Thiết kế t - vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme xcmi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



LƯƠNG THỊ THÚY HẰNG


Tên đề tài:
“THIẾT KẾ T- VECTOR DÙNG CHO TÁCH DÒNG PHÂN TỬ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME XcmI”




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC




Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : CNSH & CNTP
Lớp : 42 - CNSH
Khoá học : 2010 – 2014
Giảng viên hướng dẫn : TS. Dương Văn Cường
Khoa CNTP – CNSH - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014
LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn,
chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành
luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn
Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học
và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Ma Thị Trang cùng các cán bộ, các anh
chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ,
tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và
bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá
trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Xin trân trọng cảm ơn !
Thái nguyên, ngày 05 tháng 06 năm 2014
Sinh viên

Lương Thị Thúy Hằng
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Amp : Ampicillin
Bp : Base pair- Cặp bazơ nitơ
Cs : Cộng sự

DNA : Deoxirybonucleic Acid
dNTP : Deoxyribonucleotide Triphosphas
dATP : DeoxyAdenine Triphosphat
dGTP : DeoxyGuanine Triphosphat
dCTP : DeoxyCytosine Triphosphat
dTTP : DeoxyThymineTtriphosphat
E. coli : Escherichia coli
IPTG : Isopropyl Thiogalactoside
LB : Lauria Broth
NIT
: Vector NTI Advance 11.5
Kb : Kilo base- Kilo bazo nito
PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction
X-gal : 5-brome-4chloro-3-indoly-β-D-galactoside
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Mô hình minh họa phương pháp tách dòng TA (Hermosa,
Grondona et al. 2001) 7
Hình 2.2: Quy trình tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase 8
Hình 2.3: Thiết kế T-vector sử dụng enzyme Eam1105I 9
Hình 2.4: Trình tự và vị trí cắt của enzyme XcmI 10
Hình 2.5: A- Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối 35
Hình 3.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T 13
Hình 3.2. Quy t thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm ……………… ….19
Hình 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR……………………………… 28
Hình 4.1: A- Kết quả tạo vector pTZ57R/T dạng vòng 31
Hình 4.2. Kết quả thiết kế adapter in silico 32
Hình 4.3: Kết quả tạo adapter 33
Hình 4.4: Cắt mở vòng vector pTZ57R/T 34
Hình 4.6: Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI 36

Hình 4.7: Kết quả tạo T-vector pTUAF 37
Hình 4.8: A: Kết quả biến nạp gen ech vào T-vector pTUAF
B: Kết quả biến nạp gen ech vào T-vector thương mại
InsTAclone
TM
của hãng thermo scientific………………………38
Hình 4.9: Kết quả sàng lọc dòng bằng kích thước 39
Hình 4.10: Kết quả chọn lọc dòng bằng phương pháp PCR 39
Hình 4.11: Kết quả cắt kiểm tra gen ech 40
Hình 4.12: A-thiết kế adapter với hai đầu dính là trình tự nhận biết của
enzyme Bam HI 41
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất 2
Bảng 3.1. Các thành phần của InsTAclone PCR cloning 15
Bảng3.2: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 16
Bảng 3.3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 17
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng lai hai đoạn oligonucleotid 20
Bảng 3.5: Chu trình nhiệt lai tạo adapter 21
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt đồng thời hai enzyme giới hạn (tổng thể
tích 30 µl) 23
Bảng 3.7:Thành phần phản ứng gắn nối 25
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng cắt một enzyme (tổng thể tích 30 µl) 26
Bảng 3.9: Thành phần phản ứng gắn nối (tổng thể tích 30 µl) 26
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng PCR 28
Bảng 3.11: thành phần phản ứng cắt đồng thời với SacI và EcoRI 29
Bảng 4.1: So sánh quy trình tạo T-vector 43
MỤC LỤC
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3. Mục đích nghiên cứu 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học 3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn. 3
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Cơ sở khoa học 4
2.1.1. Tách dòng gene từ sản phẩm PCR 4
2.1.1.1. Phương pháp tách dòng đầu bằng 4
2.1.1.2. Phương pháp tách dòng đầu dính 5
2.1.1.3. Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector 6
2.1.2. Các phương pháp tạo T-vector 7
2.1.2.1. Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của
enzyme Taq DNA polymerase. 7
2.1.2.2. Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I 9
2.1.2.3. Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI 9
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 10
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11
Hình 2.4: Kết quả tạo adapter (Aranishi and Okimoto 2004) 11
CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 13
3.1. Đối tượng nghiên cứu 13
3.2. Nội dung nghiên cứu 18
3.2.1. Nội dung 1: Thiết kế T-vector pTUAF 18
3.2.2. Nội dung 2: Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh
hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAclone
TM
của hãng Thermo scientific. . 18
3.3. Phương pháp nghiên cứu 19

