Nghiên cứu thành phần hoá học cây Dấu dầu lá nhẵn (Tetradium Glabrifolium)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC
===£oBQoa===
NGUYỄN THỊ THƠM
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY DẤU
DẦU LÁ NHẴN (TETRADIUM GLABRIFOLIUM)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Hóa Hữu Ctf
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC
===£r)CQGa===
NGUYỄN THỊ THƠM
HÀ NỘI -
NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HÓA HOC CÂY DẤU
DẦU LÁ NHẢN (TETRADIUM GLABRIFOLIUM)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC • • • •
Chuyên ngành: Hóa Hữu Ctf
Người hướng dẫn khoa học PGS.TS. NGUYỄN VĂN BẰNG
HÀ NỘI -
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại Phòng Nghiên cứu cẩu trúc Viện
hóa sinh biển, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo PGS. TS.
Nguyễn Văn Bằng - Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, người đã tận
tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt
nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn
Anh cùng các thầy cô và các anh chị phòng Nghiên cứu cẩu trúc, Viện Hóa Sinh biển
- Viện Hàn ỉâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ em
trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn NCS. Trương Thị Thu Hiển - Học viện quân y
người đã giúp đỡ em rất nhiều trong việc tìm kiếm tài liệu liên quan đến đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Hóa Sinh biển đã tạo điều

kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của Viện để hoàn thành
tốt các mục tiêu đề ra của khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các bạn sinh viên lớp K36B
khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ em trong quá trình
làm đề tài tốt nghiệp.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, em đã rất cố gắng nhưng không tránh
khỏi những thiếu sót, kính mong các thầy cô và các bạn nhiệt tình đóng góp ý
kiến để đề tài của em được hoàn thiện hơn nữa.
Em xỉn chân thành cảm ơnỉ
Hà Nội, ngày 16 ngày 05 thảng 2014 Sinh viên
Nguyễn Thị Thơm
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm K36B - Hóa Hoc
LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong
khóa luận: “Nghiên cứu thành phần hóa học cây Dấu dầu lá NHẴN”, dưới sự
hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung thực và không
trùng với kết quả của tác giả khác.
Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2014 Sinh viên
Nguyễn Thị Thơm
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm K36B - Hóa Hoc
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân hai chiều
Sắc kí cột
Phổ khối lượng va chạm electron

Phổ khối lượng phun mù điện tử
Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh ở mức
năng lượng thấp
13
C-NMR Cacbon-13-Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
'H-NMR Proton Magnetic Resonance
Spectroscopy
2D - NMR TWO-Dimensional Nuclear
Magnetic Resonance
Spectroscopy
CC
Clolumm chromatography
DEPT Distortion less Enhacement by
Polarisation Transfer
EI-MS Electron Impact Mass
Spectrometry
ESI-MS Electron Spray Ionization Mass
Spectroscopy
FAB - MS Fast Atom Bombing Mass
Spectroscopy
HMBC Heteronuclear Multiple Bond
Connectivily
HSQC Heteronuclear Single Quantum
Coherence
IR In Frared Spectroscopy
MS Mass Spectroscopy
NMR Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
TLC Thin Layer Chromatography

Phổ hồng ngoại
Phổ khối lượng
Phổ cộng hưởng
từ hạt nhân
Sắc kí lớp mỏng
DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ sơ ĐỒ
Hình 1.1. Cây Dấu dầu lá nhẵn Ợetradium glabrifolium) khi non và thân cây khi
lớn.
Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây Dấu dầu lá nhẵn Ợetradỉum glabrifolium)
Sơ đồ 3.1 : Sơ đồ phân lập hợp chất 1
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập hợp chất 2
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của họp chất 1
Hình 4.2. Phổ proton ^-NMR của hợp chất 1
Hình 4.3. Phổ
13
C-NMR của hợp chất 1
Hình 4.4. Phổ DEPT của họp chất 1
Hình 4.5. Phổ HSQC của hợp chất 1
Hình 4.6. Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 1
Hình 4.7. Một số tương tác HMBC chính của hợp chất 1
Bảng 4.1. Dữ kiện phổ NMR của họp chất 1
Hình 4.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2
Hình 4.9. Phổ proton ^-NMR của họp chất 2
Hình 4.10. Phổ
13
C-NMR của hçrp chất 2
Hình 4.11. Phổ DEPT của hợp chất 2
Hình 4.12. Phổ HSQC của hợp chất 2
Hình 4.13. Phổ 2 chiều HMBC của hợp chất 2
Hình 4.14. Một số tương tác HMBC chính của họp chất 2

