Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



PHẠM THỊ PHƢƠNG


NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI NANG
PROBIOTICS BẰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐÔNG TỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



HÀ NỘI - 2015



BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


PHẠM THỊ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI NANG
PROBIOTICS BẰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐÔNG TỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công nghiệp Dƣợc
2. Viện Công nghệ Dƣợc phẩm
Quốc gia


HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn
chân thành tới: PGS. TS Nguyễn Ngọc Chiến - Giảng viên bộ môn Công nghiệp
Dược – trường Đại học Dược Hà Nội - người thầy đã luôn tận tình giúp đỡ, hướng
dẫn và chỉ bảo tôi trên con đường học tập, rèn luyện và nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân - Giảng viên bộ môn
Công nghiệp Dược - trường Đại học Dược Hà Nội - người cô đã luôn tận tình giúp
đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên
cứu để hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Hạnh Thủy, ThS. Bùi Thị
Lan Phƣơng, thầy giáo Nguyễn Ngọc Khánh cũng toàn thể các thầy giáo, cô giáo
và các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược - những người đã luôn giúp
đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu đề hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn
bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại
trường Đại học Dược Hà Nội.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Phạm Thị Phƣơng


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về probiotics 2
1.2. Loài Lactobacillus acidophilus 3
1.3. Tổng quan về dạng bào chế vi nang 6
1.4. Alginat 11
1.5. Chitosan 12
1.6. Một số nghiên cứu về dạng bào chế vi nang probiotics 14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố công thức đến vi nang bào chế được. 23
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố quy trình bào chế đến vi nang 37
3.3. Theo dõi độ ổn định của vi nang trong quá trình bảo quản 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A. Aerogenes
Aerobacter aerogenes
ATCC
Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)
B. longum
Bifidobacterium longum
B. bifidum
Bifidobacterium bifidum
Cfu
Số đơn vị khuẩn lạc (Colony-Forming
Units)
CT
Công thức
E. coli
Escherichia coli
kl/tt
Khối lượng trên thể tích
L. acidophilus
Lactobacillus acidophilus
L. gasseri
Lactobacillus gasseri
L. rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
MRS
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de
Man, Rogosa, Sharpe)

MT
Môi trường
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở
VK
Vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật











DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1.1
Tỷ lệ sống sót của A. aerogenes khi được bảo quản với glycerol ở
-20
o
C
15
2.1

Các nguyên liệu pha môi trường
16
2.2
Tá dược sử dụng
17
2.3
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
17
2.4
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
19
3.1
Công thức bào chế vi nang alginat và chitosan
23
3.2
Kết quả của mẫu CT1 và CT2 trước và sau đông khô
25
3.3
Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ alginat
26
3.4
Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ glycerol
28
3.5
Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi tỷ lệ tinh bột
30
3.6
Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ CaCl
2

32
3.7
Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ chitosan
33
3.8
Kết quả bảo vệ L. acidophilus của alginat và chitosan trong môi
trường acid pH 1,2.
34
3.9
So sánh khả năng bảo vệ VSV trong môi trường acid của các mẫu
36
3.10
Bảng công thức tốt nhất CT35
36
3.11
Đặc tính của vi nang bào chế được khi thay đổi thời gian ủ
37
3.12
Đặc tính của vi nang bào chế khi thay đổi tốc độ khuấy môi trường
38
3.13
Đặc tính của vi nang bào chế khi thay đổi tốc độ nhỏ giọt
39
3.14
Bảng biến thiên số lượng VSV và hàm ẩm trong thời gian bảo quản
40

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
1.1
Các thế hệ bao probiotics
3
1.2
Cấu trúc alginat
11
1.3
Cấu trúc chitosan
13
3.1
Đồ thị diễn số lượng VSV trong các mẫu vi nang khi thay đổi
nồng độ alginat
27
3.2
Đồ thị diễn số lượng VSV trong các mẫu vi nang sau khi thay
đổi nồng độ glycerol
29
3.3
Đồ thị diễn số lượng VSV có trong các mẫu sau khi thay đổi
nồng độ chitosan
33

3.4
Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót trong môi trường acid
35
3.5
Đồ thị biến thiên số lượng VSV và hàm ẩm trong thời gian
bảo quản
40

