1977, Yoshikawa và cộng sự đã phát hiện salacinol từ dịch chiết
của rễ và lá cây Salacia reticulate (một loại cây bụi leo thuộc họ Celastraceae
đã được người dân Ấn Độ và Sri Lanka sử dụng như một thuốc dân gian từ
lâu đời) có khả năng kìm hãm α - glucosidase. Salacinol có khả năng kìm hãm
maltase và sucrose, isomaltase chuột với giá trị IC

50
lần lượt là 3,2; 0,84;
0,59µg/µl. Các nghiên cứu thử nhiệm trên chuột chứng minh salacinol có khả
năng kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong máu mạnh hơn arbose. Một vài
nghiên cứu lâm sàng cho thấy salacinol có tác dụng kiểm soát lượng đường
trong máu. Tại Nhận Bản, Salacinol oblonga đã được bán như một thực phẩm
chức năng và nó cũng được biết đến ở Mỹ với tên Saptrangi hay Ponkoranti
[32].Trong một nghiên cứu khác, Ye đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết
của dịch chiết một loại thảo mộc Trung Quốc có tên là Ramulus mori
(Sangzhi) trên chuột.
Kết quả cho thấy chuột bị gây tiểu đường bằng alloxan được uống dịch
chiết này đã làm giảm lượng đường huyết sau ăn, ổn định lượng đường trong
9
máu lúc đói.Tuy nhiên chất chiết này không gây ảnh hưởng đến sự hất thụ
glucose trong ruột non ở chuột bình thường [31].
Li và cộng sự đã công bố dịch chiết của hoa lựu Punica granatum có khả
năng kìm hãm α - glucosidase với giá trị IC
50
=1,8µg/ml. Các thử nhiệm trên
động vật cho thấy, khi cho chuột uống dịch chiết này thì lượng đường trong
máu của lô chuột bị bệnh tiểu đường đã giảm đáng kể còn ở lô chuột bình
thường thì không bị ảnh hưởng [17].
Năm 2007, Nilubon và cộng sự đã công bố dịch chiết bằng methanol từ
lá cây hoa sữa phơi khô (Alstonia scholaris) có khả năng kìm hãm α -
glucosidase ruột non chuột. AGIs đã được tìm thấy trong dịch chiết này là 3 -
O-β-d- xylopyranosyl .
Từ lâu đời nhân dân ta đã biết sử dụng lá vối (Cleistocalyx operculatus)
hay nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nước
uống hàng ngày. Các kết quả nghiên cứu về vối cho thấy trong lá và nụ cây
vối chứa tanin, khoáng chất và vitamin … Gần đây, các nhà khoa học của

Viện Dinh dưỡng quốc gia và Đại học phụ nữ Nhật Bản đã công bố năm loại
cây được sử dụng làm nước uống ở nước ta có hoạt chất kìm hãm α -
glucosidase cao nhất. Các kết quả nghiên cứu trên động vật cho thấy uống nụ
vối thường xuyên có khả năng hạn chế tăng đường huyết sau ăn và hỗ trợ ổn
định đường huyết, hỗ trợ giảm lipid máu, phòng ngừa biến chứng của đái tháo
đường [29].
Các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng hoạt chất 1-
deoxynojimycin(DNJ) trong thành phần cao dâu tằm là chất ức chế mạnh
glucosidase và disaccharidase. DNJ ngăn cản quá trình tạo glucose tại thành
ruột và gan, từ đó làm giảm lượng glucose đi vào máu trong thành phần cao
dâu tằm còn chứa nhiều polyphenol mà điển hình là resveratrol, hoạt chất này
giúp tăng tính nhạy cảm của thụ thể insulin với hormone, do đó làm tăng phân
hủy glucose dư thừa. Như vậy, chiết xuất DNJ từ cao dâu tằm vừa ức chế tổng
10
hợp mới, vừa tăng thủy phân glucose giúp hạ đường huyết. Thêm nữa, các
polyphenol còn có tác dụng chống oxy hóa mạnh, giúp chống lại quá trình
peroxide hóa lipid, từ đó giúp ngăn ngừa các rối loạn chuyển hóa lipid dẫn
đến nguy cơ gây biến chứng thành mạch ở bệnh nhân tiểu đường [28].
b. Chất AGIs từ động vật
Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra
khả năng AGIs của các hợp chất chiết xuất từ Stichopus japonicas (Hải Sâm).
Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở nồng độ 0,5 mg/ml thì
khả năng AGIs từ nấm men là 68%. Từ dịch chiết Hải Sâm, các nhà khoa học
đã thu được ba loại AGIs [22].
c. Chất AGIs từ vi sinh vật
Việc sản xuất chất AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm
nghiên cứu của các nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng
an toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ thể sống. Hiện nay một số
chủng vi sinh vật như: A. oryzae, Actinomucor elegans,Rhizopus arrhizus,
Streptomyces, Actinoplanes và Flavobacteriumsaccharophilium,