Hình 3.2. Quy trình thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm 19
3.3.1. Thiết kế T-vector pTUAF 20
3.3.1.1. Thiết kế adapter 20
3.3.1.2. Gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T 21
3.3.2. Ứng dụng T–vector pTUAF trong tách dòng TA và đánh giá hiệu quả
tách dòng 26
3.3.2.1. Thực hiện phản ứng TA cloning 26
3.3.2.2. Phương pháp biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào vi khuẩn E. coli
DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt. 27
3.3.2.3. Đánh giá hiệu quả tách dòng 27
Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
4.1. Kết quả 30
4.1.1. Kết quả thiết kế T-vector pTUAF 30
4.1.1.1. Kết quả lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu 30
4.1.1.4. Kết quả gắn adapter vào vector PTZ57R/T tạo ra T-vector pTUAF . 33
4.1.2. Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu
suất tách dòng với bộ KIT InsTAclone
TM
. 37
4.1.2.1. Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng 37
4.1.2.3. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR 39
4.1.2.4. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ
giới hạn 40
4.2. Thảo luận 41
4.2.1. Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một
enzyme giới hạn. 41
4.2.2. So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme
XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq
DNA polymerase. 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1. Kết luận 45
2. Kiến nghị 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
1. Tài liệu trong nước. 46
2. Tài liệu nước ngoài 46


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Tách dòng gene là một phương pháp phổ biến trong công nghệ DNA
tái tổ hợp. Phương pháp tách dòng phổ biến nhất là sử dụng enzyme DNA
ligase để tạo liên kết hóa trị giữa các đầu tương thích của đoạn DNA cần tách
dòng và vector plasmid.
Polymerase Chain Reaction (PCR) là một phản ứng khuếch đại một
trình tự DNA đặc hiệu từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu. Kĩ thuật này
được phát minh cách đây hơn một thập kỉ và cho đến nay đã trở thành kĩ thuật
nền tảng căn bản cho tất cả các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử trên toàn
thế giới (Kolmodin and Birch 2002). Mặc dù sản phẩm PCR có thể sử dụng
trực tiếp trong nhiều ứng dụng, nhưng một số ứng dụng yêu cầu sản phẩm
PCR phải được tách dòng và duy trì trong một vector (Kolmodin and Birch
2002). Vì hầu hết sản phẩm PCR đều có gốc Adenine ở 2 đầu 3’ bởi hoạt tính
Terminal transferase của enzyme Taq polymerase nên T-vector được thiết kế
có thymidine ở 2 đầu 3’ của T-vector và Adenosine ở đầu 3’ của sản phẩm
PCR được gọi là “ TA cloning” (Vries 1998).
Do hiệu quả của tách dòng TA cao, phương pháp này đã được thương
mại hóa dưới dạng các bộ KIT. Mỗi bộ KIT tách dòng bao gồm 2 thành phần
chính đó là T-vector và enzyme T4 DNA ligase, trong đó thành phần thứ 2 có
thể được mua riêng biệt với giá rẻ hơn đáng kể. Vì vậy, giá trị của bộ KIT

tách dòng TA thực chất nằm ở T-vector. Trong thực tiễn nghiên cứu tại Việt
nam các nguồn vật liệu dùng trong tách dòng gen chủ yếu là sản phẩm thương
mại. T-vector thương mại thường được sử dụng tại các phòng thí nghiệm cho
hiệu quả tách dòng cao nhưng chi phí cũng cao (bảng 1.1).



