Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u động vật của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT
CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME
DOXORUBICIN PEG HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT
CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME
DOXORUBICIN PEG HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ
DS. Lê Phương Linh

Nơi thực hiện:
Bộ môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội
Bộ môn Y học cơ sở - Học viện Quân y



HÀ NỘI – 2015
LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:
ThS. Nguyễn Văn Lâm
DS. Lê Phương Linh
Là người thầy, người chị đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Đồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ người
đã trực tiếp giao đề tài và chỉ bảo, định hướng cho em thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, bộ môn Y học cơ sở Học viện Quân y đã
giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người
đã luôn cổ vũ, quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành đề tài.

Hà Nội, tháng 5 năm 2015


Nguyễn Thị Phương Thảo

LỜI CẢM ƠN 3
DANH MỤC BẢNG 9
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 10
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Doxorubicin 2
1.1.1. Đại cương về doxorubicin 2
1.1.2. Tính chất 2
1.1.3. Dược động học 2
1.1.4. Chỉ định 3
1.1.5. Tác dụng không mong muốn 3
1.1.6. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3
1.2. Tổng quan về liposome 4
1.2.1. Định nghĩa 4
1.2.2. Phân loại 4
1.3. Liposome PEG hóa 6
1.3.1. Dược động học của liposome truyền thống 6
1.3.2. Liposome gắn PEG và cơ chế tác dụng 7
1.3.3. Các phương pháp bào chế liposome PEG hóa 8
1.4. Những nghiên cứu gần đây 9
1.5. Sơ lược mô hình đánh giá độc tính của thuốc 12
1.5.1. Các dòng tế bào 12
1.5.2. Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào 13
1.6. Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm 14
1.6.1. Động vật thực nghiệm 14
1.6.2. Phương pháp đánh giá tác dụng 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2. Nguyên vật liệu 15
2.1.3. Phương tiện nghiên cứu 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu. 17
2.3.1. Phương pháp bào chế liposome doxorubicin PEG hóa 17
2.3.2. Phương pháp đánh giá liposome tạo ra 18
2.3.3. Phương pháp đánh giá thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 21
2.3.4. Phương pháp đánh giá độc tính của thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa
trên tế bào ung thư 21
2.3.5. Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome dox PEG hóa trên
khối u chuột 22
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 23
2.3.7. Điều kiện thí nghiệm 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24
3.1. Hoàn thiện quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa quy mô 100 lọ/mẻ 24
3.2. Xây dựng và thẩm định các phương pháp định lượng lipome DOX PEG hóa 29
3.2.1. Thẩm định phương pháp định lượng DOX toàn phần 29
3.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin tự do 32
3.2.3. Thẩm định phương pháp định lượng phospholipid 34
3.3. Đề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa 37
3.4. Đánh giá độc tính của thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa trên dòng tế bào ung
thư 38
3.4.1. Kết quả đánh giá độc tính của thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa trên dòng tế
bào A549 38
3.4.2. Kết quả đánh giá độc tính của thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa trên dòng tế
bào HT29 39
3.5. Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome DOX PEG hóa trên khối u động
vật thực nghiệm 40
3.5.1. Đánh giá tác dụng của liposome DOX PEG hóa đối với kích thước khối u của
chuột cấy dòng tế bào A549 40
3.5.2. Đánh giá tác dụng của liposome DOX PEG hóa đối với kích thước khối u của

chuột cấy dòng tế bào HT29 40
3.6. Bàn luận 41
3.6.1. Về quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa ở quy mô 100 lọ/mẻ 41
3.6.2. Về độc tính của liposome DOX PEG hóa trên tế bào 43
3.6.3. Về đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome dox PEG trên khối u chuột 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1
PHỤ LỤC 5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
1
Chol
Cholesterol
2
DĐVN
Dược điển Việt Nam
3
DLS
Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động
4
DOX
Doxorubicin
5
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - Môi trường cơ bản
dùng cho nhiều dòng tế bào khác nhau
6

DMSO
Dimethyl sulfoxide
7
DMPE
Dimyristoyl phosphatidylethanolamine
8
DPPE
Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine
9
DSPC
1,2-Distearoyl – sn – Glycero – 3 – Phosphocholin
10
DSPE – PEG
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-
[amino(polyethylene glycol)-2000]
11
FBS
Fetal bovine serum – Huyết thanh nhau thai bò
12
GM1
Monosialoganglioside
13
HEPES
N-2- hydroxy ethyl piperazin-N’-2-ethan sulfonic acid
14
HPLC
High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)
15
IC