Saccharomyces cerevisiae Đã được nghiên cứu cho sinh tổng hợp chất
AGIs [18;33;17;34]. Một số AGIs phổ biến như: Acarbose - một pseudo -
tetrasaccharite được thu nhận từ canh trường lên men Actinoplanes spp. SE
50. Validamycin A từ Streptomyces hygroscopicus var. limoneus. Adiposin,
trestatin B, cyclophellitol và CKD - 711 được lấy từ Streptomyces calvus TM
- 521, Streptomyces dimorphogenes vàPhellinus spp [34]. Tuy nhiên AGIs từ
A.oryzae là hướng nghiên cứu mới.
Phần lớn các chất AGIs từ vi sinh vật có cấu trúc tương tự gốc
pyranosyl củaα-glucosidase,như: Acarbose và Voglibose từ vi sinh vật.
Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài
Actinoplanes SE50) là AGIs được tìm ra đầu tiên trên thế giới với giá trị IC
50

= 0,5µM [34]. Acarbose không làm tăng tiết insulin, không làm giảm glucose
11
trong máu lúc đói khi dùng điều trị ở người.Sau acarbose, năm 1984, Kameda
và cộng sự đã tìm ra Voglibose- AGIs từ vikhuẩn Streptomyces hygroscopicus
[18]. Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phát hiện cyclo (dehydroala -
L-Leu), một AGIs từ dịch chiết của Penicillium sp. F 70614 có khả năng
AGIs của nấm men và của ruột non lợn [21].
2.3.3. Tính an toàn của hoạt chất AGIs
Trong phần giới thiệu về các sản phẩm hoạt chất AGIs từ nấm mốc
Aspergilluslên men đậu, Nippon cũng đã dẫn hàng loạt các nghiên cứu khoa
học của Fujita chứng minh về hiệu quả và tính an toàn của hoạt chất AGIs
chiết từ đậu lên men bởi nấm mốc thực phẩm [24].
2.3.3.1. Tính an toàn của hoạt chất AGIs đối với các enzyme tiêu hóa
Có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh hoạt chất AGIs từ đậu lên
men là an toàn qua các thử nghiệm trên chuột và người. Hoạt chất AGIs được
sử dụng trước bữa ăn để cản trở quá trình thuỷ phân cacbonhydrat trong ruột
non. Các nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự cho thấy chất AGIs từ

đậu lên men nấm mốc có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme α-
glucosidasenhưng lại không ức chế các enzym tiêu hóa khác như amylaza,
proteaza, pepsin, trypsin, chymotrypsin hoặc lipaza. Hiện nay, người ta chưa
phát hiện ra một tác dụng phụ nào về tiêu hoá. Chất chiết này còn có tác dụng
điều hoà sự hoạt động của các enzym tiêu hóa trong ruột non nên nó là một
sản phẩm an toàn và có lợi cho tiêu hoá. Các chỉ số về cân nặng hay chiều cao
không thay đổi [15].
2.3.3.2. Tính an toàn của của chất AGIs đối với người tiểu đường và béo phì
Chất chiết từ đậu lên men bởi A.oryzae có hàm lượng đường thấp và có
lượng lớn các chất béo không bão hòa như axit α -linolenic (axit béo omega -
3) có tác dụng hạ triglycerit máu và LDL-cholesterol ở những bệnh nhân
ĐTĐ và béo phì. Ngoài ra, chất xơ chứa trong sản phẩm đậu lên men giúp hấp
thu glucose chậm hơn, làm chậm tốc độ tiêu hóa tại dạ dày và việc gắn
12
glucose tại ruột non. Hiroyuki Fujita và cộng sự đã thử nghiệm trên 8 bệnh
nhân có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ và 4 bệnh nhân ĐTĐ. Kết quả là sau khi sử
dụng chất chiết từ đậu lên men thì sự ức chế hàm lượng glucose trong máu
được quan sát thấy sau 60 và 90 phút tiêu thụ sacarose (người có nguy cơ
ĐTĐ) và tác dụng giảm đường huyết có ý nghĩa tại thời điểm 60 phút và 120
phút sau khi ăn (người ĐTĐ), so sánh với đối chứng không uống chất chiết từ
đậu lên men. Cả các đối tượng có nguy cơ mắc tiểu đường và các bệnh nhân
tiểu đường đều không có bất cứ tác dụng phụ nào, không quan sát thấy sự bất
thường trong máu hay các chỉ số sinh hóa [15].
2.3.3.3. Tính an toàn về độc tố cấp tính
Hiroyuki Fujita và cộng sự đã thử nghiệm chất chiết từ đậu lên men bởi
A.oryzae trên chuột ở liều 100 mg/kg và 500 mg/kg. Kết quả cho thấy hàm
lượng glucose trong máu giảm so với nhóm đối chứng (n=10) sau 15 - 60
phút nạp sucrose. Hàm lượng glucose trong máu giảm tương ứng là 17,96 ±
0,42 và 16,76 ± 0,39 mmol/l khi so sánh với nhóm chuột đối chứng là 19,91 ±
0,58 mmol/l [15]. Nhóm tác giả này cũng đã thử nghiệm trên người bệnh