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn probiotics được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi
ích cho con người: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp
lactose, tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận,
giảm cholesterol máu…[19], [23], [26]. Tuy nhiên, vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng
bởi các yếu tố như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm…[48]. Những yếu tố này giảm
số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột [39].
Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng
mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật
phù hợp và có thể chất thích hợp. Hiện nay, các dạng bào chế probiotics thông dụng
trên thị trường là dạng bột và cốm. Tuy nhiên, việc đảm bảo số lượng vi sinh vật
sống sót và bảo vệ chúng khi sử dụng đường uống là vấn đề lớn do khi sử dụng các
vi sinh vật phải chịu tác động của các yếu tố bất lợi như: pH acid của dạ dày,
enzyme tiêu hóa, muối mật…[23]. Nhiều phương pháp bào chế đã được nghiên cứu
để giảm thiểu ảnh hưởng các yếu tố nêu trên đến vi khuẩn probiotics, trong đó có
phương pháp vi nang hóa.
Vi nang hóa giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi só sự
thay đổi nhiệt độ, pH hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường. Do đó,
làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng độ ổn định. Từ các lý do trên, đề tài:
“Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ” được thực

hiện với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Xây dựng được công thức bào chế vi nang probiotics chứa Lactobacillus
acidophilus bằng phương pháp đông tụ.
2. Xác định một số thông số quy trình bào chế vi nang probiotics bằng phương
pháp đông tụ.



2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về probiotics
Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic” hay
“biosis” từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên probiotics có thể hiểu
theo nghĩa là bất cứ cái gì “thân thiện với đời sống con người”. Hiểu sát hơn, đó là
chất bổ sung chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích. Những loài VK hay sử dụng
trong chế phẩm probiotics thuộc chi Bifidobacterium và chi Lactobacillus [49].
Khái niệm probiotics đầu tiên được đưa ra bởi nhà khoa học Eli Metchnikoff,
ghi trong cuốn sách “kéo dài sự sống” năm 1908. Ông cho rằng những người nông
dân Bulgary sống lâu vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic,
các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột [51].
Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới
(FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotics như sau:
“Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ
đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [49], [30]. Theo đánh giá của tổ chức
FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng khuẩn probiotics sử dụng
dưới dạng thực phẩm là chủng đó phải có khả năng sống sót và phát triển trong
đường ruột. Do trong quá trình sử dụng, vi khuẩn probiotics bị ảnh hưởng bởi nhiều
điều kiện bất lợi của môi trường bên ngoài và đường tiêu hóa. Nên để có tác dụng,
bất cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít nhất 10

6
cfu/ml tế bào vi
sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng [15], [36].
Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết
của con người về cơ chế tác dụng của các vi khuẩn probiotics còn rất hạn chế. Một
số tác giả cho rằng vi khuẩn probiotics ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây
bệnh trong đường tiêu hóa. Các cơ chế cụ thể được nêu ra như: cạnh tranh chất dinh
dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột, ức chế sự phát triển của vi
khuẩn có hại bằng kích thích hệ thống miễn dịch ruột, bằng các sản phẩm trao đổi
chất của vi khuẩn probiotics [17], [18].
3

Trong thời gian gần đây, đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản phẩm
y tế có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng
chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang, pellet… và
còn sử dụng cho đường khác như viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo
chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn.
Để cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong suốt quá trình bảo quản và ở môi
trường có độ pH thấp trong cơ thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics
được bao tới thế hệ 1,2,3…[2].
Thế hệ 1
Không bao như cốm, pellet…( Non – Coated)

Thế hệ 2
Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)

Thế hệ 3
Vi nang hóa (Microencapsulated)

Thế hệ 4

Bao hai lớp (Dual – Coated)
Hình 1.1: Các thế hệ bao probiotics [2]
1.2. Loài Lactobacillus acidophilus
1.2.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân
của trẻ sơ sinh. L. acidophilus nằm trong chi Lactobacillus, chi lớn nhất của họ VK
lactic với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [33].
L. acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 – 0,9µm, dài 1,5 – 6,0µm,
tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi, chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không có lông roi,
không di động, không ưa muối, không ưa acid, calatase âm tính, kỵ khí tùy tiện và
có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic. Nhiệt độ thích
4

hợp cho sinh trưởng là 37
o
C, có thể phát triển được ở nhiệt độ cao (45
o
C) không
phát triển trong khoảng 20 - 22
o
C hoặc nhiệt độ cao hơn 48
o
C [8], [22].
L. acidophilus là VK vi hiếu khí, do đó môi trường nuôi cấy thường là kỵ khí
hoặc là giảm áp oxy với 5-10% CO
2
. L. acidophilus là đại diện chính của nhóm VK
sinh acid lactic, có khả năng chịu được điều kiện acid trong khoảng pH 5-6 trong
thời gian 24-36h. L. acidophilus phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề mặt thấp
và có khả năng kháng lysozyme [10].