50

50% Inhibitory concentrations – Nồng độ thuốc ức chế 50%
đối tượng thử
16
KTTP
Kích thước tiểu phân
17
KTTB
Kích thước trung bình
18
MPS
Mononuclear Phagocytic System (hệ thực bào đơn nhân)
19
PEG
Polyethylen glycol
20
PDI
Polydispersity Index - Chỉ số đa phân tán
21
RSD
Relative standard deviation – độ lệch chuẩn tương đối
22
SPC
Soy phosphatidylcholin
23
SRB
Sulforhodamine B
24
TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở
25
TEM
Transmission Electron Microscopy – Hiển vi điện tử truyền
qua
26
TKHH
Tinh khiết hóa học
27
USP
United state Pharmacopoiea (Dược điển Mỹ)
28
UV
Tử ngoại















DANH MỤC BẢNG

Tên bảng
Trang
Bảng 1.1. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
3
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng
15
Bảng 3.1. Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml
29
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác
31
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng
31
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng
33
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống đo quang
34
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính chính xác
36
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng
36
Bảng 3.9. Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất của thuốc tiêm liposome doxorubicin
PEG hóa
37

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình
Trang
Hình 1.1. Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid
2
Hình 1.2. Cấu trúc liposome
4
Hình 1.3. Mô hình liposome đã PEG hóa
5
Hình 1.4. Hiện tượng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ
7
Hình 1.5. Các phương pháp gắn PEG vào liposome
9
Hình 3.1. Sự thay đổi KTTP của liposome sau khi nén ép dưới áp suất và số
chu kì khác nhau.
25
Hình 3.2. So sánh 2 phương pháp đùn tay và nén áp suất cao.
26
Hình 3.3. Ảnh chụp TEM liposome.
26
Hình 3.4. Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa quy mô
100 lọ/mẻ
28
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic
30
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện

tích pic.
33
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ phospholipid và độ
hấp thụ quang.
35
Hình 3.8. Khả năng gây độc trên dòng tế bào A549
38
Hình 3.9. Khả năng gây độc trên dòng tế bào HT29
39
Hình 3.10. Kích thước khối u ở chuột cấy dòng tế bào A549
40
Hình 3.11. Kích thước khối u ở chuột cấy dòng tế bào HT29
40



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Với nhiều ưu điểm và khả năng mang được nhiều loại dược chất, liposome
nhanh chóng trở thành hệ mang thuốc được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trên
thế giới. Ứng dụng lớn nhất của liposome là làm chất mang thuốc điều trị ung thư
và đã có nhiều chế phẩm thương mại được bán trên thị trường như với các dược
chất như doxorubicin (Doxil); amphotericin B (Ambisome)…
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu bào chế liposome với chất mang là thuốc điều
trị ung thư doxorubicin đã được tiến hành, tuy nhiên mới chỉ bào chế được ở thể
tích nhỏ (vài chục ml) do những khó khăn về thiết bị. Đồng thời, phần lớn các
nghiên cứu đều tiến hành với liposome doxorubicin quy ước, chưa có nghiên cứu
nào đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa. Với mong muốn tăng
quy mô bào chế và đánh giá được tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa,

chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối
u động vật của thuốc tiêm liposome Doxorubicin PEG hóa.”
Đề tài gồm có hai mục tiêu chính:
1. Bào chế được liposome doxorubicin PEG hóa ở quy mô 100 lọ/mẻ và xây
dựng TCCS cho thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa.
2. Đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa trên các dòng tế
bào ung thư và so sánh hiệu quả điều trị của các dạng bào chế doxorubicin khác
nhau trên khối u động vật thực nghiệm.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Doxorubicin
1.1.1. Đại cương về doxorubicin

Hình 1.1. Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid [1]
1.1.2. Tính chất
- Dạng bột vô định hình hoặc tinh thế, màu đỏ cam, hút ẩm. Nhiệt độ nóng
chảy 204°C. Tan trong nước, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran. Không tan
trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu [9].
- Dung dịch 0,5% trong nước có pH = 4,0 - 5,5 [27].
- Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [7].
1.1.3. Dược động học
Phân bố: sau khi tiêm tĩnh mạch, nồng độ doxorubicin giảm nhanh do phân
bố đến các mô phổi, gan, tim, thận, lách. Khoảng 50-85% doxorubicin liên kết với
protein huyết tương [10], 15-50% tồn tại ở dạng tự do. Doxorubicin không đi qua
hàng rào máu não [8] nên không có tác dụng trên khối u trong hệ thống thần kinh
trung ương [12].
Chuyển hóa: doxorubicin qua gan chuyển hóa thành doxorubicinol thân
nước, là một aglycones tan kém trong nước, doxorubicinone và 7 –
deoxydoxorubicinone [36].

- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-
((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-
lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8,
9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri
hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-
1-methoxy-5, 12-
napthacenedion [5].
- Công thức phân tử:
C
27
H
29
NO
11
.HCl.
- Khối lượng phân tử: 579,99.
3

Thải trừ: 40 – 50% doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày, 5% bị đào
thải qua nước tiểu trong 5 ngày [20].
1.1.4. Chỉ định
Ung thư vú, u xương ác tính và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản,
u lympho ác tính cả 2 dạng: Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến
giáp. Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang,
ung thư tinh hoàn. Khối u đặc của trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên tế bào thần
kinh, u Wilm [1]
1.1.5. Tác dụng không mong muốn
Doxorubicin là hoạt chất có độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng
và số lần dùng thuốc trong ngày. Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng
tóc, buồn nôn. Theo Muggia cũng cộng sự, 2 – 3% bệnh nhân gặp phải những triệu

chứng như: rụng tóc, buồn nôn và ói mửa khi được điều trị với liều 40 mg/m
2
da
mỗi 2 tuần [13]. Suy giảm chức năng tủy xương là phản ứng có hại rất nhạy với giới
hạn liều dùng nhưng có thể hồi phục. Độc tính với tim là một tác dụng không mong
muốn cần phải hết sức chú ý khi điều trị lâu dài, tổng liều tích lũy không nên vượt
quá 550 mg/m
2
da [22]. Ngoài ra còn một số tác dụng phụ khác như: viêm miệng,
rối loạn tiêu hóa,… Dùng theo đường bàng quang còn có thể gây rối loạn tiếu, nóng
rát bàng quang và niệu đạo [1].
1.1.6. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
Bảng 1.1. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
Dạng bào chế
Tên chế phẩm
Hãng sản xuất
Thuốc tiêm
dung dịch
Adorucin lọ 5 ml, 25 ml, 2 mg/ml
Korea United Pharma
Adriamycin lọ 5 ml, 100 ml 2mg/ml
Pfizer
Doxorubicin Ebewe lọ 5 ml, 25 ml 2
mg/ml
Ebewe Pharma
Bột pha tiêm
Adriblastina lọ 10 mg, 50 mg
Pharmacia Italia
Doxorubicina servycal lọ 10 mg, 50 mg
Laboratorios IMA

4

Thuốc tiêm
liposome
Caelyx lọ 10 ml, 2 mg/ml
Schering
Phospholipidough
Doxil lọ 10 ml, 2 mg/ml
Sequus pharm (USA)
Lipo-DOX lọ 10 ml, 2 mg/ml
TTYBiopharm
Myocet lọ 10 ml, 2 mg/ml
GP – Pharm
1.2. Tổng quan về liposome
1.2.1. Định nghĩa
Liposome là một hệ mang thuốc gồm một hoặc nhiều lớp lipid kép bao
quanh một khoang chứa nước (Hình 1.2), được hình thành một cách tự nhiên khi
phân tán các phân tử phospholipid trong môi trường nước, khi đó đầu thân nước tự
sắp xếp hướng về phía khoang chứa nước, trong khi đuôi dài kị bị đẩy về hướng
ngược lại tạo thành các hạt có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng
chục micromet. [23]

Hình 1.2. Cấu trúc liposome [28]
1.2.2. Phân loại
Đặc điểm nổi bật của liposome là rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, do đó
có rất nhiều cách phân loại liposome. Cách phân loại phổ biến nhất là dựa trên
thành phần cấu tạo và ứng dụng lâm sàng, gồm có các loại sau [30]:
- Liposome dạng quy ước (conventional liposome)
5

Thành phần chỉ gồm phospholipid và (hoặc) cholesterol, thích hợp để mang
các dạng thuốc tác dụng trên hệ thống đại thực bào như các thuốc kháng vi sinh vật,
thuốc điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị ung thư và ngăn chặn khối u phát triển.
Nguyên nhân chính là do liposome dạng này thường nhanh chóng bị bắt giữ bởi hệ
thống đại thực bào đơn nhân và hệ thống lưới nội mô trong cơ thể.
- Liposome tuần hoàn dài (long-circulating liposome)
Bề mặt của liposome thường được gắn thêm các nhóm phân tử thân nước có
kích thước lớn như polyethylenglycol (PEG), ganglioside (GM1), poly [N-(2-
hydroxypropyl)] methacrylamid, poly-N-vinylpyrrolidon, polyvinyl alcol,…[18].
Các nhóm cồng kềnh ở bề mặt này (hình 1.3) có nhiệm vụ ngăn chặn quá trình
tương tác với opsonin huyết tương, ức chế tương tác kỵ nước và tĩnh điện của một
loạt các thành phần trong máu trên bề mặt của liposome làm chậm quá trình nhận
dạng liposome của hệ thống đại thực bào. Một mặt giúp cho liposome tránh được
quá trình bắt giữ của hệ thống đại thực bào, một mặt tạo ra cấu trúc không gian ổn
định, do đó kéo dài được thời gian tồn tại của liposome trong cơ thể [18], [15].