ĐTĐ, để xác nhận sự an toàn, 9 người khỏe mạnh đã được uống 3g/ngày
trong 12 tuần. Kết quả là không có sự thay đổi về đường huyết và các chỉ số
hóa sinh máu, cân nặng… Điều này chứng minh hoạt chất AGIs từ đậu lên
men không có độc cấp tính [13].
2.3.3.4. Tính an toàn về độc tố mãn tính
Để đánh giá hoạt tính hoạt chất AGIs trong chế phẩm, 18 bệnh nhân
ĐTĐ typ 2 đã được thử nghiệm với liều 0,9 g/ngày (0,3g/bữa ăn) trong 6
tháng. Kết quả cho thấy hàm lượng đường máu ban đầu là 9,31 ± 0,71 mmol/l
và HbA1c: 10,24 ± 0,58%. Sau 6 tháng thử nghiệm, hàm lượng đường máu
giảm còn 8,61 ± 0,66 mmol/l, HbA1c: 8,96 ± 0,3%, chỉ số mỡ máu và tổng
cholesterol, triglycerit cũng giảm. Hơn nữa, enzym tiêu hóa không bị ảnh
hưởng trong suốt quá trình thử nghiệm [14;26].
2.4. Giới thiệu về A.oryzae
13
2.4.1. Đặc điểm. phân loại A.oryzae
Theo Từ điển nấm học, nấm mốc Aspergillus oryzae được phân loại như
sau:GiớiFungi, ngànhAscomycota,lớpEurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ
Trichocomaceae, giống Aspergillus, loàiAspergillus oryzae (Kitamoco, 2002).
Theo khóa phân loại của Klich: A.oryzaecó đặc điểm phát triển khác
nhau khi nuôi cấy trên các môi trường czapek, czapek yeast agar (CYA25),
czapek yeast agar 20% sucrose (CY20S), malt extract agar (MEA). Quan sát
trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 cho thấy đặc điểm hình thái của A.
oryzae như: Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất
mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh nhiều và có vách ngang chia sợi có
các cuống đính bào tử (dài 1 - 2 mm), ở đó có cơ quan sinh sản vô tính; phía
đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng, bọng đỉnh giá có hình quả lê,
hình chùy hoặc hình cầu đường kính từ (8) 22-50 (90) µm; cuống sinh bào tử
nhẵn hoặc sằn sùi, kích thước từ 500-2500 (5000) µm. Bào tử trần hình cầu
đến hình trứng, nhẵn đến có gai nhẹ, đường kính (3,5) 4-8,5 (10) µm, có màu
vàng lục hay màu vàng hoa cau. A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme thủy

phân như cellulose, pectinase, hemicellulase, xylase khi sinh sống trên môi
trường cơ chất tương tự như cellulo, pectin, hemicellulo, xylan nên A.oryzae
được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, chế biến đồ ăn và trong công nghiệp
sản xuất enzyme.
Ở Nhật Bản, A.oryzae được sử dụng trong quá trình sản xuất thức ăn
như xì dầu, rượu sake và trong công nghiệp sản xuất enzyme. Ở Việt Nam,
A.oryzae được sử dụng chủ yếu để làm tương. Năm 2000, bộ gen di truyền của
A. oryzae đã được phân tích và giải mã. Hệ gen gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn
gen và 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005).Trình tự bộ
gen của A.oryzae RIB40 (ATCC - 42149) được hoàn thành vào năm 2005. Các
trình tự này được công bố từ nhóm các nhà khoa học bao gồm Nhật, Mỹ và châu
Âu, tỷ lệ trình tự mỗi genome mà họ đọc được đạt khoảng 95%. Tổng dung
14
lượng genome từ 3 loài đã đọc là 95 Megabase, bao gồm 33500 gene mã hóa
protein chứa trong 24 nhiễm sắc thể (8 nhiễm sắc thể mỗi loài).