1.2.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus đối với sức khỏe
a. Cải thiện chức năng miễn dịch không đặc hiệu
Các VK sinh acid lactic có thể tăng các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như
chức năng thực bào, tăng hoạt động các tế bào NK – natural killer cells và các đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu (hoạt động sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh các tế
bào lympho,…) của vật chủ. Sự gia tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (hoạt
động thực bào của bạch cầu hạt) đã được ghi nhận ở những người tình nguyện sau
khi sử dụng hỗn hợp probiotics gồm Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium
bifidum [23].
b. Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh
L. acidophilus có tác dụng ức chế sự phát triển của các VK gây bệnh đường
ruột như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica
và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng VSV. Bằng cách cạnh tranh
chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí bám lên niêm mạc ruột của các VK gây
bệnh và sinh ra các chất có tác dụng kháng khuẩn làm cho VK có hại không phát
triển được như: các barteriocin (như: nisin, lactobrevin, acidophilin, acidolin,
lactobacillin, lactocidin và lactolin), acid lactic, acid acetic, hydrogen peroxid,
carbon dioxid, diacetyl…[23].
c. Phòng ngừa bệnh tiêu chảy
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, probiotics có tác dụng điều trị trong
các trường hợp tiêu chảy do sử dụng kháng sinh ở người lớn, tiêu chảy khi đi du
lịch, cũng như tiêu chảy ở trẻ em do rotavirus. Khi sữa có chứa L. acidophilus,
5

S.thermophiles và B. longum được dùng cho những bệnh nhân cao tuổi bị tiêu chảy
do thường xuyên dùng thuốc xổ, tần suất tiêu chảy của người bệnh đã giảm xuống,
đồng thời tình trạng bệnh tiêu chảy cũng được cải thiện [10], [23].
d. Hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân suy thận
Theo nghiên cứu in vitro của Satya Prakash và cộng sự, tác giả đã tiến hành
thử nghiệm: vi nang alginat - chitosan bao gói VK Lactobacillus acidophilus và vi

nang alginat - chitosan bao gói VK L. acidophilus cùng với than hoạt. Hai loại vi
nang này được cho vào mô hình mô phỏng dạ dày ruột có chứa 150mg/dL ure. Kết
quả cho thấy vi nang có chứa vi khuẩn làm giảm tối đa 57 mg/dL ure, còn vi nang
có chứa than hoạt và vi khuẩn làm giảm được nồng độ ure thấp hơn. Nghiên cứu chỉ
ra rằng, vi khuẩn L. acidophilus trong quá trình trao đổi chất, có khả năng hấp thụ
ure vào tế bào. Vi nang L. acidophilus (có hay không có than hoạt) đều có khả năng
hấp thụ được từ 18-30% ure từ mô hình mô phỏng. Do đó, sử dụng vi nang có chứa
VK L. acidophilus có thể hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân suy thận [37].
e. Giảm cholesterol máu
Theo nghiên cứu in vivo của Ying Huang và Yongchen Zheng cùng các cộng
sự, đã cho thấy rằng một số loài Lactobacilli có thể làm giảm cholesterol toàn phần
và làm giảm nồng độ cholesterol lipoprotein. VK L .acidophilus làm giảm sự hấp
thu cholesterol thông qua sự điều chỉnh Niemann-Pick C1-like 1(NPC1L1) trong tế
bào Caco-2 (dòng tế bào ung thư biểu mô ruột). Cơ chế có thể được giải thích như
sau: L. acidophilus có khả năng ức chế tuyến yên tác động tới NPC1L1, làm giảm
NPC1L1, làm giảm sự hấp thu cholesterol của tế bào Caco-2 [19].
Trong các nghiên cứu khác, Lactobacillus acidophilus có tác dụng phân giải
các acid mật thành các acid tự do, acid tự do này được đào thải khỏi đường tiêu hóa
nhanh hơn nhiều so với các acid mật ở dạng kết hợp, khiến nồng độ acid mật giảm
xuống, tác động lên quá trình tổng hợp acid mật từ cholesterol, làm cho quá trình
tổng hợp này tăng lên, gây ra tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần
trong cơ thể [9], [11], [28], [46].

6

f. Cải thiện khả năng dung nạp lactose
Những người thiếu men lactase khi sử dụng một hoặc hai ly sữa thường bị rối
loạn tiêu hóa dẫn đến đầy hơi, tiêu chảy. L. acidophilus có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa
và cải thiện khả năng dung nạp lactose được giải thích qua các cơ chế sau [26]:
 Khi sử dụng sữa có chứa L. acidophilus, vi khuẩn cung cấp một lượng men