Bảng 4.2. Dữ kiện phổ NMR của chất 2
MỤC LỤC
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Thom K36B - Hóa Hoc
MỞ ĐẦU
Đất nước Việt Nam chúng ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa,
có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), vì vậy nước ta có
hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với khoảng 13000 loài thực vật bậc cao,
ừong đó có tới hơn 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược chữa bệnh
[2]. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá và có ý nghĩa to lớn cho
sự phát triển của ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác, hệ thực vật
phong phú cũng tạo tiền đề quan ừọng cho sự phát triển ngành hóa học các hợp
chất thiên nhiên ở nước ta.
Từ xưa tới nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan
ừọng ừong việc chăm sóc sức khỏe cho con người. Ngày nay, những họp chất tự
nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng ừong
nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khỏe con người. Chúng
được sử dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên
liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm V.V Ngành công nghệ tổng
hợp hoá dược ngày càng phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử
dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều,
nhưng những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng
trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián
tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm
những dược phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như
các bệnh nan y. Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm
được dùng chữa bệnh hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên
nhiên [4]
Trong y học cổ truyền, cây Dấu dầu lá nhẵn được sử dụng nhiều làm thuốc

tri tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp. Thân và lá cây dùng để tri viêm
thận, phù thũng, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa, [1].
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Thơm 9 K36B- Hóa Học
Bên cạnh đó các hợp chất phân lập được từ chi Tetradỉum còn thể hiện
nhiều hoạt tính đa dạng và hữu ích như: hoạt tính kháng ung thư (phổi, đại tràng,
vòm họng, các tế bào ung thư vú, ung thư dạ dày ), tác dụng đối với hệ tim
mạch, hệ thần kinh, tác dụng kháng viêm giảm đau, dưỡng da, trị bệnh tiểu
đường, kháng HIV, giảm béo và tác dụng điều nhiệt [1].
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khóa luận tốt
nghiệp là:
Nghiên cứu thành phần hóa học cây Dấu dầu lá nhẵn (Tetradium
glabriýolium)
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Xử lý mẫu và tạo dịch chiết cây Dấu dầu lá nhẵn (Tetradỉum glabriýolium)
2. Nghiên cứu về thành phần hóa học và phân lập các hợp chất của cây.
Xác định cấu trúc hóa học của các họp chất đã phân lập
được.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược thực vật học về họ Cam quýt (Rutaceae)
Họ Cam quýt hay còn gọi là họ Cửu lý hương là một họ thực vật ừong bộ
Bồ Hòn (Sapindales ). Tuy nhiên, danh pháp Rutaceae ở đây xuất phát từ tên của
Cửu lý hương do “Rutaceae” bắt nguồn tò tên khoa học của Cửu lý hương la
Ruta, trong khi chi Cam có tên khoa học là Citrus.
Họ Cam quýt có khoảng 161 chi với hơn 2070 loài, phân bố chủ yếu ở
vùng nhiệt đới và ôn đới ẩm, đặc biệt là Nam Phi và Châu úc [5].
Các loài họ Cam quýt có bề ngoài và kích cỡ từ cây thân thảo tới cây bụi
và cây thân gỗ, cao từ 5-15 m. Cây có lá đơn hay lá kép hình lông chim gồm