Hình 2.4Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính)
2.4.2. Nguồn dinh dưỡng A.oryzae
A.oryzae là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có khả
năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa
hiếu khí hoặc quá trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoại bào. A.oryzae là
loại hiếu khí hoàn toàn và có kiểu cacbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, có
nghĩa là có khả năng phân giải xác sinh vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm

chất dinh dưỡng.
a. Nguồn cacbon
A.oryzae có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và không đòi
hỏi nghiêm ngặt đối với các loại thức ăn cacbon. Nhiều loài nấm mốc còn có
khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với
nhiều sinh vật khác (các hợp chất n - ankal, ankaloid, phenol, nhiều chất
kháng sinh…) Đối với nguồn thức ăn phức tạp như: Xylan, tinh bột, xenllulo,
kitin… Trước hết A.oryzae phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất
này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng.

15
b. Nguồn nitơ
Các loài A.oryzae khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức
ăn nitơ. A.oryzae thường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ.
c. Các nguyên tố khoáng
Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định được
tất cả các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc. Về các nguyên tố đại lượng,
có thể kể đến: S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến
vài phần trăm trọng lượng khô. Các nguyên tố vi lượng có: Mn, Mo, Zn, Cu,
Co, Ni, B. Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc thay đổi
tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy.
Đặc điểm của giống A.oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào (amylase, protease, pectinase,…) ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo… Đã hết nhưng không được rửa
sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có
khi thành lớp mốc, có màu sắc vàng, đen… Màu do bào tử già có màu sắc.
Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận
lợi sẽ mọc thành mốc.
2.5.Qúa trình Lên men của chủng A.oryzae
Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được tiến hành do hoạt

động sống của vi sinh vật nhờ sự tiếp xúc của các enzyme nhằm cung cấp
năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng.
Quá trình lên men có thể chia làm hai pha:
Pha sinh trưởng: Trong pha này chủ yếu là quá trình sinh tổng hợp
protein và xây dựng tế bào. Các tế bào trong giai đoạn này non, sinh trưởng
nhanh và tăng sinh khối nhanh. Môi trường dinh dưỡng trong pha này giàu
nguồn cacbon, nitơ và photpho vô cơ. Sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật
trong giai đoạn này không có hoặc bắt đầu tích tụ với một số lượng nhỏ, sau
16
đó dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển của men giống, cho đến khi ổn
định thì chuyển sang pha thứ hai.
Pha thứ hai: Là pha tích tụ các sản phẩm của sự trao đổi chất. Ở pha
này, môi trường dinh dưỡng cạn dần, sinh khối tế bào cũng giảm dần nhưng
lượng sản phẩm trao đổi chất tích lũy ngày càng tăng. Tuy nhiên, ở cuối pha
này, do tế bào bắt đầu tự phân, quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại và một
số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật. Do đó môi trường
khi nuôi cấy phải thống nhất, trong đó vi sinh vật với môi trường có mối quan
hệ tương hỗ với nhau. Trong thực tế sản xuất, pha này bao giờ cũng phải kết
thúc trước điểm cuối để tranh sự tự phân tế bào, làm độ nhớt tăng gây khó
khăn cho việc tách lọc.
2.5.1. Lên men bề mặt
Lên men bề mặt là vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường.
Phương pháp này thường được sử dụng để sản xuất acid citric và một số loại
enzyme. Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là tốn kém diện tích bề
mặt. Phương pháp này được áp dụng trong buổi đầu của công nghiệp kháng
sinh. Môi trường nuôi cấy bề mặt có thể là các cơ chất ở dạng rắn hoặc lỏng.
Nói chung, phương pháp này giống như lên men enzyme bằng nấm mốc.
2.5.2. Nguyên liệu cho quá trình lên men
Họ Đậu (danh pháp khoa học là Fabaceae) là họ thực vật có hoa lớn thứ
ba, sau họ Phong lan và họ Cúc, với khoảng 730 chi và 19400 loài. Trên thế

giới hiện này có khoảng trên 1,000 loại đậu với nhiều đặc điểm khác nhau từ
hạt đậu có kích thước nhỏ nhất như hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất
giống trái anh đào (cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc như đỏ, vàng, xanh, nâu
và màu đen.
Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrical Skeels hay Vigna
unguiculata walp.subsp.cylindrica (L) Verdc. Có hai loại đậu đen: Loại vỏ
đen ruột trắng và loại vỏ đen ruột xanh thường gọi là đậu đen xanh lòng (loại