lactase để dung nạp lactose. Do đó làm giảm lactose bị phân hủy dẫn đến giảm hình
thành các loại khí gây đầy hơi như khí hydro [26].
 L. acidophilus trong các thử nghiệm in vitro gây đối kháng lại sự phát triển
của các loại VK sản sinh ra khí. Do các VK này bị ức chế bởi các lactobacilli do
L. acidophilus sinh ra [26].
 L. acidophilus là VK lên men đồng hình, chuyển các loại đường hexose thành
acid lactic và không sinh khí. Khi tỷ lệ VK lên men đồng hình tăng lên, thì lượng
khí sinh ra từ các VK lên men dị hình sẽ giảm xuống [26].
1.3. Tổng quan về dạng bào chế vi nang
1.3.1. Khái niệm
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, có
kích thước từ 0,1 µm tới 5 mm (thông thường từ 100 - 500 µm). Các vi nang được
bào chế qua quá trình bao dược chất lỏng hoặc rắn bằng một màng bao mỏng
polyme liên tục [4].
Xét về hình thái học, có thể chia thành 2 loại:
Vi nang (microcapsule): hệ thống có cấu trúc kiểu “bình chứa “ (reservoir),
gồm nhân và vỏ xác định. Nhân có thể ở dạng rắn, lỏng, khí. Vỏ là một màng
polyme (có thể một hoặc nhiều polyme) liên tục, có cấu trúc xốp hoặc không [20].
Vi cầu (microsphere): cấu trúc đồng nhất hoặc nguyên khối tạo nên bởi chất
nền liên tục (một hoặc nhiều polyme hòa trộn với nhau), phân tử thuốc được phân
tán vào chất nền (matrix) [20].
Trên thực tế, sự phân biệt trên chỉ là tương đối [4], [5].
1.3.2. Cấu tạo, thành phần, đặc điểm
Vi nang được cấu tạo bởi hai thành phần:
7

Phần nhân: gồm một hoặc nhiều dược chất. Dược chất rất phong phú, đa
dạng, có thể ở trạng thái rắn, lỏng hoặc dưới dạng một nhũ tương, hỗn dịch, có thể
thêm các chất phụ nhằm mục đích ổn định hoặc điều chỉnh tốc độ giải phóng dược
chất [4], [14], [20], [47].

Phần vỏ: thường là các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên như
gelatin, alginat, chitosan, cellulose hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid,
polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl, pyrrolidon (PVP),
polyethylen glycol (PEG)…, có tác dụng tạo màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200µm.
Lớp vỏ này xác định thuộc tính lý hóa của vi nang [4], [8].
Tỷ lệ nhân và vỏ biến động trong một khoảng rất rộng, từ 1:99 đến 99:1.
Thông thường vỏ bao chiếm 70% khối lượng vi nang và quyết định phần lớn tính
chất của vi nang [4].
Tính chất của vật liệu làm vỏ vi nang (bám dính, tính thấm, khả năng hút ẩm,
khả năng hòa tan, độ ổn định) phải phù hợp với mục đích bào chế vi nang [47]. Lớp
vỏ này phải có khả năng “bẫy”, “nhốt” và bao gói các dược chất, cơ thể vi sinh vật
sống trong các nang nhỏ. Lớp vỏ vi nang có độ bền tương đối để vừa có khả năng
bảo vệ tế bào VK vừa có khả năng giải phóng dược chất khi cần thiết [25].
Vi khuẩn, dược chất được giải phóng theo cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng
và khuếch tán qua màng [25].
1.3.3. Ưu nhược điểm của vi nang hóa probiotics
Ƣu điểm
Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định lượng lớn tế
bào sống. Trong vi nang, tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn, giảm thiểu được những ảnh
hưởng của các điều kiện bất lợi đã nêu. Ngoài ra, vi nang cũng giúp tăng độ ổn định
hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt của
các chất ức chế có trong môi trường lên men. Do đó, vi nang làm tăng độ ổn định và
kéo dài khả năng tồn tại của vi khuẩn [49], [28].Vi nang cũng cho phép điều chỉnh
tốc độ sinh trưởng của VSV, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với
môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [49].
8

Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu…thì
kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào VSV sử dụng
trong các công đoạn lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn

[40], [28].
Nhƣợc điểm
Trong quá trình trao đổi chất, tế bào VSV sản sinh ra nhiều enzym trong đó có
những enzym có thể xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp
vật liệu vi nang và cả chính tế bào [49].
Đa số các vật liệu vi nang như thạch, gelatin…đều là những nguồn dinh dưỡng
mà VSV có thể tiêu hóa được. Điều này dẫn đến nhược điểm là VSV được bao gói
bên trong hoặc VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị
rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể.
1.3.4. Phương pháp bào chế vi nang
Có nhiều phương pháp chế tạo vi nang. Về nguyên tắc, phương pháp chung
chế tạo vi nang không bắt buộc phải có những thiết bị riêng. Việc lựa chọn phương
pháp chế tạo phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích
thước vi nang…[4].
Có thể tạm phân chia như sau:
Phương pháp hóa lý: đông tụ (đơn giản, phức hợp); sử dụng các polyme không
tương thích; bốc hơi dung môi; sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…
Phương pháp cơ lý: ly tâm, bao tầng sôi, xát hạt tầng sôi quay tròn, nồi bao
viên thông thường, phun sấy…
Phương pháp hóa học: polyme hóa (tương tác các polyme, polyme hóa bề
mặt)…[14].
Một số phương pháp được trình bày cụ thể sau:
Phƣơng pháp tách pha đông tụ
Nguyên tắc: tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự muối hóa hoặc
khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang, làm thay đổi độ tan của polyme,
kết quả là hình thành một pha mới. Lúc này, hệ trở thành hai pha, một pha có nồng
9

độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ (coacervat).
Sau đó các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ lên bề mặt chất cần

bao gói tạo thành lớp màng vi nang [4], [8].
Có thể chia thành 2 nhóm cơ bản:
Đông tụ đơn giản: Là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng
trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Trong phương pháp này thường chỉ
sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose). Quá
trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung
môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…) hoặc thêm vào một
muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [1].
Đông tụ phức hợp: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và
tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, hoặc do sự thay đổi nồng
độ của chất tan cao phân tử. Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện
càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4], [8].
Kĩ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định
gel, ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel). Phương pháp này
thường hay sử dụng các polyme có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học
cao như alginat, chitosan, gôm gellan…Trong phương pháp này các polyanion như
alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian
ba chiều bao gói lấy dược chất; hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion
khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ họa cao hơn và
ngăn thấm tốt hơn. Hydrogel được bào chế bằng 2 kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ
giọt và kỹ thuật phun đông tụ (tùy thuộc vào kích cỡ của dược chất bao gói).
Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất bao gói có
một số ưu điểm sau: đơn giản, dễ làm, không phải sử dụng đến dung môi hữu cơ
(đối với một số trường hợp), không gây độc cho môi trường, điều kiện tiến hành
không quá khó khăn…Tuy nhiên, nó vẫn có nhược điểm là gây thất thoát dược chất
trong quá trình bào chế. Hơn nữa, cấu trúc mạng lưới hình thành rất thấm nước, ít
hoặc không kiểm soát giải phóng đối với các dược chất hòa tan, do đó hệ thuốc này
10

phù hợp hơn với các dược chất có độ tan thấp. Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi

nang có kích thước lớn. Đối với kỹ thuật phun đông tụ sử dụng hệ thống phun dung
dịch alginat dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp
môi trường có tác nhân liên kết chéo. Kỹ thuật này cho vi hạt có kích thước bé (5 -
15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc
nghẽn cao [33].
Đã có nhiều nghiên cứu về vấn đề này, Himanshu K. Solanki cùng các cộng sự
đã tạo vi nang probiotics trên cơ sở nguyên tắc đông tụ do tạo muối (phương pháp
gel ion ngoại). Thử nghiệm được tiến hành gồm các bước: Chuẩn bị hỗn dịch
alginat có chứa sinh khối, với nồng độ alginat từ 1 – 2%, dùng kim tiêm để nhỏ vào
dung dịch calci clorid 0,005 – 1,5M, đường kính của hạt phụ thuộc vào nồng độ, độ
nhớt của dung dịch alginat, khoảng cách giữa đầu kim với dung dịch alginat, đường
kính trong của đầu kim nhỏ giọt. Đường kính vi nang tạo ra trong khoảng từ 500µm
đến 3mm [42].
Maria Chavarri và các cộng sự đã tạo vi nang probiotics bằng phương pháp
đông tụ tạo muối. Sinh khối sau khi lên men thu được bằng cách ly tâm L. gasseri
và B. bifidum với tốc độ 1500 xG trong 5 phút ở nhiệt độ thấp (4
o
C), sau đó sinh
khối thu được phối hợp vào 10ml dung dịch alginat 2% tạo hỗn dịch đồng nhất. Hỗn
dịch này được phun vào dung dịch chitosan - calci clorid với nồng độ chitosan 0,4%
(kl/tt) và calci clorid 0,1M. Các hạt vi nang được làm lạnh ở -20
o
C, được đông khô
ở nhiệt độ -40
o
C trong 18h. Hạt vi nang sau đông khô được bảo quản ở trong bình
kín với nhiệt độ thấp (4
o
C) [13].
Kỹ thuật hóa rắn nhũ tƣơng

Vi nang có thể được tạo ra từ nhũ tương gồm hai hay nhiều chất lỏng không
đồng tan với nhau. Nhũ tương tạo thành có thể là loại dầu/nước (D/N) hoặc
nước/dầu (N/D). Dựa vào kỹ thuật hóa rắn nhũ tương mà có thể chia thành 3
phương pháp: bốc hơi dung môi, thay đổi dung môi và tạo liên kết chéo [20], [45],
[32] .