Hình 1.3. Mô hình liposome đã PEG hóa [16]
- Liposome hướng đích chủ động (targeted liposomes)
6

Để tăng tích lũy thuốc dạng liposome tại các đích điều trị mong muốn, cho hoạt
tính điều trị cao hơn và chọn lọc hơn, người ta đã gắn thêm các phối tử (ligand) có
tác dụng hướng đích như các polymer, receptor hoặc kháng thể… vào lớp màng
liposome. Các phối từ này có khả năng nhận biết, hướng đến tế bào đích, hòa màng
và giải phóng dược chất tại đó.
- Liposome cảm ứng (sensitive liposome)
Là các liposome trong thành phần cấu tạo vỏ của có chứa một tỉ lệ nhất định các
chất cảm ứng, đó có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polime có khả năng
bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích
tại mô đích. Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh

như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh
(tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ trường,
nhiệt độ (tác nhân ngoại) [31],[29].
1.3. Liposome PEG hóa
1.3.1. Dược động học của liposome truyền thống
Liposome sau khi tiêm sẽ tương tác với các thành phần trong máu dẫn đến sự
mất ổn định lớp màng kép làm giải phóng các phân tử bên trong liposome vào máu.
Tương tác đầu tiên là với các protein huyết tương. Các protein khi hấp phụ lên bề
mặt liposome có thể làm tăng tính thấm của màng, làm giảm khả năng lưu giữ thuốc
bên trong. Các protein này được gọi là opsonin và quá trình chúng hấp phụ lên bề
mặt liposome gọi là quá trình opsonin hóa [19]. Quá trình này tạo điều kiện cho các
tế bào của hệ thống lưới nội mô (RES) nhận biết và khởi động quá trình thực bào
liposome nhờ tạo ra các vị trí gắn cho receptor của RES [39]. RES là một phần của
hệ thống miễn dịch có chức năng chính là loại bỏ các tác nhân lạ khỏi cơ thể. RES
bao gồm các tế bào như bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, chủ yếu được tìm thấy
trong các tế bào Kruffer ở gan, phổi và lách. Do đó, phần lớn các liposome sau khi
tiêm sẽ được vận chuyển về gan và lách. Các liposome vượt qua được hàng rào trên
sẽ được tích lũy ở đích theo cơ chế chủ động hoặc bị động. Với cơ chế chủ động,
liposome được gắn thêm các yếu tố hướng đích và tích lũy nhờ ái lực với đích.
7

Liposome cũng có thể tích lũy thụ động ở các khối u hoặc các vị trí viêm nhờ hiện
tượng thoát mạch qua các kẽ hở của thành mạch và được giữ lại do giảm sự dẫn lưu
của hệ bạch huyết tại các vị trí này. Hiện tượng này được gọi là hiệu ứng tăng tính
thấm và khả năng lưu giữ (EPR) (Hình 1.4) [30]. Tuy nhiên sự tích lũy thụ động của
liposome tại khối u là quá trình diễn ra tương đối chậm, trong khi các liposome quy
ước nhanh chóng bị thải trừ khỏi hệ tuần hoàn, do đó việc tăng thời gian tuần hoàn
là yêu cầu cần thiết để phát triển hệ mang thuốc dạng liposome.

Hình 1.4. Hiện tượng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ [30]

1.3.2. Liposome gắn PEG và cơ chế tác dụng
Để tăng thời gian tuần hoàn, rất nhiều dẫn chất đã được nghiên cứu để thêm
vào thành phần màng liposome. Trong đó, PEG là một trong các dẫn chất polymer
được chứng minh là có hiệu quả kéo dài thời gian tuần hoàn vượt trội so với các dẫn
chất khác [16]. PEG là một polyme thân nước có khối lượng phân tử từ 750 –
50.000 Da, có những đặc tính tuyệt vời như tan tốt trong nước và nhiều dung môi
hữu cơ, không phân hủy, không tạo thành bất kỳ sản phẩm chuyển hóa nào, độc tính
thấp. PEG gắn vào liposome tạo ra lớp áo thân nước, làm giảm lực hút thân dầu với
các protein, đồng thời các chuỗi dài polyme có vai trò như một rào cản không gian,
vừa ngăn cản sự tương tác với các opsonin và đại thực bào, vừa tạo ra lực đẩy
không gian giữa các liposome, hạn chế được cả sự tương tác giữa các liposome với
8