2
Bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất
Tên hãng Số phản ứng Chi phí (VND)
Thermo scientific
( Mỹ)
10 3.200.000
30 4.500.000
Qiagene
( Đức)
10 3.400.000
40 5.700.000
Invitrogen
( Mỹ)
20 4000.000
40 5.800.000
Bioneer
(Hàn Quốc)
20 3.500.000
40 5.600.000

Hiện nay T-vector được tạo ra bằng một số phương pháp bao gồm
terminal trasferase và dùng enzyme giới hạn như EcoRV, Eam1105I (Chen,
Songkumarn et al. 2009), XcmI (Borovkov and Rivkin 1997) (Testori,

Listowsky et al. 1994). Trong đó phương pháp sử dụng enzyme XcmI để tạo
T-vector là phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả tách dòng cao (93%)
(Arashi-Heese, Miwa et al. 1999).
Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách
dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo
ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần
làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tạo được T-vector pTUAF
- Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng phân tử
1.3. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế thành công T-vector pTUAF bằng phương pháp sử dụng
enzyme XcmI phục vụ cho tách dòng phân tử.


3
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo điều kiện để phát triển các hướng
nghiên cứu thiết kế T-vector bằng việc sử dụng enzyme XcmI trên các vector
khác nhau.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn.
Sản phẩm T-vector có thể được tạo ra với số lượng lớn nhằm đáp ứng
nhu cầu tách dòng gene trong các phòng thí nghiệm và làm giảm chi phí cho
các nghiên cứu về sinh học phân tử.



4
PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cơ sở khoa học
2.1.1. Tách dòng gene từ sản phẩm PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) là kỹ
thuật phân tử ngày càng phổ biến trong ngành khoa học sinh học và y học
hiện đại. Vì vậy hệ thống tách dòng của sản phẩm PCR nhanh chóng trở thành
sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học (Ido and Hayami 1997).
Tách dòng gen thành công từ sản phẩm PCR là một bước quan trọng để
phân tích đoạn DNA kép được khuếch đại, mặc dù việc này còn gặp khó
khăn. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng cho tách dòng
sản phẩm PCR (Borovkov and Rivkin 1997) như: Tách dòng đầu bằng, tách
dòng đầu dính và tách dòng TA. Để chọn một phương pháp tách dòng phù
hợp cần dựa vào mục đích tách dòng, vector tách dòng (đầu bằng hoặc đầu
dính) và sản phẩm PCR được tạo ra có đầu treo hoặc đầu bằng do các DNA
polymerase khác nhau tạo ra sản phẩm PCR với kết thúc khác nhau, phù hợp
cho vector tách dòng đầu bằng hoặc đầu dính. Đối với tách dòng sản phẩm
PCR có kích thước lớn (ví dụ hơn 10kb) vượt quá khả năng tách dòng của các
vector thông thường thì dùng vector cosmid hoặc λDNA (Bi 2002)
2.1.1.1. Phương pháp tách dòng đầu bằng
Tách dòng đầu bằng là một trong các phương án được sử dụng để tách
dòng sản phẩm PCR. Trong phương pháp này sản phẩm PCR đầu bằng và
vector cũng có đầu bằng có thể được nối lại với nhau (Bi 2002).
Để tạo sản phẩm PCR với kết thúc đầu bằng mà không qua các bước
biến đổi sau PCR thì cách đơn giản nhất là lựa chọn enzyme DNA
polymerase chịu nhiệt tạo sản phẩm PCR đầu bằng, ví dụ như Vent và Tth, do
chúng có hoạt tính 3’-5’ exonuclease (Lohff and Cease 1992). Tuy nhiên, ở