11

1.4. Alginat
a. Cấu tạo
Alginat là một trong các loại chuỗi polysaccharid anion được chiết tách từ loài
tảo nâu Phaeophyta, bao gồm: acid β-1,4-D-mannuronic (chuỗi M) và α-1,4-L-
guluronic (chuỗi G) liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glycosid [29].


Hình1.2: Cấu trúc alginat
b. Đặc điểm, tính chất có liên quan đến bào chế vi nang
Độ nhớt: khác nhau tùy số lượng nhánh của phân tử alginat. Độ nhớt thay đổi
phụ thuộc nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại [29].
Sự gel hóa: dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các
ion kim loại hóa trị II, III. Sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng. Bình
thường trong dung dịch alginat tồn tại 2 block, block M là các dải hẹp và block G là
các dải gấp khúc, khi có mặt các ion kim loại đa hóa trị (Ca
2+
, Ba
2+
, Sr
2+
…) ở nồng
độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau,

các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion
Ca
2+
khớp vào các chỗ trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu
trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống
lại những tác động bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vật liệu được bao
gói theo cách kiểm soát được [29].



12

c. Ƣu, nhƣợc điểm của vật liệu bao vi nang alginat đối với probiotics
Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm. Alginat là vật liệu
an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với calci clorid [29].
Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định
cao. Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể
thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có
tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành đẹp và
tương đối đồng đều [12], [21].
Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào VSV cũng có một số nhược
điểm. Độ bền gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion
Ca
2+
. Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm
giảm độ bền của gel calci alginat và làm cho các tế bào thoát ra ngoài [12], [21].
d. Ứng dụng trong vi nang
Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào sống, sử dụng trong kỹ thuật cố
định tế bào, cố định enzym [16]. Calci alginat tạo thành có tính trương nở trở lại
phụ thuộc vào pH môi trường nên có thể sử dụng để tạo các vi nang bảo vệ các

dược chất không bền trong môi trường pH dịch vị [33].
Ngoài ra trong dược phẩm, alginat được sử dụng trong các dạng bào chế
đường uống, đường bôi ngoài da (làm tá dược dính trong viên nén, tá dược độn
trong viên nang), còn dùng trong các dạng bào chế giải phóng kéo dài [29], [33].
1.5. Chitosan
Những năm gần đây, người ta nhận thấy những lợi ích đáng kể của việc sử
dụng chitosan trong các ngành sinh dược, thực phẩm, công nghiệp và công nghệ
sinh học. Các ứng dụng mới mẻ của loại polyme này là do đặc điểm có những nhóm
hoạt động, độc tính thấp, khả năng tự phân hủy và khả năng tương thích sinh học.
Do vậy, chitosan được sử dụng rất nhiều trong các hệ phân tán thuốc [43].
Cấu tạo, tính chất lý hóa
Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng
deacetyl hóa chitin – một polyaminosaccarid rất phong phú trong tự nhiên, là thành
13

phần cơ bản của lớp vỏ bảo vệ của các động vật giáp xác như tôm, cua…và thành tế
bào của một số loài như aspegillus, mucor…[40], [41].

Hình 1.3: Cấu trúc chitosan
Phân tử lượng từ 3800 đến 2000000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 40 đến
98%. Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, tỷ trọng, độ nhớt, mức độ acetyl hóa là
những đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược trong kỹ
thuật bào chế [40], [41].
Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng nồng độ chitosan, giảm
nhiệt độ và phụ thuộc bản chất chitosan (mức độ deacetyl hóa cao).
Chitosan có một nhóm amin bậc 1 và hai nhóm hydroxyl liên kết với mỗi tiểu
đơn vị C6 [41]. Chitosan là một base yếu, không tan trong nước và dung môi hữu
cơ nhưng tan được trong dung dịch acid loãng (pH<6,5) do trong môi trường acid,
những nhóm amin (các tiểu đơn vị glucosamine) của chitosan nhận proton tạo thành
dạng polysaccharid tích điện dương (R-NH3) tan được. Các muối của chitosan

(muối glutamat, clorid) tan trong nước. Chitosan không tan trong môi trường kiềm,
môi trường trung tính. Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang
chitosan [41].
Chitosan có mức độ deacetyl hóa thấp (40%) có thể tan được trong môi trường
pH dưới 9,0 trong khi loại có mức độ deacetyl hoá cao (85%) chỉ có thể tan được
trong môi trường pH dưới 6,5 [24]. Do có các nhóm amin tự do, chitosan mang điện
tích dương và có thể phản ứng với các phân tử mang điện tích âm và tạo phức với
ion kim loại như Cobalt…[41].