nhiều lá chét lệch, mọc cánh, có mùi thơm cay. Hoa thường được chia thành 4
hay 5 phần, có mùi thơm rất mạnh. Quả khô tự mở hay quả mọng có vỏ ngoài
chứa nhiều túi tinh dầu thơm, hạt đôi khi có cơm [5, 6].
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Thơm 10 K36B- Hóa Học
1.2. Đặc điểm của chi Dấu dầu {Jetradium)
Chi Tetradium là một chi trong họ Cam quýt, phân bố từ vùng núi
Himalaya đến vùng nhiệt đới Đông Nam Á. Trong các tài liệu cũ, các loài của chi
Tetradium thường bị xếp vào chi Euodỉa (một số tài liệu viết là Evodia), nhưng bắt
đầu tò năm 1981, chi Euodỉa đã được chia làm 3 chi Tetradỉum, Euodia, và
Melicope [5, 6].
Theo phân loại thực vật học, chi Tetradium bao gồm 12 loài, nhưng trong
số này chỉ có 8 loài được chấp nhận tên loài:
- Tetradium austrosinense (Handel-Mazzetti)T.G.Hartley, 1981;
- Tetradỉum calcicolum (Chun ex C.C.Huang) T.G.Hartley, 1981;
- Tetradium danìellìỉ (Bennett) T.G.Hartley, 1981;
- Tetradiumfraxinifolium (Hooker) T.G.Hartley, 1981;
- Tetradỉum glabrifolium (Champion ex Bentham) T.G.Hartley, 1981;
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Thơm 11 K36B- Hóa Học
- Tetradỉum ruticarpum (A. Jussieu) T.G.Hartley, 1981;
- Tetradium sambucinum (Blume) T.G.Hartley, 1981;
- Tetradium trichotomum (Loureiro) Fl. Cochinch, 1790;
Các loài ttong chi Tetradium thường có thân bụi hoặc thân gỗ, lá dài khoảng
14-38 cm hình lông chim hoặc hình elip, không có răng cưa, sáng bóng màu xanh
đậm ở trên, nhạt màu và có lông bên dưới. Hoa gồm các bông nhỏ, đơn tính, trong
các cụm màu trắng với bao phấn màu vàng. Cánh hoa màu xanh lá cây, vàng hoặc
trắng. Chùm hoa từ 8-16 cm, phân nhánh cuối các nhánh nhỏ. Hoa có mùi thơm và

xuất hiện vào giữa đến cuối mùa hè, dễ nhận thấy, rất hấp dẫn với các loài ong. Trái
có màu hồng hoặc gần như màu đen, có mỏ trong cụm lớn và sặc sỡ. Hạt màu đen
sáng bóng, quả chín vào cuối mùa hè và tồn tại qua mùa đông [6, 8].
Các hợp chất phân lập được từ chi Tetradỉum đã thể hiện nhiều hoạt tính đa
dạng và hữu ích như: hoạt tính kháng ung thư (phổi, đại tràng, vòm họng, các tế
bào ung thư vú, ung thư dạ dày ), tác dụng đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh, tác
dụng kháng viêm giảm đau, dưỡng da, trị bệnh tiểu đường, kháng HIV, giảm béo và
tác dụng điều nhiệt [1]. Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thể hiện các hoạt tính và
tác dụng này trong các loài chi Tetradỉum phần lớn đều thuộc lớp chất alkaloid như:
decarine, rutaccarpine, evodiamine, dehydro-evodiamine và một số hợp chất
quinolone alkaloid ; hoặc lớp chất trierpenoidnhư: taraxerol, limonin, skimming,
umbelliferone
1.3. Giới thiệu về cây Dấu dầu lá nhẵn (Tetradỉum glábriýolỉum).
1.3.1. Đăc điểm thưc vât
• • •
Tên khoa học : Tetradium glabrifolium (Benth.)Hartl.).
Tên Việt Nam : Dấu dầu lá nhẵn
Chi : Tetradỉum
Họ : Cam quýt (Rutaceae)
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 12 K36B- Hóa Học
Đây là loài cây gỗ lán (đại mộc), có thể cao đến 20 m, vỏ ít nứt, cành non có
lông. Cành lá dài 14-38 cm, có từ 5-19 lá phụ. Lá bản rộng, hình trứng hoặc hình
lưỡi mác, đáy không đối xứng, bìa nguyên, không lông, gân phụ, kích thước lá 1,7-
6 X 4-15 cm, cuống phụ 3-5 mm, cuống có lông. Hoa nở thành chùm, kích thước từ
9-19 cm. Mỗi bông hoa có bốn hoặc 5 cánh, dày khoảng 0,5 mm. Cánh hoa màu
xanh lá cây, vàng hoặc trắng, khi khô chuyển sang màu trắng đục đến màu nâu.
Quả có 3 nang, chứa lớp thịt xốp bao bên ngoài một lớp vỏ mỏng khi chín có màu
đen bóng, trong quả mỗi nang có một hạt ừòn, màu đen, kích thước từ 2,5-4 mm.