5
khoảng thời điểm những năm 1990 thì những enzyme DNA polymerase chịu

nhiệt tạo ra sản phẩm đầu bằng có tỉ lệ lỗi cao hơn so với enzyme Taq DNA
polymerase. Vấn đề đặt ra khi sử dụng Taq cho mục đích tách dòng đầu bằng
đó là enzyme này có hoạt tính terminal transferase có thể gắn thêm một
nucleotide adenine vào đầu 3’-OH cuối cùng mỗi mạch của sản phẩm PCR
(Clark 1988) gây cản trở việc nối sản phẩm PCR với vector đầu bằng. Để khắc
phục khó khăn này, đã có một số giải pháp đề ra. Thứ nhất, sản phẩm PCR được
xử lý với đoạn Klenow của DNA polymerase I Thứ hai, sử dụng T4 (Skryabin
and Vassilacopoulou 1993, Costa and Weiner 1994) hoặc pfu polymerase (Costa
and Weiner 1994) để tạo đầu bằng của đoạn DNA cuối cùng.
Mặc dù có thể sử dụng một số phương pháp để khắc phục nhược điểm
nhưng khi đó thao tác thí nghiệm trở nên cồng kềnh, phức tạp, mất nhiều thời
gian Hơn nữa, tách dòng đầu bằng còn có một yếu điểm rất đáng kể đó là xu
hướng tự nối của vector cao dẫn đến các dòng mang vector tái tổ hợp thấp
(Costa, Grafsky et al. 1994).
2.1.1.2. Phương pháp tách dòng đầu dính
Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp sử dụng đầu bằng
trong tách dòng sản phẩm PCR thì một phương án khác có thể cân nhắc đó là
tách dòng đầu dính. Trên thực tế phương pháp này đã được sử dụng trong một
số phòng thí nghiệm. Vị tri cắt giới hạn của enzyme bất kì có thể được đưa
vào đầu 5’ kết thúc của mồi và bám vào trong sản phẩm PCR. Sau khi cắt bởi
các enzyme giới hạn tương ứng thì hai đầu kết thúc của sản phẩm PCR được
tạo ra là đầu dính. Sản phẩm PCR được cắt tạo đầu dính nối với vector cũng
được cắt tạo đầu dính tương ứng, hiệu quả trong tách dòng đầu dính là tương
đối hiệu quả (Scharf, Horn et al. 1986, Gal, Schnell et al. 1999).
Tuy nhiên một vài khó khăn thường gặp trong tách dòng đầu dính đó là
nhiều enzyme cắt hạn chế cắt không hiệu quả khi vị trí nhận biết của enzyme


6
nằm ở đầu 5’ của sản phẩm PCR mạch kép. Đặc biệt những vị trí này ở gần

hoặc gần cuối cùng của đầu 5’ (Jung, Pestka et al. 1990, Kaufman and Evans
1990). Điều này có thể dẫn đến kết quả là sự liên kết không ổn định của
enzyme cắt giới hạn với điểm cuối của DNA. Một giải pháp có thể khắc phục
được vấn đề này là thêm một nucleotide vào đầu 5’ ngoài vị trí cắt giới hạn,
nhưng điều này làm tăng chi phí tổng hợp mồi và cũng có thể làm giảm hiệu
quả nối của mồi với khuôn.
2.1.1.3. Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector
Khắc phục những nhược điểm của hai phương pháp trên thì việc sử
dụng T-vector cho tách dòng phân tử được coi là phương pháp dễ dàng, tiết
kiệm thời gian, công sức và có hiệu quả cao. Nền tảng của phương pháp này
dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase đã
thêm một nucleotide đơn vào đầu 3’-OH cuối cùng của đoạn khuếch đại, điển
hình là adenosine (Clark, 1988). Sản phẩm PCR có một nucleotide adenosine
nhô ra ở đầu 3’-OH ở hai đầu đoạn DNA khuếch đại. Do đó, sản phẩm PCR
này có thể được tách dòng bằng cách đưa vào một vector có một nucleotide
đơn Thymidine nhô ra ở đầu 3’-OH (Hình 2.1) mà không cần qua các bước xử
lí sản phẩm sau PCR. Phương pháp này được gọi là Tách dòng TA (TA
cloning) và vector đó được gọi là T-vector. (Clark 1988).