nhau [30]. Nhờ vậy, lớp bao PEG trên bề mặt liposome có tác dụng kéo dài thời
gian tuần hoàn trong máu của liposome, tăng khả năng đưa thuốc đến mô đích.
Đồng thời, khi thời gian lưu thông trong hệ thống tuần hoàn tăng còn tăng khả năng
tích lũy thụ động của liposome và thuốc tại mô ung thư và các mô bệnh khác, giúp
tăng nồng độ thuốc tại vị trí khối u so với liposome truyền thống, từ đó tăng hiệu
quả điều trị.
1.3.3. Các phương pháp bào chế liposome PEG hóa
Có 2 phương pháp thường được sử dụng để gắn PEG vào liposome [26]
1.3.3.1.Gắn PEG trong quá trình tạo liposome (pre – insertion)
Dẫn chất lipid có gắn PEG sẽ được hòa tan cùng với các thành phần màng vào
pha dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành hydrat hóa tạo màng film tương tự như với
liposome không PEG hóa. Phương pháp này tiến hành tương đối dễ dàng, tuy nhiên
nhược điểm của nó là PEG sẽ phân bố ở cả hai phía của lớp màng kép (hình 1.5a).
PEG phân bố cả phía trong khoang nước sẽ chiếm không gian của dược chất, làm
giảm lượng dược chất được nạp vào chất mang, đồng thời PEG ở khoang nước sẽ
dễ bị thủy phân bởi môi trường acid (khi cần tạo chênh lệch pH để đưa dược chất
vào liposome trống). Kích thước liposome càng nhỏ, ảnh hưởng của PEG ở khoang

nước đến độ ổn định của liposome càng lớn, đặc biệt đối với liposome đa lớp thì thể
tích dược chất mang được giảm xuống rất nhiều.
1.3.3.2. Gắn PEG lên bề mặt các liposome đã tạo thành từ trước
Phương pháp này gồm 2 kỹ thuật:
- Gắn vật lý (post – insertion): nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khả
năng di chuyển của phân tử lipid từ pha lipid này sang pha lipid khác (hình 1.5b).
Trong phương pháp này, các PEG lipid được thêm từ từ vào hỗn dịch liposome đã
tạo ra từ trước ở nhiệt độ gần với nhiệt độ chuyển pha của lipid màng. Để ngăn cản
quá trình tự hình thành các micel của PEG lipid khi thêm vào pha nước, nồng độ
của chúng được duy trì ở dưới nồng độ micel tới hạn, do đó năng lượng nhiệt động
cần đề tạo micel sẽ thấp hơn so với gắn vào lớp màng của liposome. PEG – lipid sẽ
dần dần chuyển sang gắn với màng liposome, kết quả thu được liposome PEG hóa.
9

Ưu điểm của phương pháp này là PEG chỉ gắn ở mặt ngoài của liposome, không
làm giảm không gian bên trong khoang nước của dược chất. Tuy nhiên phương
pháp này có nhược điểm là khả năng chèn PEG – lipid vào bề mặt liposome phụ
thuộc vào chiều dài chuỗi PEG, chuỗi càng dài càng khó gắn.
- Gắn hóa học (post – modification): nguyên tắc của phương pháp là dựa vào
phản ứng hóa học để tạo liên kết đồng hóa trị giữa PEG đã hoạt hóa với nhóm phản
ứng trên bề mặt liposome. Phương pháp này có nhược điểm là dung môi và điều
kiện phản ứng dễ phá vỡ cấu trúc liposome, khó khăn trong việc tách các chất phản
ứng và sản phẩm phụ,… do đó ít được sử dụng hơn.

Hình 1.5. Các phương pháp gắn PEG [26]
1.4. Những nghiên cứu gần đây
Wan-Liang Lu và cộng sự (2004) [24] đã nghiên cứu dược động học, dược
lực học, và độc tính của liposome PEG hóa trên tế bào hepatocarcinoma (Bel7402)
và tế bào hepatocarcinoma chuột (H22) trên mô hình khối u rắn ở chuột xenograft.
Kết quả dược động học ở chuột cho thấy liposome doxorubicin PEG hóa kéo dài rõ

rệt thời gian lưu thông trong máu của doxorubicin. Thời gian bán thải của liposome
doxorubicin dạng PEG hóa, dạng liposome thông thường và dạng tự do tương ứng
là 46,09 ± 14,44, 26,04 ± 3,34, and 23,72 ± 5,13 h. Diện tích dưới đường cong nồng
độ - thời gian (AUC0 - ∞) (h.µg/g) của doxorubicin dạng liposome PEG hóa và
dạng liposome thông thường cao gấp 6,8 và 2,6 lần so với dạng tự do. Khả năng gây
10