14

1.6. Một số nghiên cứu về dạng bào chế vi nang probiotics
Theo nghiên cứu của Sepideh Abbaszadeh và các cộng sự, đã tiến hành tạo vi
nang L. rhamnosus sử dụng chitosan- alginat như sau: sinh khối sau lên men, ly tâm
ở tốc độ 3200xg trong 10 phút ở 4
o
C để thu sinh khối và rửa sinh khối VK 2 lần
bằng cách ly tâm với dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0.9%. Dùng 5ml dung dịch
nước muối sinh lý đã tiệt khuẩn để thu sinh khối trong các ống ly tâm. Phân tán sinh
khối vào 10ml dung dịch alginat (các nồng độ 20,30,40 g/L) bằng khuấy từ [38].
Dung dịch chitosan với các nồng độ (2,4 và 10 g/L) được phân tán vào 90ml
nước cất được acid hóa bằng 0,4ml acid acetic băng, điều chỉnh về pH 5,7 – 6 bằng
dung dịch NaOH 0,1M. Lọc qua giấy lọc để loại cặn, sau hấp tiệt khuẩn ở 121
o
C
trong 15 phút. Hỗn dịch sinh khối – alginat được đùn qua đầu kim có kích thước
0,11mm vào dung dịch CaCl
2
0,1M đã hấp tiệt khuẩn. Hạt được ủ trong 30 phút,
khuấy từ với tốc độ 100 rpm. Sau đó, rửa sạch hạt, ủ hạt trong dung dịch chitosan

trong 40 phút kết hợp với khuấy từ nhẹ nhàng với tốc độ 100 rpm [38].
Nghiên cứu đánh giá vi nang trên các phương diện kích thước hạt, hiệu suất
bao gói, khả năng sống sót của VSV ở các pH khác nhau khi ủ trong thời gian 0; 24
và 48 giờ. Đánh giá khả năng sống sót của VSV trong môi trường muối mật, đánh
giá khả năng bảo vệ VK của vi nang khi ủ trong các nhiệt độ 55, 60 và 65
o
C trong
30 phút [38]. Kết quả cho thấy sự thay đổi nồng độ chitosan, alginat sẽ ảnh hưởng
đến kích thước của hạt, ảnh hưởng đến khả năng bảo vệ L.rhamnosus trong các điều
kiện thử nghiệm trên [38].
Trong nghiên cứu của Maria Chavarri và các cộng sự: tác giả không tách
riêng dung dịch chitosan và dung dịch CaCl
2
mà phối hợp chúng tạo dung dịch
chitosan - calci clorid như sau: chitosan được hòa tan trong 100ml nước cất được
acid hóa bằng acid acetic để đạt nồng độc chitosan là 0,4% (kl/tt), sau đó phối hợp
dung dịch CaCl
2
0,1M vào dung dịch chitosan. Hạt vi nang sau khi được tạo ra,
được tiền đông ở -20
o
C sau đó đông khô ở nhiệt độ -40
o
C trong 18 giờ. Vi nang sau
khi đông khô, dùng dung dịch natri citrat 0,1M khuấy trong 10 phút để hòa tan, đếm
số lượng VSV Lactobacillus gasseri và Bifidobacterium bifidum bằng cách pha
15

loãng với nồng độ thích hợp, sau đó cấy trên môi trường MRS thạch [13]. Kết quả
nghiên cứu của tác giả chỉ ra rằng. Vi nang probiotics được bao gói trong vi nang

chitosan - alginat khả năng tồn tại cao hơn với việc bao gói trong alginat [13].
Theo nghiên cứu của Postgate và Hunter: trong quá trình đông khô, tiền đông
A. aerogenes và đông khô ở nhiệt độ thấp thì số lượng VSV sống sót giảm. Tác giả
sử dụng glycerol 10% (kl/tt) làm chất bảo vệ VK A.aerogenes trong quá trình đông
khô và bảo quản ở nhiệt độ thấp. Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ, tỉ lệ
A.aerogenes sống sót sau đông khô và bảo quản ở -20
o
C như sau:
Bảng 1.1: Tỷ lệ sống sót của A. aerogenes khi được bảo quản với glycerol ở -20
o
C
Thời gian bảo quản (ngày)
0
2
6
10
20
27
40
Tỉ lệ VSV sống sót (%)
95
92
91
86
92
85
85
Thử nghiệm cho thấy, khi dùng glycerol với nồng độ10 - 15% thì lượng VSV
sống sót sau đông khô lớn, dùng glycerol với nồng độ <2% không có ý nghĩa bảo
vệ. Tuy nhiên, khi dùng với nồng độ >30% làm giảm tỷ lệ sống sót của VSV [34].