7

Hình 2.1: Mô hình minh họa phương pháp tách dòng TA (Hermosa,
Grondona et al. 2001)
2.1.2. Các phương pháp tạo T-vector
2.1.2.1. Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của
enzyme Taq DNA polymerase.
Dựa vào hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA
polymerase gắn thêm một trong 4 loại nucleotid vào đầu 3’-OH cuối cùng của
sản phẩm PCR, một phương pháp thiết kế T-vector được tạo ra sử dụng
enzyme cắt đầu bằng kết hợp với hoạt tính terminal transferase.
Vector được cắt với enzyme giới hạn tạo đầu bằng EcoRV hoặc các
enzyme tạo vector đầu bằng khác có vị trí nhận biết trên vector, được ủ với
Taq polymerase (1 đơn vị/µg cho tổng thể tích là 20µl), sử dụng buffer


8
(50mM KCl, 10mM Tris pH: 8.3, 1.5mM MgCl
2
và 200µg/ml BSA) trong sự
có mặt của 2mM dTTP, ủ ở 70
o
C trong 2 giờ, kết quả là thêm một thymidine
vào đầu 3’ cuối cùng của mỗi mạch của vector mạch thẳng. T-vector sau khi
được tinh sạch và cô đặc (hình 2.2), được sử dụng cho tách dòng sản phẩm
PCR (Hong, Choi et al. 2009).

Hình 2.2: Quy trình tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase
Sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel và được nối với T-vector ở 14
o
C.
Vector và sản phẩm PCR được nối với nhau bởi liên kết phosphodiester giữa
đầu 5’-P của vector và nhóm 3’-OH của sản phẩm PCR. Phương pháp này
hạn chế được khả năng vector tự đóng vòng do có một nucleotide thymidine
thò ra ở đầu 3’-OH (Holton and Graham 1991). Giải trình tự của các dòng
Cắt mở vòngvector
b
ằng
Eco
RV

dTTP, Taq và thu
nh
ận T
-
vector

9
chứa đoạn chèn cho thấy có sự liên kết của một cặp T:A giữa vị trí của enzyme
EcoRV và trình tự mồi của sản phẩm PCR. Chứng tỏ T-vector đã được tạo thành
công . Phương pháp này tạo vector có đầu dính cho hiệu quả tách dòng cao hơn so
với tách dòng đầu bằng mà không cần sửa đổi sản phẩm PCR .
2.1.2.2. Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I
Dựa vào đặc diểm khi cắt bằng enzyme Eam1105I, sẽ tạo ra một đầu
thò T (Thymidine), do đó đã có nghiên cứu thiết kế hai đoạn oligonucleotid
chứa hai vị trí cắt của Eam1105I được lai với nhau tạo thành mạch kép, sau
đó gắn vào vector mong muốn. Vector được gắn đoạn oligonucleotide mạch
kép chứa vị trí cắt của Eam1105I được cắt bằng enzyme Eam1105I tạo ra T-
vector với sự thò ra của nucleotide T ở hai đầu phục vụ cho tách dòng sản
phẩm PCR (Ido and Hayami 1997). Kết quả thiết kế adapter được thể hiện ở
hình 2.3





Hình 2.3: Thiết kế T-vector sử dụng enzyme Eam1105I
2.1.2.3. Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI
Cũng giống như enzyme Eam1105, khi cắt tại vị trí nhận biết enzyme
XcmI tạo ra 1 nucleotid thymidine đơn thò ra ở đầu 3’ của mỗi mạch đơn của
đoạn DNA. Tuy nhiên, thiết kế một vị trí duy nhất như vậy sẽ tạo ra một
Adenosine ở đầu 5’-OH trên một sợi và một thydimidine thò ra ở sợi đối
diện. Chính vì lý do này nên đòi hỏi cần có hai vị trí của enzyme XcmI để khi
cắt ở hai vị trí nhận biết của XcmI sẽ tạo ra T ở đầu 3’-OH của mỗi sợi.