Hoa nở từ tháng 6 đến tháng 9, quả xuất hiện từ tháng 9 đến tháng 12 [4].
Phân bố: Thường phân bố chủ yếu ở vùng Đông Á (Nhật Bản, Trung Quốc,
Đông bắc Ân Độ, Việt Nam, Philippin, Inđônêxia, Malayxia và Thái Lan, Lào,
Campuchia) [4].
Hình 1.1. Cây Dấu dầu ỉá nhẵn (Tetradium glabrifolium) khi non và thân
cây khỉ lớn.
r 1 __r ^
Một sô hình ảnh vê cây Dâu đâu lá nhăn:
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 13 K36B- Hóa Học
Hình 1.2. Hoa, lá và quả của cây Dấu dầu lá nhẵn
(Tetrađium glabrifolium)
2.5.2. Công dạng chữa bệnh
Trong y học cổ truyền, cây Dấu dầu lá nhẵn được sử dụng nhiều làm thuốc
tộ tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp. Thân và lá cây dùng để tộ viêm
thận, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa. Lá cây còn được dùng để nấu nước
tắm cho bà đẻ hoặc nấu nước đặc để rửa vết thương, tắm ghẻ lở và giã chưng vcd
giấm hay làm nóng đắp sưng vú. Quả và vỏ được dùng sắc uống lợi tiểu hoặc đại
tiểu tiện, chữa kiết lị, táo bón và thấp khớp [1].
Ở Trung Quốc, lá cây Dấu dầu lá nhẵn còn được dùng để chữa tộ các bệnh
lở loét tứ chi mãn tính và bệnh đau dạ dày.
1.3.3. Tĩnh hình nghiên cứu về cây dấu dầu lá nhẵn trên thế giới
Nghiên cứu hóa học đầu tiên về cây Dấu dầu lá nhẵn được thực hiện năm
1987 do nhóm nghiên cứu của Kwok tại khoa Dược trường ĐH Sừathelyde,
Scotland. Trong công trình của mình, họ đã công bố cấu trúc 5 hợp chất từ thân,
vỏ và rễ cây dấu dầu lá nhẵn, đó là các hợp chất: lỉmonỉn (3), isolimonexic acid
(64), mtaevinexie acid (77), amottianamide (34) và
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khỏa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 14 K36B- Hỏa Học

1- hydroxymtacearpine (35) [7].
Năm 1995, nhóm của Wu (ĐH Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan) đã nghiên
cứu thành phần hóa học của lá cây Dấu dầu lá nhẵn và phân lập được 29 họp chất,
bao gồm:
• 3 alkaloit: rutacearpine (1), methyl-yỡ-carbonline-1-carboxylate (2),
strychnocarpine (3).
• 5 triterpenoid: squalene (4), yỡ-amyrin acetate (5), taraxerone (6), epi-
taraxerol (7), epi-taraxerol (8).
• 5 flavonoid: liquiritin (9), kaempferol-3-0-/?-D-xylopyranoside (10),
nicotitlorin (11), ratin (12) và Juglanin (13).
• 5 coumarin: skimmim (14), ỉso-franxoside (15), franxin (16), umbelliferone
(17) và scopoletin (18).
• 7 benzenoid: p-hydroxy benzaldehyde (19), p-hydroxybenzoic acid
(20) , protocatechuic acid (21), gallic acid (22), methygallate (23), yỡ-
glucogallin (24) và methylchlorogenate (25).
• 2 tannin: corilagen (26) và ellagic acid (27).
• 1 saccharide, myo-inositol (28)
• 1 nucleoside, adenoside (29) [9].
Cũng trong năm 1995, nhóm của Wu đã tiếp tục công bố cấu trúc của 46 hợp
chất từ lõi thân cây Tetradium glabrifolium, trong đó có:
• 3 chất mới là: evomeliaefolin (1), evofolin A (2), evofolin B (3).
• 43 hợp chat đã biết bao gồm: 6 họp chất decarine (4), norchelerythrine (5),
bocconoline 6), oxychelerythrine (7), 6-axetoneyl-5 (8), 6- dihydro-
chelerythrine (9), amottianamide (10), rutaecarpine (11), hortiacine (12),
dictamnine (13), robustine (14), y-fagarine (15), skimmianine (16), 4-
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khỏa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 15 K36B- Hỏa Học
methoxyl-methyl-2-quinolone (17), aữactylenolide (18), lupeol (19), 12-a-
hydroxyevodol (20), evodol
(21) , rutacvine (22), graucin A (23), 6-0- axetoxy-5- epilimonin (24),