độc và hoạt động kháng u in vivo chỉ ra rằng hoạt tính của doxorubicin dạng
liposome PEG hóa là cao hơn so với dạng liposome thông thường hoặc tự do. Sau
hai tuần tiêm tĩnh mạch đuôi với một liều duy nhất 10 mg/kg liposome doxorubicin
PEG hóa, không quan sát thấy tác dụng có hại trong dạ dày, niêm mạc ruột, và cơ
tim, nhưng lại quan sát được trong các nhóm dùng thuốc doxorubicin dạng tự do.
Do cơ chế tích tụ tại khối u của các liposome gắn PEG chủ yếu nhờ sự thoát mạch
qua các mạch máu rò rỉ tại khối u, nên sự tuần hoàn kéo dài có thể sẽ làm tăng tích
tụ tại khối u bằng cách gia tăng sự luân chuyển của liposome PEG hóa qua hệ thống
mao mạch khối u. Các kết quả cho thấy dạng liposome PEG hóa cải thiện hiệu quả
của thuốc và làm giảm độc tính, do đó cung cấp bằng chứng thuận lợi cho việc xây
dựng công thức thuốc dạng liposome PEG hóa.
Aryal và cộng sự (2013) [6] đã nghiên cứu việc kết hợp sóng siêu âm làm
gián đoạn hàng rào máu não và hàng rào máu khối u cùng với liposome doxorubicin
trên chuột có u thần kinh đệm. Việc đưa thuốc vào hệ thống tuần hoàn máu não phải
vượt qua rất nhiều rào cản khác nhau, vì thế liệu pháp chống ung thư não cũng gặp
nhiều khó khăn. Nhóm tác giả đã đánh giá tác động của 3 tuần điều trị bằng sóng
siêu âm và liposome doxorubicin lên chuột có u thần kinh đệm. Tế bào u đệm thần
kinh được nuôi trồng trong muối earle, bổ sung huyết thanh nhau thai bò, 1%
glutamin 1% MEM amino acid và 0.1% gentamicin trong 1 bình chứa 5% CO2 tại
37°C. Sau khi làm sạch da sọ, rạch 1 đường dài 5 mm và tạo 1 lỗ sâu 1 mm vào sọ.
Chuột mẫu được tiêm 4 µl hỗn dịch tế bào ung thư. Mẫu tế bào được tiêm trong 5
phút. Sau 2 phút thì rút ra, và khâu da lại. Ngày thứ 5 bỏ lớp vá da và bắt đầu điều
trị vào ngày thứ 7 hoặc 8. Kết quả nghiên cứu cho thấy những động vật nhận được

cả sóng siêu âm và DOX có thời gian sống trung bình tăng đáng kể so với mẫu động
vật chỉ nhận được 1 trong 2 phương pháp siêu âm hay DOX, hay không nhận được
phương pháp điều trị nào. Thời gian sống trung bình của động vật mẫu điều trị bằng
cả 2 (siêu âm và DOX) tăng 100% so với động vật không được điều trị, trong khi
động vật được điều trị bằng DOX chỉ tăng 16%. Động vật chỉ được điều trị bởi siêu
âm không cho thấy sự tiến triển nào. Không 1 khối u nào được phát hiện trong 4/8
11

nhóm động vật thuộc nhóm điều trị siêu âm + DOX, và trong 2 nhóm động vật còn
lại, chỉ phát hiện rất ít tế bào ung thư. Tóm lại, nghiên cứu chứng minh rằng sử
dụng kết hợp sóng siêu âm và liposome doxorubicin tăng cường khả năng cung cấp
thuốc và có ảnh hưởng tốt tới quá trình điều trị bệnh u thần kinh đệm.
Kenji Yokoi và cộng sự (2014) [40] đã nghiên cứu phương pháp sử dụng
liposome doxorubicin PEG hóa để tăng tích lũy thuốc tại khối u và nâng cao hiệu
quả điều trị. Mặc dù doxorubicin dạng liposome PEG hóa (PEGylated liposomal
doxorubicin – PLD) có thể tốt hơn doxorubicin dạng tự do vì sự tích lũy của PLD
tại khối u nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (EPR), tuy nhiên việc
tăng tỉ lệ sống sót ở những bệnh nhân được điều trị tổng thể với PLD khá khiêm
tốn. Khi các tế bào nội mô khối u bị tổn thương do PLD, tính thấm thành mạch đối
với các đại phân tử có thể được gia tăng lên do sự hình thành các lỗ lớn và sự gián
đoạn của các lớp tế bào nội mô. Sự tổn thương tế bào nội mô và sự gia tăng tính
thấm thành mạch sẽ được dần dần khôi phục bằng các phản ứng tạo mạch của các
mạch máu. Do đó, tác giả đưa ra giả thuyết rằng PLD được tiêm ngay trong khoảng
thời gian khi tính thấm thành mạch tăng do liều điều trị ban đầu, sẽ thoát mạch và
tích lũy nhiều hơn vào khối u so với PLD được tiêm sau khi các mạch khối u đã hồi
phục. Chuột sau khi cấy tế bào ung thư vú 4T1 được tiêm tĩnh mạch với PLD. Để
đánh giá hiệu quả của PLD trên hiệu ứng EPR, FITC-liposome PEG hóa (PFL)
được tiêm trước 1, 2, 3, 5, 7, hoặc 10 ngày sau khi tiêm PLD. Chuột tại mỗi sáu giờ
sau khi tiêm PFL bị giết, số lượng PFL thoát mạch và tích tụ trong khối u cũng như
các cơ quan được đánh giá bằng hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của các mô.

Lượng PFL trong khối u tăng từ ngày 1 so với những con chuột không tiêm PLD.
Lượng đạt tối đa 2 ngày sau khi tiêm và trở về ban đầu ở ngày thứ 7. Các dữ liệu
cho thấy hiệu ứng EPR thay đổi theo thời gian sau khi tiêm PLD. Những hiệu ứng
này chỉ được tìm thấy trong các khối u, không thấy trong các cơ quan bình thường.
Năm 2015, Chastagner cùng cộng sự [11] đã nghiên cứu khả năng làm tăng
tính nhạy cảm bức xạ của khối u đối với hai dạng bào chế liposome chứa
doxorubicin: liposome không PEG hóa và liposome PEG hóa. DOX không được sử
12

dụng để điều trị cho các khối u trong não do không qua được hàng rào máu não, đặc
biệt khi kết hợp với liệu pháp xạ trị có thể gây nên độc tính gây nguy hiểm tính
mạng. Tuy nhiên khi DOX được nạp vào liposome lại có thể vượt qua các rào cản
đó. Nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC để định lượng lượng DOX tập trung
tại khối u trong thời gian điều trị nhất định. Hiệu quả điều trị được đánh giá bằng
cách xác định tỷ lệ động vật thí nghiệm sống sót sau quá trình điều trị. Kết quả, sau
1 tuần điều trị bằng liposome DOX và liệu pháp xạ trị, nồng độ DOX có mặt dịch
não tủy có khối u cao hơn vượt trội so với dịch não tủy không có khối u (gấp 5 lần),
đối với cả liposom không PEG và liposome PEG hóa. Đồng thời, so sánh trực tiếp
giữa liposome PEG hóa và liposome không PEG hóa, kết quả cho thầy sự khác biệt
rõ ràng. Lipsome không PEG hóa ít chịu ảnh hưởng của lịch tiêm thuốc và có xu
hướng giảm mạnh vào ngày 6 và 7, trong khi liposome có mặt PEG giữ được nồng
độ dược chất khá cao và ổn định tại khối u.
Nguyễn Văn Lâm và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc
tiêm liposome DOX 2 mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá tác dụng của
chế phẩm trên khối u động vật. Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat
hóa film có thành phần tạo màng SPC: CHL (10:2), dược chất đưa vào liposome
bằng phương pháp chủ động thông qua sự chênh lệch pH giữa hai bên màng bằng
thay đệm amoni sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến ở môi trường bên ngoài
liposome. Giảm KTTP bằng quá trình siêu âm. Liposome thu được có KTTP < 200
nm, hiệu suất liposome hóa > 80%. TCCS cho thuốc tiêm liposome DOX đã được

đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. Đánh giá tác dụng
của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc tiêm
dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da [5].
1.5. Sơ lược mô hình đánh giá độc tính của thuốc
1.5.1. Các dòng tế bào
Các tế bào ung thư trong một khối u (bao gồm cả tế bào đã di căn) đều xuất
phát từ một tế bào duy nhất phân chia mà thành. Do đó ung thư có thể được phân
loại theo loại tế bào khởi phát và theo vị trí của tế bào đó. Tuy nhiên, trong nhiều
13

trường hợp, người ta không xác định được khối u nguyên phát. Các tế bào thử được
chia thành 4 nhóm chính: Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu
mô (ví dụ như ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hoá); Bệnh lý huyết học ác tính
(hematological malignancy), xuất phát từ máu và tủy xương; ung thư mô liên kết
(sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xương hay cơ; ung thư hắc tố
(melanoma) do rối loạn của tế bào sắc tố.
1.5.2. Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào
Với các tác nhân chống ung thư, chỉ số điều trị được đánh giá dựa vào hiệu
quả điều trị và độc tính. Liposome doxorubicin PEG hóa là một dạng thuốc cải tiến
với mục tiêu tăng hoạt động diệt tế bào ung thư, giảm độc tính, tăng thời gian lưu
thông trong hệ thống tuần hoàn. Để đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư, cần
tiến hành đánh giá độc tính trên tế bào. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường,
nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau đó mang đánh giá độc tính của thuốc bằng các
phương pháp khác nhau. Có rất nhiều phương pháp đánh giá độc tính tế bào khác
nhau, một số phương pháp thường dùng:
- Thứ nghiệm SRB (sulforhodamine B) : Phép thử tiến hành xác định tổng hàm
lượng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi
protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). SRB là một thuốc
nhuộm màu hồng sáng với hai nhóm sulfonic tích điện âm, hai nhóm này sẽ liên kết
tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein. Giá trị OD máy đo được tỉ lệ

thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng
protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [32].
- Phương pháp nghiên cứu sàng lọc MTT: Phương pháp này dựa trên hoạt
động của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào sống có khả năng
chuyển hóa chất MTT (3 - (4,5 - Dimethylthiazol – 2 – yl) – 2,5 –
diphenyltetrazolium bromide) thành một sản phẩm có màu không tan trong nước
nhưng tan trong các dung dịch hòa tan MTT. Khi các tế bào chết thì ty thể không
còn khả năng chuyển hóa MTT thành chất màu. Sản phẩm tạo ra từ phản ứng MTT
có màu đặc trưng và có thể định lượng bằng cách đo mật độ quang với bước sóng
14

hấp thụ đặc trưng bằng máy đọc ELISA. Mật độ quang tạo ra từ phản ứng MTT cho
phép xác định sự tương quan về số lượng tế bào sống/chết có mặt trong các giếng
nuôi cấy [14],[3].
- Phương pháp đếm tế bào với xanh Trypan: Phương pháp này sử dụng xanh
trypan nhuộm màu tế bào để xác định trực tiếp số lượng tế bào sống hay chết trong
buồng đếm. Xanh trypan là loại thuốc nhuộm chỉ có thể đi qua màng tế bào chết. Do
đó khi trộn dịch tế bào với thuốc nhuộm các tế bào chết sẽ phồng to lên và có màu
xanh đen [35].
1.6. Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm
1.6.1. Động vật thực nghiệm
Động vật thí nghiệm dùng để đánh giá tác dụng rất đa dạng, chủ yếu tiến
hành trên các chủng chuột như: BALB/c. C3H/HeJ, Swiss, SCID nude, NMRI, SLC
Wistar/ST [5]. Chuột có thể bị cắt bỏ tuyến ức, dẫn đến giảm số lượng tế bào miễn
dịch lympho T, làm giảm khả năng đào thải khối u và các mảnh ghép [17].
1.6.2. Phương pháp đánh giá tác dụng
Động vật thực nghiệm là chuột thường chọn những con từ 6 – 8 tuần tuổi,
nặng từ 20 – 26g với chuột nhắt và 250 – 300g với chuột cống. Các tế bào sau khi
nuôi cấy sẽ được đem cấy truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm, vị trí cấy khác
nhau tùy thuộc vào loại tế bào ung thư. Với sự cấy truyền u vào cơ thể chuột có thể

tiến hành bằng cách ghép khối u hoặc tiêm hỗn dịch của tế bào u từ cơ thể chuột đã
mang u sẵn sang cơ thể chuột thực nghiệm. Số lượng tế bào mang cấy khoảng 10
5
–
10
7
/động vật. Sau đó, chuột được chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng
các công thức khác nhau. Liều tiêm tùy thuộc từng thí nghiệm. Thời điểm bắt đầu
tiến hành cũng rất khác nhau tùy từng thí nghiệm, có thể điều trị ngay sau khi cấy
truyền tế bào thành công, cũng có thể để khối u phát triển một cách chắc chắn.

15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Liposome DOX PEG hóa.
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng.
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu
chuẩn
1
Doxorubicin hydroclorid
Ấn Độ
USP
2
Cholesterol

Sigma Aldrich
USP
3
Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã
hydrogen hóa (HSPC)
Lipoid
USP
4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-
phosphoethanolamine-N-
[amino(polyethylene glycol)-2000]
Lipoid
USP
5
Ethanol tuyệt đối
Trung Quốc
TKHH
6
Acid citric
Trung Quốc
TKHH
7
HEPES
(N-2-hydroxy ethyl piperazin – N –
2 – ethan sulfonic acid)
Mỹ
USP
8
Acid phosphoric
Merk - Đức

TKHH
9
Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether)
Amresco Ohio-Mỹ
TKHH
10
Túi thẩm tích
Spectrum laboratory-Mỹ
TCCS
11
Natri hydroxid
Trung Quốc
TKHH
12
Natri clorid
Trung Quốc
TKHH
13
Methanol
Merk – Đức
USP
14
Acetonitril
Merk – Đức
USP