10
Cùng có đặc điểm tạo ra đầu thò T khi cắt enzyme song XcmI có ưu
điểm hơn so với Eam1105 trong thiết kế T-vector. Bởi vì trên các vector tách
dòng thường có vị trí cắt của Eam1105, nhưng lại không nằm trong vùng đa
tách dòng do vậy không thể sử dụng luôn để tách dòng sàng lọc khuẩn lạc
xanh trắng, nếu chèn trình tự của enzyme này vào vùng đa tách dòng, khi cắt
cấu trúc của vector sẽ bị phá hỏng thay vì chỉ cắt mở vòng theo mong đợi.
Trong khi đó, enzyme XcmI hầu như không có trên các vector tách dòng, vì
vậy ta có thể chèn trình tự nhận biết enzyme này vào vùng MCS của vector
mà vẫn duy trì hoạt động của một T-vector bình thường.

Hình 2.4: Trình tự và vị trí cắt của enzyme XcmI
Theo cách này có thể thiết kế một T-vector bằng cách chèn một đoạn
oligonucleotid ngắn chứa hai vị trí cắt của enzyme XcmI. Khi đưa vào trong
vector, vị trí này cho phép có thể thiết kế T-vector khi cắt với XcmI. Trình tự
nhận biết của enzyme XcmI là 5’CCANNNNNNNNNTGG 3’, các nucleotide
ở giữa có thể thay đổi (Arashi-Heese, Miwa et al. 1999),
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, năm 2005 Phan Trọng Hoàng và cộng sự đã thiết kế thành
công vector tách dòng TA bằng việc chèn đoạn adapter dài 36bp, hai đầu của
adapter là vị trí nhận biết của enzyme BamHI và đoạn adapter được chèn vào


11
vị trí đa tách dòng của vector pUC được cắt mở vòng với BamHI. Hiệu quả
tách dòng đạt 91,4 % khi tiến hành tách dòng sản phẩm PCR dài 953 bp (Phan
Trọng Hoàng et al, 2005).
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1999, tác giả Norika Arashi-Heese và cộng sự đã thiết kế thành
công T-vector với đoạn oligonucleotid mạch kép với hai đầu là vị trí nhận biết
của enzyme EcoRI, chứa hai vị trí nhận biết của enzyme XcmI. Đoạn
oligonucleotid này đươc đưa vào vector pGEMTA cắt mở vòng bằng EcoRI.
Sử dụng T-vector tạo ra tách dòng sản phẩm PCR, hiệu suất tách dòng đạt
hơn 90% (Arashi-Heese, Miwa et al. 1999).
Năm 2001, Chulman Jo và Sanngmee Ahn Jo đã thiết kế thành công T-
vector với đoạn chèn được thiết kế đầu dính là vị trí nhận biết của enzyme
BamHI và NcoI, chứa hai vị trí cắt của enzyme XcmI được đưa vào vector
pNB-T phát triển từ vector pBluescrips SK(+) cũng được tạo đầu dính bằng
cắt mở vòng với hai enzyme BamHI và NcoI. Hiệu quả tách dòng được đánh
giá khi tiến hành tách dòng đoạn DNA có độ dài hơn 500bp ( glyceraldehyde-
3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene) và đạt hiệu suất tách dòng gần
90% (Jo and Jo 2001).
Năm 2004, Futoshi Ananishi và Takane Okimoto thiết kế T-vector
bằng việc đưa đoạn adapter có độ dài 36bp được thiết kế hai đầu là vị trí của
enzyme Xbal chứa vị trí cắt của enzyme XcmI và vector pEMBL19 được cắt
mở vòng bằng enzyme Xbal. Kết quả thiết kế được thể hiện ở hình 2.5




Hình 2.5: Kết quả tạo adapter (Aranishi and Okimoto 2004)


12
Tiến hành tách dòng thử nghiệm với sản phẩm PCR chọn lọc được 86
trên 108 khuẩn lạc trắng (hiệu suất tách dòng gần 80%) (Aranishi and
Okimoto 2004).
Năm 2009, Yaofeng Zhao và cộng sự đã đưa đoạn oligonucleotid mạch

kép được thiết kế hai đầu là vị trí nhận biết của enzyme bamHI, chứa hai vị trí
cắt của enzyme XcmI vào vector pGEM 5Zf(+) được cắt với enzyme tương
ứng. Tiến hành thử nghiệm T-vector bằng việc tách dòng sản phẩm PCR có
kích thước 80bp và đạt hiệu suất tách dòng 90%.