limonin (25), umbelliferone (26), p-hydroxy-benzaldehyde (27), p-
hydroxybenzoic acid (28), methylparaben (29), methyl-syringate (30),
syringaldchyde (31), vanillin (32), 3,4,5-trimethoxybenzylalcohol (33),
methyl vanillate (34), methyl-p-hydroxycinnamate (35), trans-4 hydroxy-3 ’-
methoxycinnamaldehyde (36), evofolin C (37), omega- hydroxy-
propioguaiacone (38), 2’-hydroxy-4’-methoxyacetophenone (39),
hortiamide (40), cw-N-p-coumaroyltyramine (41), trans-N- coumaroyl-
tyramine (42), c/s-N-feruloyltyramine (43), trans-N- feruloyltyramine (44), /
7-sitosterol (45), sitosteryl glucoside (46) và (-)- matariesinol (47) [10].
1.3.4. Tình hình nghiên cứu về cây dấu dầu lá nhẵn ở Việt Nam
Trong tài liệu cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam của Đỗ Huy Bích
và các cộng sự, cây Dấu dầu lá nhẵn ở Việt Nam được sử dụng như một vị thuốc
nam có rất nhiều công dụng [1].
Mặc dù cây Dấu dầu lá nhẵn đã được sử dụng ừong y học cổ truyền, nhưng
hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về loài cây này. Việc nghiên cứu
thành phàn hóa học và một số hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm
thành phần hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng cây thuốc này trong dân
gian và đặc thù loài tại Việt nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng
tiếp theo có ý nghĩa khoa học và thực tiễn.
Tổng hợp tò các công bố nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Dấu
dầu lá nhẵn cho thấy đã phân lập tò loài này 74 hợp chất gồm có:
• 17 họp chất alkaloid
• 15 họp chất trierpenoid
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khỏa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 16 K36B- Hỏa Học
• 5 flavonoid
• 5 coumarin
• 20 benzenoid
• 5 amide
• 2 tanin

• 2 sterol
• 1 đường
• 1 lignan
• 1 nucleoside
Số lượng các hợp chất ừong cây Dấu dầu lá nhẵn đã góp phần làm đa dạng
các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tự nhiên.
1.4. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có
trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,
chất phân cực ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.4.1. Chọn dung môi chiết
Điều kiện của dung môi là: phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ
cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất
nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Thông thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực
khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan ừong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết ít khi được quan tâm và cần phải được lựa chọn rất
cẩn thận.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể làm ảnh hưởng đến hiệu quả và
chất lượng của quá trình chiết. Vì thế những dung môi này cần được chưng cất để
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khỏa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 17 K36B- Hỏa Học
thu được dạng sạch trước khi đưa vào sử dụng. Có một số chất dẻo thường lẫn
ừong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl- axetylcitrar và
tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất
hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Metanol và cloroữom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)- phtalat
hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Hai chất này có thể làm cho kết quả phân lập trong
các quá trình nghiên cứu hoá thực vật bị sai lệch, thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Clroữom, metylen clorit và