Theo nghiên cứu của Nguyễn Mai Hương, tác giả đã sử dụng tinh bột vào
trong quá trình tạo vi nang L. acidophilus như sau: Tinh bột, sinh khối VSV được
phân tán vào alginat tạo hỗn dịch. Hỗn dịch này cho qua đầu kim có đường kính
trong 900µm, nhỏ vào dung dịch CaCl
2
2% (kl/tt) để tạo hạt. Kết quả cho thấy việc
phối hợp tinh bột đã cải thiện thể chất của nguyên liệu đông khô dạng vi nang. Hạt
có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt giảm nhăn nhúm, giữ được độ cầu tốt hơn,
màu sắc đẹp hơn [3].
16

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu chứa vi sinh vật
Chủng vi sinh vật Lactobacillus acidophilus ATCC 4563 (Bộ môn Công
Nghiệp Dược –trường Đại học Dược Hà Nội).
Cốm nguyên liệu Antibiopro 1g chứa Lactobacillus acidophilus: của hãng Han
Wha Pharma (Hàn Quốc).
Nguyên liệu pha môi trường
Bảng 2.1: Các nguyên liệu pha môi trường
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
Glucose
Trung Quốc
TCCS
Pepton
Merk – Đức
TCCS

Cao thịt
Merk – Đức
TCCS
Cao nấm men
Merk – Đức
TCCS
Kali dihydro phosphat
Trung Quốc
TCCS
Magnesi sulfat heptadihydrat
Trung Quốc
TCCS
Triamoni citrat
Trung Quốc
TCCS
Natri acetat
Trung Quốc
TCCS
Natri clorid
Trung Quốc
TCCS
Mangan sulfat tetrahyrat
Trung Quốc
TCCS
Natri citrat
Trung Quốc
TCCS
Natri hydroxyd
Trung Quốc
TCCS

Acid hydrochloric
Trung Quốc
TCCS
Thạch agar
Việt Nam
TCCS
Nước tinh khiết
Việt Nam
TCCS

Bảng 2.2: Tá dược sử dụng
17

Tên tá dược
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
Chitosan
Đức
TCCS
Natri alginat
Ấn Độ
TCCS
Calci clorid
Trung Quốc
TCCS
Tinh bột sắn
Việt Nam
TCCS
Glycerol
Malaysia

TCCS
2.1.2. Thiết bị
Bảng 2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Bơm nhu động
Đức (Longer pump)
Tủ cấy vô trùng
Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2

Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh sâu
Đức
Tủ lạnh LG
Hàn Quốc
Thiết bị đông khô (Christ alpha)
Đức (Alpha)
Máy ly tâm
Đức
Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP – Nhật
Cân phân tích
Đức (Sartorius)
Cân kỹ thuật
Đức (Sartorius)
Máy đo hàm ẩm
Mỹ (Ohaus)
Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)
Máy lắc (vortex)
Trung Quốc
Máy đo pH
Mỹ (Mettler Toledo)
Đầu kim, đĩa petri, ống nghiệm,…

18

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng công thức bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ
tạo muối
Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công thức đến một số chỉ tiêu chất
lượng của vi nang, khả năng sống sót của vi khuẩn L. acidophilus bào chế được
 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu công thức đến chỉ tiêu chất lượng của vi nang
bào chế được.
 Khảo sát ảnh hưởng của thông số quá trình đến chỉ tiêu chất lượng của vi
nang bào chế được.
 Thời gian ủ vi nang
 Tốc độ khuấy dung dịch CaCl
2
trong
quá trình nhỏ giọt.
 Tốc độ nhỏ giọt

2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của vi nang trong môi trường acid.
Đánh giá khả năng bảo vệ Lactobacillus acidophilus của alginat và chitosan
trong môi trường acid HCl pH 1,2.
2.2.3. Theo dõi độ ổn định của vi nang trong quá trình bảo quản
Theo dõi hàm ẩm và số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá

trình bảo quản.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức
trong bảng 2.4). Hòa tan, phân tán hết các thành phần. Hút 10,0ml MRS lỏng vào
mỗi ống nghiệm, đậy kín ống nghiệm (ống thủy tinh, kích thước 1,5 x 20cm). Hấp
tiệt khuẩn môi trường ở nhiệt độ 115
o
C trong 20 phút. Để nguội, cấy giống vào các
ống nghiệm trên. Ủ trong tủ ấm ở điều kiện 37
o
C, 5% CO
2
trong 24 giờ [6].
 Thể tích sinh khối tế bào
 Nồng độ glycerol
 Nồng độ alginat
 Tỷ lệ tinh bột
 Nồng độ dung dịch CaCl
2

 Nồng độ dung dịch chitosan