13
CHƯƠNG 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu thiết kế pTUAF dựa trên vector
pTZ57R/T thương mại của hãng Thermo Scientific.
Vector pPTZ57R/T là vector tách dòng TA, mạch thẳng có kích thước
2886 bp được thiết kế có đầu dính là một nucleotide Thymine sử dụng để tách
dòng gene trực tiếp từ phản ứng PCR.

.







Hình 3.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T
Trong cấu trúc của vector tách dòng pTZ57R/T có hai hệ thống chọn
lọc, hệ thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin (Amp

resistant gene) và hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống Lac- Operon. Hai hệ
thống này cho phép chọn lọc các dòng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp chứa
đoạn xen mong muốn.
Hệ thống chọn lọc thứ nhất là gene kháng kháng sinh ampicilin mã hóa
cho enzyme β-lactamase phân hủy kháng sinh, cho phép chọn lọc các tế bào vi
khuẩn chứa vector pTZ57R/T và ngăn ngừa sự nhiễm của các vi sinh vật khác.


14
Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống Lac-Operon, chứa gen LacZ mã
hóa cho enzyme β-galactosidase, enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân
lactose thành glucose và galactose cung cấp năng lượng cho tế bào, đồng thời
enzyme này còn xúc tác chuyển hóa một phần lactose thành allolactose có tác
dụng kích thích sự biểu hiện của Operon Lac. Trong vector pTZ57R/T, gene
LacZ được thiết kế nằm ở hai đầu đoạn xen, khi không có đoạn xen vào trong
vector thì gene LacZ là một gene hoàn chỉnh và có khả năng tạo ra enzyme β-
galactosidase lên men lactose. Nếu có đoạn chèn trong vector thì gene LacZ
không hoàn chỉnh, do đó nó sẽ không thể tạo ra enzyme β-galactosidase và
không thể lên men lactose được. Hệ thống chọn lọc này dùng để xác định xem
plasmid của các vi khuẩn phát triển trên môi trường chọn lọc có mang đoạn
chèn hay không bằng cách xác định hoạt tính lên men lactose của vi khuẩn
trong môi trường nuôi cấy có chứa đường lactose. Có thể xác định hoạt tính
của β-galactosidase bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch có chứa cơ
chất màu X-gal cùng chất cảm ứng IPTG. Khi gene LacZ hoạt động sẽ kết
hợp với X-gal giải phóng phần mang màu tạo khuẩn lạc có màu xanh đậm,
điều này cũng có nghĩa là đoạn chèn không được gắn vào vector. Khi gene
LacZ bị bất hoạt phần mang màu không được giải phóng nên khuẩn lạc có
màu trắng, đồng nghĩa với việc đoạn chèn đã được nối vào vector và đó là
những khuẩn lạc mong muốn.
Trong vị trí của Lac-operon còn có vị trí đa tách dòng gồm vị trí cắt của

các enzyme giới hạn: EcoRI, EcI136II, SacI, Acc65I, KpnI, Bsp68I,
Mva1269I, Mph1103I, XbaI, BamHI, Cfr9I, Eco88I, SmaI, ApaI, Bsp120I,
HincII, SacII, XmiI, pstI, AlfI, Eco147I, paeI, HindIII. Tại vị trí đa tách dòng,
vị trí của enzyme giới hạn được quan tâm trong đề tài này là enzyme EcoRI
và BamHI, hai enzyme này được sử dụng để cắt mở vòng vector pTZ57R/T
phục vụ cho việc tạo T-vector. Ngoài ra vị trí của enzyme XcmI trên vector