metanol là những dung môi thường được lựa chọn ừong quá trình chiết sơ bộ một
phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa
Những tạp chất của cloroírom như CH
2
C1
2
, CH
2
ƠBr có thể phản ứng với
một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương
tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng có thể gây ra sự
phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Cloroữom có
thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác
khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít
độc hơn và dễ bay hơi hơn cloroírom.
Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon
thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm lên màng tế bào
tốt hơn nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành
phần trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của cloroữom thấp hơn, nó có thể
rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá
phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng
ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong
nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khỏa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 18 K36B- Hỏa Học
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi
dùng metanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ trechlonolide
A thu được tò ừechlonaetes aciniata được chuyển thành
trechlonolide B bằng quá ừình phân huỷ l-hydroxytropacocain
cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong

metanol nóng.
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khỏa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 19 K36B- Hỏa Học
Thông thường người ta sử dụng dung dịch nước của metanol để thu dịch
chiết thô từ cây chứ không sử dụng nước.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ
bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ.
Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng
tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành
axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều
kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có
khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong
muốn.
Việc hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp ừong
cây được chiết sẽ rất quan ừọng vì từ đó ta có thể lựa chọn dung môi thích hợp cho
quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành
chất không mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá
30-40°C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
1.4.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
-Chiết ngâm.
-Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
-Chiết sắc với dung môi nước.
-Chiết lôi cuốn hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian.
Thiết bị sử dụng là một bình tìiuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh
tốc độ chảy thích họp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc
r

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 20 K36B- Hóa Học
lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi
phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình tìiuỷ tinh.
Quá trình chiết ngâm thường không được sử dụng như phương pháp chiết
liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất
chiết mới được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3
lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết
thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của họp chất này bằng sự tạo
thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Dragendroff và tác nhân
Maye.
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà
không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phàn của dịch chiết ra và sự xuất hiện
của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để
biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết
sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết
kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích càn thiết lấy chất gì mà ta có thể lựa chọn
dung môi cho thích họp và thực hiện quy trình chiết họp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà
ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.5. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các họp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu
hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các
họp chất hữu cơ nói chung và các họp chất thiên nhiên nói riêng.
r

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 21 K36B- Hóa Học
1.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí.
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau
về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và
pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử
của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của
chúng (tính bị hấp phụ, tính tan ).
Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác nhau về tốc độ di chuyển của các chất
ừong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của sự khác
nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ của các chất khác nhau hoặc do
khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong
quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha
tình khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất
có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các
chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các
chất qua quá trình sắc kí.
1.5.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí.
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha
động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của
lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là
áp suất riêng phàn) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
rico.b.C
n =
lĩ^ế
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n
m

: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b : Hằng số.
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 22 K36B- Hóa Học
c : Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.5.3. Phân loại các phương pháp sắc
ký Trong phương pháp sắc kí:
- Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng.
- Pha tĩnh có thể là các chất ở ừạng thái lỏng hoặc rắn.
• Theo bản chất của hai pha sử dụng
- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có
thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất
mang
- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng
hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
+ Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ thuậtsắc ký giấy, sắc ký lớp
mỏng, sắc ký cột.
• Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra ừong quá trình phân tách
chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này
đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được

nhồi ừong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là
những hạt silica gel hoặc alumin.
r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 23 K36B- Hóa Học
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là
polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ởdạng
ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.
- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography), gel (filtration
chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có
nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có
nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm
hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc
tinh sạch protein.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột
có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn
đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng
phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải
có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hçrp.
• Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin - layer chromatography).
Trong sắc ký giấy:

r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 24 K36B- Hóa Học
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos +
Pha động: là chất lỏng Trong sắc ký lớp
mỏng
+ Chất hấp phụ thông dụng ừong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha
tĩnh với tính chất rất phân cực
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình
trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẩu cần tách được đặt lên ừên bề
mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
• Dựa vào trạng thái tập họp của pha động, người ta chia sắc kíthành hai
nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
• Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ:
sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng.
1.5.3. L Sắc kí cột (CC).
Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ là pha
tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo
YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh
hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan
trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước
của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và
ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy
càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó
người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao
(HPLC).

r
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tôt nghiệp
Nguyễn Thị Thơm 25 K36B- Hóa Học