15
pTZ57R/T được quan tâm nhất bởi nó liên quan đến khả năng sử dụng vector
thích hợp cho việc tạo T-vector bằng enzyme XcmI. Nếu trên vector có chứa vị
trí cắt của enzyme XcmI thì việc tạo T-vector bằng enzyme này là không thể.
Ngoài các thành phần trên vector pTZ57R/T còn có một số thành phần
khác được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các thành phần của InsTAclone PCR cloning
Thành phần Chức năng Vị trí (bp)
Rep(pMB1)
Là một đơn vị sao chép(rep) từ plasmid
pMBI. Chịu trách nhiệm cho việc sao
chép
1122-1736
Điểm khởi đầu sao
chép
Khởi đầu của sự sao chép của vector
pTZ57R/T trong E.coli
1136
bla(Ap
R
)
Tạo ra gen β-lactamase chống lại chất

kháng sinh.Sử dụng cho chọn lọc và
duy trì các tế bào vi khuẩn E.coli tái tổ
hợp
1896-2756
Gene LacZ
Sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng của các
dòng tái tổ hợp
449-739
Vị trí đa tách dòng
Cho phép thiết kế bản đồ, sàng lọc và
cắt kiểm tra đoạn xen
615-695
Vị trí tách dòng
Nucleotide T thò ra ở đầu 3’ cuối cùng
của đoạn DNA sử dụng cho phản ứng
nối với đoạn chèn
650-651
Phage f1 origin Tổng hợp một DNA mạch đơn 2-457

T7 promoter
Phiên mã in vitro của đoạn chèn DNA
với T7 RNA polymerase
697-716
M13/pUC trình tự mối
xuôi
Trình tự của đoạn chèn, colony PCR

599-614
M13/pUC trình tự mồi
ngược

Trình tự của đoạn chèn, colony PCR

735-751
Trình tự mồi T7
promoter
Trình tự của đoạn chèn, colony PCR 697-716



16
Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
a) Hóa chất
Bảng 3.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên hóa chất ĐVT Hãng sản xuất
Agar power Gam Prolabo
Agarose Gam Bio neer
NaOH Gam Merck
NaCl Gam Merck
EDTA Gam Merck
Acid Acetic Ml Merck
Ethanol Ml Merck
Cao nấm men Gam BD-Mỹ
Peptone Gam Usbio-Mỹ
N,N-Dimethylformamide
Ml Merck
Glycerol for Molecular Biology
Ml Merck
Tris HCl
Gam Merck
Tris Base, for Molecular Biology

Gam Merck
X gal Gam Fermentas
Calcium Chloride Gam Merck
IPTG, dioxane-free
Gam Thermo scientific
Enzyme giới hạn EcoRI
Pk Thermo scientific
Enzyme giới hạn BamHI
Pk Thermo scientific
Enzyme giới hạn XcmI
Pk NEB
PCR Mastermix
Pk Thermo scientific
Cặp mồi đặc hiệu nhân gen
Cặp Thermo scientific
Ethidium bromide
Ml Merck
Loading dye
Ml Merck
Ampicilin
Gam Wako
Kit TAcloning
Bộ Thermo scientific
Kit tách plasmid
Bộ Thermo scientific
Kít tinh sạch DNA từ gel agarose
Bộ Thermo scientific


17

b) Thiết bị
Bảng 3.3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
Máy lọc nước siêu sạch Pall Co – UK
Bể rửa sóng siêu âm Jeiotech – korea
Bể ổn nhiệt Techne – OSI
Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức
Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500 – Kodak – USA
Máy lắc SK3000 – Jeotech – Korea
Máy cất nước Canada Bio Water system – Pall
Co.UK
Tủ lạnh -20
o
C; -80
o
C Super freezer Eco130 – Ficchtti –
Italy
Pipette 8- channel Thermo Labsystem – Finland
Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany
Lò vi sóng MS – 2347AR – LG VN
Nồi hấp khử trùng HV - 110 – Hirayama – Japan
Máy vortex Vortex Genius 3 – IKA
Genmany/china
Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu- 425 - 400E - Nuaire – USA
Máy spin down E– centrifuge – WeaItec –
Taiwan/USA
Bộ điện di Scie – plas Ltd - UK
Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore