Nghiên cứu so sánh khả năng tạo vi bọt giữa hai phương pháp siêu âm và khuấy cơ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH
KHẢ NĂNG TẠO VI BỌT GIỮA
HAI PHƯƠNG PHÁP
SIÊU ÂM VÀ KHUẤY CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU SO SÁNH
KHẢ NĂNG TẠO VI BỌT GIỮA
HAI PHƯƠNG PHÁP
SIÊU ÂM VÀ KHUẤY CƠ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Phúc Nghĩa
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược

HÀ NỘI-2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
TS. Nguyễn Phúc Nghĩa
Là người đã dành rất nhiều thời gian và công sức trực tiếp hướng dẫn và tạo
điều kiện thuận lợi nhất cho tơi trong q trình thực hiện khố luận tốt nghiệp này.
Để có được những kết quả đúng thời hạn, có độ chính xác trong phạm vi khố
luận này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của:
Các cán bộ thuộc Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia
Các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ mơn Tổng hợp Hố Dược, bộ mơn
Vật lý - Hố lý, bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Và tồn thể các thầy cơ giáo trong trường, các phòng ban, thư viện - Trường
Đại học Dược Hà Nội.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi
trong suốt quá trình vừa qua.
Hà Nội ngày 12 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Trịnh Phương Thảo


MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1.

Đại cương về vi bọt ........................................................................................2

1.1.1. Những ứng dụng độc đáo của vi bọt ..........................................................2
1.1.2. Cấu tạo vi bọt.............................................................................................5
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến vi bọt trong quá trình tồn tại ..........................7
1.1.4. Phương pháp bào chế ................................................................................9
1.2.

Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới ....................................................12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................14
2.1.

Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị..........................................................14

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................14
2.1.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................14
2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................14
2.2.

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................14

2.2.1. Khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp .........................14
2.2.2. So sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp .................................15
2.3.

Phương pháp nghiên cứu..............................................................................15

2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt ....................................................................15

2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt .............................16
2.3.3. Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J ...........................18
Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................19


3.1. Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp .....................19
3.1.1. Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp khuấy cơ ....19
3.1.2. Kết quả khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho phương pháp siêu âm ......25
3.2. Kết quả so sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp ..............................31
3.2.1. Hình thức vi bọt .......................................................................................32
3.2.2. Kích thước và phân bố kích thước vi bọt .................................................32
3.2.3. Thể tích cột bọt ........................................................................................33
3.2.4. Thời gian phân lớp của hệ bọt .................................................................34
3.2.5. Độ bền của vi bọt .....................................................................................34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................40
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
PFC: Perflouorocarbon
PVA: Polyvinylalcol
PLGA: Poly (D, L-lactid-co-glycolid)
CEHDA: Phun điện đồng trục


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Bảng 2.1: Nguyên vật liệu sử dụng

1
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng
2

Trang
14
14

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tốc độ quay roto đến quá trình tạo bọt và
3

chất lượng hệ bọt

20

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến quá trình tạo bọt và
4

chất lượng hệ bọt

23

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến quá trình tạo bọt
5

và chất lượng hệ bọt

26

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của xung siêu âm đến quá trình tạo bọt và

6

chất lượng hệ bọt

28

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến quá trình tạo bọt
7

và chất lượng hệ bọt

30

Bảng 3.6: Kết quả về sự thay đổi của vi bọt được tạo bằng hai
8

phương pháp khi được giữ trong tiêu bản

35

Bảng 3.7: Kết quả về sự thay đổi của vi bọt được tạo bằng hai
9

phương pháp khi được giữ trong ống nghiệm

37


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT

1

Tên hình
Trang
Hình 3.1. Phân bố kích thước vi bọt ở các tốc độ quay roto khác
21
nhau
Hình 3.2. Phân bố kích thước vi bọt ở các thời gian khuấy khác

2

nhau

24

Hình 3.3. Phân bố kích thước vi bọt ở các cường độ siêu âm khác
3
4

nhau
Hình 3.4. Phân bố kích thước vi bọt ở các xung siêu âm khác nhau

26
28

Hình 3.5. Phân bố kích thước vi bọt ở các thời gian siêu âm khác
5
6

nhau

Hình 3.6. Phân bố kích thước vi bọt của hai phương pháp

30
33

Hình 3.7. Sự thay đổi số lượng vi bọt có đường kính nằm trong
7

khoảng 1-10μm trên 1 vi trường cố định theo thời gian ở hai phương
pháp

35

Hình 3.8. Sự thay đổi đường kính của một vi bọt nhất định theo thời
8

gian ở hai phương pháp

36

Hình 3.9. Sự thay đổi số lượng vi bọt có đường kính nằm trong
9

khoảng 1-10μm trên 1 vi trường theo thời gian ở hai phương pháp.

38


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi bọt đã và đang được các nhà bào chế hiện đại đi sâu nghiên cứu và phát triển
bởi những ứng dụng rất thiết thực mà nó đem lại, nổi bật trong đó chính là: làm tác
nhân tương phản trong siêu âm, hỗ trợ cho các kỹ thuật hình ảnh y tế và sử dụng tác
nhân phân phối thuốc tới đích phục vụ cho chẩn đốn, hỗ trợ điều trị và điều trị bệnh
trong Y khoa.
Trên thế giới, vi bọt được bào chế bằng rất nhiều phương pháp đa dạng như:
bay hơi, trùng hợp, phun sấy, siêu âm…và đã cho ra đời rất nhiều chế phẩm tiêm
phục vụ trong chẩn đoán và điều trị. Ở nước ta hiện nay, vi bọt cịn ít được biết đến,
chưa có nghiên cứu về phương pháp bào chế hay ứng dụng của nó trong y học.
Từ những vấn đề trên cho thấy yêu cầu cần đặt ra đó là cần nghiên cứu và tìm
được những phương pháp bào chế thích hợp để tạo vi bọt. Do vậy, đề tài “Nghiên
cứu so sánh khả năng tạo vi bọt giữa hai phương pháp siêu âm và khuấy cơ”
được tiến hành với mục đích:
1. Sơ bộ thiết lập được các thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp tạo bọt.
2. So sánh được khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp bằng cách đánh giá
một số đặc tính của vi bọt.


2

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1.

Đại cương về vi bọt

1.1.1. Những ứng dụng độc đáo của vi bọt
1.1.1.1.

Tác nhân tương phản trong siêu âm

Siêu âm là kỹ thuật hình ảnh được sử dụng rất rộng rãi để chẩn đốn hình ảnh
và hỗ trợ điều trị trong lĩnh vực y học hiện nay. Siêu âm có rất nhiều tiện ích như:
khơng xâm lấn nên rủi ro thấp, chi phí thấp và thời gian phù hợp. Tuy nhiên, gần đây
siêu âm đã bị hạn chế do thiếu các tác nhân tương phản hình ảnh hiệu quả.
Tác nhân tương phản được định nghĩa là tác nhân làm thay đổi độ tương phản
hình ảnh một cách có ý nghĩa, giúp chẩn đốn phân biệt giữa điều kiện bình thường
và bất thường. Một tác nhân tương phản hiệu quả sẽ giúp phân biệt các mô lành và
mô bệnh bằng cách cung cấp những phản âm khác biệt. Điều này yêu cầu trở kháng
âm (sức cản âm thanh truyền tới, liên quan tới mật độ mô và vận tốc âm thanh) giữa
các mô phải khác nhau. Không chỉ có một trở kháng âm kháng biệt đáng kể so với
mơ, vi bọt cịn cộng hưởng với sóng siêu âm làm tăng phản âm của máu lên đến hơn
10 lần so với các tế bào hồng cầu [22].
Vi bọt có khả năng phản âm cao do mức độ chịu nén ở các cường độ siêu âm
khác nhau là lớn hơn nhiều so với bất kỳ chất lỏng hoặc rắn nào khác nên vi bọt có
thể cung cấp được cường độ tán xạ cao [22]. Hơn nữa khi vi bọt chịu tác động của
sóng âm tại một tần số phù hợp, chúng sẽ cộng hưởng âm. Và rất may mắn là vi bọt
trong phạm vi kích thước micrometer cộng hưởng dải tần số thường dùng trong siêu
âm chẩn đốn thơng thường (1-3MHz).
Tác nhân tương phản siêu âm vi bọt có hai đặc tính độc đáo mà khơng có ở các
tác nhân sử dụng trong kỹ thuật chụp X-quang hay chụp cộng hưởng từ. Thứ nhất, vì
vi bọt có kích thước lớn hơn 1μm nên chúng bị giới hạn phân bố bên trong không
gian mạch máu và chỉ phân bố đúng trong khơng gian mạch máu. Do đó, khi có bất
kỳ một tín hiệu nào nhận được thì chắc chắn đó là tín hiệu đến từ khơng gian mạch
máu. Thứ hai, vi bọt có thể bị phá hủy bởi chính sóng siêu âm. Chính vì vậy, tác nhân


3

tương phản vi bọt đã giúp cải thiện đáng kể chất lượng hình ảnh trong siêu âm, thể

hiện cụ thể trong các trường hợp sau:
 Hình ảnh buồng tim
Sử dụng các tác nhân tương phản vi bọt để lấp đầy buồng tim đã cho những tín
hiệu nổi bật ở khoang thất trái giúp đánh giá chuyển động của nó trong quá trình tâm
thu. Phân định rõ được biên giới của tâm thất cịn giúp đánh giá tồn bộ chức năng
tim bằng cách đo phân suất tống máu (tỉ lệ máu trong tâm thất trái được đẩy ra trong
một nhịp tim) và theo dõi chuyển động của thành tim hay sự tưới máu của động mạch
vành để phát hiện bệnh thiểu năng mạch vành.
 Hình ảnh mạch máu
Khi tiến hành chụp ảnh mạch máu, tác nhân tương phản siêu âm vi bọt giúp
chúng ta dễ dàng đạt được các mục đích sau:
-

Xác định được rằng các mạch máu có bị tắc hay không.

-

Đánh giá được những bất thường của thành mạch máu: phát hiện các mảng xơ
vữa và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến lưu lượng dòng máu.

-

Xác định hướng dịng chảy và vận tốc dịng máu thơng qua chu kỳ tim ở trạng thái
bình thường.

-

Thu được những hình ảnh chụp X-quang mạch máu giống như cây mạch máu
trong các cơ quan.
Một cục máu đơng thường rất khó phát hiện vì nó cũng tương tự như máu, điều

này làm cho mạch máu nhìn rất bình thường trong khi nó có thể bị tắc hoàn toàn. Sử
dụng tác nhân tương phản siêu âm, sẽ cho phép chúng ta quan sát rõ ràng vị trí các
cục máu đơng và thu được hình ảnh bên trong thành động mạch, giúp phát hiện mảng
xơ vữa [17], [30].
 Hình ảnh tưới máu mơ
Khả năng nhận biết ra các mơ được tưới máu và tình trạng tưới máu mô là vô
cùng quan trọng để phát hiện ra các mơ bệnh. Siêu âm tuy có thể cho phép quan sát
mô cấu trúc của cơ tim và nội tạng thì nó lại khơng nhạy cảm với những mơ thiếu


4

máu cục bộ, chẳng hạn như trong trường hợp suy mạch vành hay thậm chí là những
mơ đang thay đổi trong giai đoạn đầu của tắc mạch cục bộ và nhồi máu mô [29]. Sử
dụng tác nhân tương phản để lấp đầy mạch máu trong các mô không chỉ giúp phát
hiện tắc mạch ngay sau khi nó vừa xảy ra mà cịn đánh giá được khả năng tưới máu
ở mơ.
Khối u sẽ được phát hiện dễ dàng hơn, đặc biệt là các khối u nhỏ khi có sự hỗ
trợ của tác nhân tương phản, do chúng ta có thể quan sát được các mạch máu ni
mơ ác tính, khác hẳn với mạch máu ni mơ bình thường, chúng thường quanh co và
phân nhánh lộn xộn, tập trung nhiều ở ngoại vi khối u và lưu lượng máu ngoại vi tăng
hoặc giảm hay khơng có máu ni khu vực trung tâm. Phản xạ siêu âm giúp xác định
số lượng vi tuần hồn của khối u qua đó đánh giá việc hình thành mạch máu để ni
khối u [35].
 Hình ảnh phân tử
Việc phát hiện các dấu hiệu đặc trưng cụ thể ở mức phân tử của một bệnh lý nào
đó thì được gọi là hình ảnh phân tử. Để làm được điều này, người ta gắn lên vỏ vi bọt
một số tác nhân sao cho chúng có khả năng hướng đích là vị trí đang cần có hình ảnh
phân tử. Khi chúng tập trung tại đó, hình ảnh siêu âm sẽ trở nên rõ nét hơn. Chẳng

hạn như, khi kết hợp phosphotidylserine vào vỏ lipid, vi bọt sẽ hấp dẫn bạch cầu bắt
giữ chúng ngay tại các ổ viêm [20]. Vi bọt nhắm đích được tạo ra bằng cách gắn các
phối tử thích hợp bao gồm cả kháng thể lên vỏ của chúng thơng qua các liên kết hóa
trị hoặc qua khớp nối avidin/biotin. Các loại mô mục tiêu hay được hướng tới gồm
huyết khối, mảng xơ vữa, ổ viêm, khối u. Ví dụ, để có được hình ảnh rõ ràng về huyết
khối, người ta sử dụng tác nhân tương phản là vi bọt có gắn trên bề mặt các thụ thể
GPIIb/IIIa được tìm thấy trên tiểu cầu đã được kích hoạt [26], [36].
1.1.1.2.

Tác nhân phân phối thuốc và gen

Khơng có khả năng cung cấp acid nucleic nhắm tế bào đích bằng một hệ thống
phân phối đang là rào cản lớn nhất trong liệu pháp gen. Sử dụng kỹ thuật siêu âm kết


5

hợp với vi bọt đã khắc phục tốt được hạn chế này. Gen hướng đích được phân phối
bằng cách tiêm đồng thời DNA plasmid và vi bọt có thể mang lại hiệu quả thông qua
mức độ biểu hiện của gen, nhưng phương pháp này yêu cầu một lượng lớn DNA kết
hợp để có thể định lượng được [1]. Do acid nucleic dễ bị nuclease phân giải và nhanh
chóng đào thải qua hệ thống lưới nội mô khi được đưa vào trong máu, vì vậy vi bọt
đã được sử dụng làm chất mang để bảo vệ chúng khỏi bị thối hóa, tăng thời gian lưu
thơng trong mạch máu, cải thiện tính đặc hiệu của việc phân phối tới đích.
Phân phối thuốc tới đích được thực hiện bằng cách kết hợp các phân tử thuốc
và vỏ của vi bọt. Khác với các acid nucleic, các phân tử thuốc hiếm khi liên kết tĩnh
điện với bề mặt vi bọt, thay vào đó chúng kết hợp cùng lớp vỏ hoặc ngay dưới bề mặt
của lớp vỏ hoặc chúng được kết hợp với một chất mang khác có thể liên kết với bề
mặt vi bọt. Sau khi vi bọt tới đích chúng sẽ bị phá vỡ bởi lực siêu âm và giải phóng
thuốc. Như vậy, sử dụng vi bọt làm tác nhân phân phối thuốc sẽ mang lại nhiều lợi

ích như:
-

Bảo vệ dược chất khỏi sự tác động của các enzyme phân hủy thuốc trong máu.

-

Tăng thời gian lưu thông của thuốc trong máu.

-

Hạn chế khả năng gây độc cho các mô lành.

-

Vi bọt bị phá vỡ bởi sóng siêu âm do đó có thể kiểm sốt được q trình giải
phóng thuốc.

1.1.2. Cấu tạo vi bọt
Vi bọt là một hình cầu nhỏ có kích thước cỡ micrometer, bao gồm 2 phần cơ
bản: lớp vỏ ngoài và lõi khí phía trong. Thực tế chúng có kích thước trong khoảng 1100 μm, nhưng thường chỉ sử dụng những vi bọt có đường kính 1-10μm do những vi
bọt có kích thước lớn hơn thường khơng qua được các mao mạch.
1.1.2.1.

Vỏ ngồi

Là lớp vỏ bao bên ngồi lõi khí, ngăn cách phần khí bên trong với mơi trường
bên ngồi vi bọt.

6

Lớp vỏ có thể được tạo thành từ những thành phần khác nhau, tùy theo bản chất
của các thành phần đó mà cơ chế tạo vỏ cũng khác nhau. Thơng thường, nguyên liệu
để tạo vỏ là những chất có khả năng hoạt động bề mặt như: protein (albumin), lipid
(phosphotidylcholin,

phosphotidylethanolamine…),

polymer

(PVA,

polycaprolacton…), chất diện hoạt (Tween, Span…).
Mỗi loại vỏ đều có những ưu nhược điểm riêng nhưng nhìn chung vi bọt vỏ
lipid có nhiều điểm nổi trội hơn cả. Để tạo vỏ, các phân tử phospholipid tự sắp xếp
thành một lớp bao xung quanh bọt khí, quay đầu ưa nước ra ngồi và đi thân dầu
vào trong; các phân tử cịn liên kết với nhau rất chặt chẽ nhờ lực Van der Waals giữa
các nhóm acyl và do tính kị nước của chúng [16]. Những yếu tố này giúp vỏ lipid ổn
định hơn do việc hình thành lớp vỏ khơng phụ thuộc q nhiều vào phương pháp bào
chế. Với vi bọt vỏ protein, lớp vỏ phải hình thành nhờ các cầu nối disulfide giữa các
nhóm thiol trong q trình siêu âm. Do các phân tử phospholid liên kết với nhau bằng
một lực vật lý yếu nên lớp vỏ khơng chỉ bền mà cịn rất linh hoạt, có khả năng đàn
hồi cao, đảm bảo khả năng phản âm cho vi bọt. Ngoài ra, vật liệu lipid cịn tương
thích sinh học hơn so với polymer hay chất diện họat. Còn vỏ polymer thường dày và
cứng hơn vỏ lipid bởi nó được tạo thành nhờ các liên kết ngang, chéo giữa các phân
tử polymer. Lớp vỏ dày tuy bền và ổn định hơn nhưng lại làm giảm khả năng cộng
hưởng âm ở dải tần số sử dụng trong điều trị [25]. Chính vì vậychúng thường được
ứng dụng làm tác nhân tương phản trong siêu âm nhiều hơn là phân phối thuốc và
gen do lớp vỏ khá bền vững khó bị phá vỡ hơn.

1.1.2.2.

Lõi khí

Là phần khơng gian được bao bọc bởi lớp vỏ ngồi. Có thể gồm 1 khí hoặc là
hỗn hợp của nhiều khí. Khi hỗn hợp khí gồm 2 khí thì khí chính được gọi là khí sơ
cấp, thường là khơng khí, đơi khi là N2. Khí cịn lại là khí thứ cấp, là 1 tác nhân khí
thẩm thấu, khí này ít hịa tan trong máu và huyết thanh và có áp suất riêng phần ở
nhiệt độ cơ thể đủ để cung cấp một hiệu lực thẩm thấu mong muốn. Khí kết hợp được


7

dùng để tạo ra sự khác biệt trong áp suất riêng phần và tạo áp suất khí thẩm thấu qua
đó ổn định vi bọt, PFC là khí hay được dùng nhất.
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến vi bọt trong quá trình tồn tại
Trong quá trình tồn tại, bản thân vi bọt chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố
nhưng phải kể đến trước tiên đó là áp lực Laplace ΔP cho bởi:
ΔP = 2
Trong đó:

𝜎
𝑟

σ là sức căng bề mặt khí/nước
r là bán kính của vi bọt

Áp lực này càng lớn thì vi bọt càng nhanh chóng bị biến mất, có nghĩa là khi
sức căng bề mặt càng lớn và bán kính vi bọt càng nhỏ thì thời thời gian tồn tại của vi
bọt càng ngắn. Ngoài áp lực Laplace cịn có huyết áp, nhiệt độ, độ nhớt mơi trường,

pH cũng có những tác động đáng kể tới sự tồn tại của vi bọt.
Khi tiêm tác nhân tương phản vi bọt có lõi là khơng khí làm vào máu, vì khơng
khí hịa tan rất nhanh nên vi bọt nhanh chóng teo nhỏ lại và biến mất. Nguyên nhân
là do áp suất khơng khí trong vi bọt bằng tổng của áp lực Laplace và huyết áp, khi nó
lớn hơn áp suất khơng khí trong máu thì khơng khí trong vi bọt sẽ nhanh chóng bị
thốt ra ngồi. Khơng khí bị thốt ra ngồi, bán kính vi bọt sẽ giảm đồng thời kéo
theo lực Laplace tăng, lại càng làm cho khí thốt nhanh hơn, vi bọt sẽ nhanh chóng
teo nhỏ và biến mất. Để làm chậm tốc độ vi bọt hòa tan trong máu, người ta phải giảm
hệ số phân bố giữa pha khí và pha nước của khí bên trong, bằng cách sử dụng PFC
làm một thành phần cho lõi khí.
Với vi bọt chỉ chứa khí PFC, khi được tiêm vào máu thì chúng nhanh chóng
phồng lên do sự chênh lệch giữa nồng độ khơng khí hịa tan trong máu và nồng độ
khơng khí trong vi bọt. Khơng khí tràn vào bên trong vi bọt làm chúng tiếp tục phồng
lên cho đến khi áp suất riêng phần của không khí bên trong bằng với áp suất khơng
khí của mơi trường xung quanh và áp suất riêng phần của PFC bằng tổng của áp lực


8

Laplace và huyết áp. Vì vậy, các nhà khoa học đã có ý tưởng về việc thiết kế vi bọt
sao cho áp suất riêng phần của PFC được tính tốn một cách chính xác để tương
đương với áp lực Laplace và huyết áp [14], [28].
Q trình biến mất hay hịa tan của vi bọt có chứa khơng khí và một khí ổn định
thẩm thấu khi lưu thơng trong máu có thể được mô tả qua các giai đoạn như sau:
-

Giai đoạn 1: do nồng độ khơng khí bên trong vi bọt thấp hơn rất nhiều so với nồng
độ khơng khí trong máu nên chúng nhanh chóng phồng lên do khơng khí tràn vào
bên trong. Tốc độ phồng lên của vi bọt phụ thuộc vào sức căng bề mặt lớp vỏ, tỉ
lệ khí ổn định thẩm thấu ban đầu, huyết áp, và mức độ trao đổi khí oxy của máu.

-

Giai đoạn 2: khí ổn định thẩm thấu khuếch tán ra khỏi vi bọt cũng do chênh lệch
nồng độ giữa bên trong và bên ngoài vi bọt, nên vi bọt bị teo nhỏ lại.

-

Giai đoạn 3: khi vi bọt teo nhỏ lại, áp lực Laplace tăng lên cao kết hợp với huyết
áp làm cho áp suất thẩm thấu tăng mạnh, nên các khí ổn định thầm thấu sẽ ngưng
tụ thành chất lỏng để kéo dài thời gian tồn tại của vi bọt.
Muốn kéo dài tuổi thọ vi bọt đồng nghĩa với việc phải kéo dài khoảng thời gian

mà trong đó vi bọt vẫn ổn định về kích thước và độ bền. Chẳng hạn vi bọt tối thiểu
phải tồn tại được trong một khoảng thời gian đủ để tiến hành siêu âm khi nó được sử
dụng làm tác nhân tương phản. Có rất nhiều giải pháp để giải quyết vấn đề này nhưng
điều được cân nhắc trước tiên vẫn là việc lựa chọn thành phần cho lõi khí và lớp vỏ
ngồi.
Chọn lựa ngun liệu làm lớp vỏ được xem xét kỹ càng vì nó quyết định độ bền,
tính đàn hồi của vi bọt nên ảnh hưởng trực tiếp tới thời gian tồn tại, khả năng cộng
hưởng âm của vi bọt. Lớp vỏ tạo ra phải vừa bền vững, vừa linh hoạt, có khả năng co
giãn tốt để đảm bảo tính phản âm cho vi bọt. Khi sử dụng các chất có khả năng hoạt
động bề mặt, sức căng bề mặt càng nhỏ thì áp lực Laplace càng nhỏ do đó vi bọt tồn
tại được lâu hơn và ngược lại. Các thành phần để tạo vỏ ngồi tốt nhất là những chất
dễ chuyển hóa, dễ bài tiết và có rất ít tác dụng phụ, tương thích sinh học, hay tốt hơn
nữa là có thể vơ trùng được bằng nhiệt và có thời gian sử dụng lâu dài.


9

Đối với phần lõi khí, thành phần và tỉ lệ các khí dùng để đưa vào bên trong vi
bọt cũng được cân nhắc và tính tốn kỹ lưỡng. Thơng thường khí kết hợp hay khí thứ
cấp phải đáp ứng được hai yêu cầu là: phải có hệ số Ostwald thấp (<10-4) và áp suất
hơi bão hòa ở nhiệt độ cơ thể phải tương đối cao (>3.104 Pa), khi đó tuổi thọ của vi
bọt sẽ được gia tăng đáng kể. Các PFC chính là lựa chọn lý tưởng có thể đáp ứng
được các yêu cầu trên, ngoài ra khi vi bọt bị hịa tan các khí này cịn được bài tiết ra
dưới dạng nguyên vẹn qua đường thở mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con
người.
1.1.4. Phương pháp bào chế
Với mục đích tạo ra những hệ vi bọt bền vững, ổn định về kích thước, phân bố
kích thước hẹp, tuổi thọ lâu dài và tương thích về sinh học, đã có rất nhiều phương
pháp bào chế được phát triển. Điển hình như các phương pháp: bay hơi dung mơi nhũ
tương, phun sấy, siêu âm, khuấy tốc độ cao, màng nhũ hóa, hệ vi dẫn.
1.1.4.1.

Siêu âm

Đây là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng, vi bọt được tạo thành bằng
cách phân tán pha khí hoặc pha lỏng vào dung dịch chứa nguyên liệu tạo vỏ thích hợp
với lực siêu âm ở cường độ cao [4], [32], [38]. Người ta cho rằng có hai nguyên tắc
cơ bản trong phương pháp này [31]. Thứ nhất, các chất khí hoặc chất lỏng được phân
tán để tạo thành một hệ vi giọt hoặc vi bọt, sau đó các vật liệu bao phủ như protein
hoặc chất diện hoạt tự động hấp phụ lên bề mặt chúng. Thứ hai, nhiệt độ và áp suất
cao làm thay đổi cấu trúc hóa học của lớp vỏ bề mặt nên cải thiện độ ổn định của vi
bọt hoặc vi giọt. Kích thước bọt và phân bố kích thước bọt tạo thành phụ thuộc vào
tần số, năng lượng và xung của chế độ siêu âm [10]. Nhìn chung phân bố kích thước
bọt được tạo thành bằng phương pháp này thường tương đối rộng, vì thế trước khi
đem sử dụng cần phải được phân loại để loại bỏ những bọt lớn có thể gây tắc mạch
[21].
1.1.4.2.

Bay hơi dung mơi


10

Đây cũng là một phương pháp tương đối phổ biến đặc biệt hay áp dụng với các
loại vi bọt sử dụng polymer làm lớp vỏ ngoài. Tiến hành bằng cách nhũ hóa dung
dịch polymer (được hịa tan trong một loại dung mơi thích hợp) thành nhũ tương bởi
các lực cơ học như: khuấy đảo, chia cắt mạnh [2], [12]; trong đó có sử dụng một chất
khơng hịa tan polymer và không đồng tan với nước làm chất ổn định. Dung mơi hịa
tan polymer phải là chất dễ bay hơi, khi bay hơi dung môi polymer sẽ kết tủa trên bề
mặt các vi giọt nhũ tương tạo nên các vi cầu (microspheres). Các vi cầu được rửa
sạch để loại dung môi dư thừa sau đó đem đơng khơ để sản xuất vỏ vi bọt.
Đối với phương pháp này, phân bố kích thước vi bọt chủ yếu phụ thuộc vào kích
thước của các hạt nhũ tương và bất kỳ sự chia cắt hay hợp nhất nào của vi cầu ở các
giai đoạn tiếp theo.
1.1.4.3.

Khuấy tốc độ cao

Vi bọt được chế tạo bằng cách dùng lực khuấy đảo chia cắt của cánh khuấy để
phân tán pha khí hoặc pha lỏng vào một dung dịch của nguyên liệu tạo vỏ. Các phân
tử chất tạo vỏ sẽ tự động tìm đến và sắp xếp trên bề mặt mới trong dung dịch và hình
thành nên vi bọt. Kích thước vi bọt có thể kiểm sốt được nhờ tốc độ cánh khuấy hay
tỉ lệ pha lỏng, pha khí. Tương tự phương pháp siêu âm, phân bố kích thước vi bọt bào
chế bằng phương pháp này khá lớn, cần phải được phân loại trước khi đem đi sử
dụng.
1.1.4.4.

Màng nhũ hóa

Vi bọt được tạo ra bằng cách đẩy hỗn hợp chứa nhiều thành phần đi qua một
màng xốp một hoặc nhiều lần, tạo thành các giọt lỏng [13]. Sau đó cũng tiến hành
các bước tiếp theo như phương pháp bay hơi dung mơi để tạo vi bọt, hoặc có thể tạo
ngay vi bọt bằng cách sử dụng khí tạo lõi cho vi bọt như một pha phân tán [19].
Ưu điểm của phương pháp này đó là kiểm sốt kích thước vi bọt tốt hơn, phân
bố kích thước hẹp hơn rất nhiều so với phương pháp siêu âm hay bay hơi dung môi
[18]. Và quan trọng hơn là số lượng vi bọt tạo thành không bị giảm theo thời gian hay


11

khối lượng của hỗn hợp các thành phần tạo vi bọt. Kích thước cũng như phân bố kích
thước của hệ vi bọt phụ thuộc nhiều vào đặc điểm của các lớp màng (phân bố kích
thước lỗ màng, độ xốp của màng) [15].
1.1.4.5.

Phun sấy kiểm soát bằng điện trường

Đây là kỹ thuật được sử dụng nhằm cải thiện tính đồng nhất của vi bọt được tạo
ra [19]. Các vi bọt được tạo thành từ một vịi phun bằng thép khơng gỉ (đường kính
đầu phun 20-50μm) được cung cấp dịch phun trong buồng phun có nhúng một điện
cực. Bằng cách thay đổi điện thế của điện cực, xung áp suất sẽ được tạo ra trong lòng
dịch phun, với mỗi xung áp suất một giọt chất lỏng sẽ được đẩy ra khỏi vòi phun và
dịch phun lại được tiếp tục hút vào buồng phun. Để thu được các vi giọt, có thể phun
trực tiếp vào khơng khí hoặc phun chìm vào trong một mơi trường lỏng.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể kiểm sốt được kích thước giọt bằng
cách thay đổi chế độ phun và khơng địi hỏi áp suất cao để tạo giọt như là với phương
pháp màng nhũ hóa [19].

Cho đến nay phương pháp này chỉ được sử dụng để tạo ra các hạt chứa chất
lỏng, ví dụ như paclitaxel được bao bọc trong lớp vỏ polylactiddecolglycolide [24]
hoặc vi cầu chứa dung mơi dễ bay hơi có thể loại bỏ để tạo thành vi bọt.
1.1.4.6.

Phun điện đồng trục (CEHDA)

Đây là kỹ thuật gần đây mới áp dụng để tạo vi bọt, trong đó một dịng dịch lỏng
được đưa vào trong buồng phun dưới sự kiểm soát của một điện trường tương tự như
kỹ thuật phun sấy. Sau đó phun tạo thành các giọt nhỏ được giữ trong một hệ treo
nhờ các kim phun đồng trục khác. Để bào chế vi bọt, kim bên trong cung cấp khí cịn
kim bên ngồi cung cấp dịch có vật liệu bao ngồi mong muốn.
Nhờ thay đổi tỉ lệ pha khí, pha lỏng hay điện áp cung cấp cho đầu kim phun mà
kích thước và độ đồng nhất của vi bọt tạo thành có thể được kiểm sốt [7]. Đường
kính vi bọt giảm bằng cách giảm tỉ lệ khí, tăng điện áp hay giảm đường kính của đầu
kim phun [11].


12

Ưu thế của phương pháp này so với kỹ thuật phun sấy đó là có thể cung cấp
ngay khí cho lõi vi bọt chỉ trong một bước mà không cần các bước xử lý tiếp theo và
cho phép tạo ra các vi bọt có vỏ đa lớp bằng cách tăng số lượng dịng chất lỏng.
Vi bọt vỏ phospholipid có kích thước 6,6 ± 2,5μm được chế tạo bằng phương
pháp này đã ổn định hơn 2,5h ở nhiệt độ phòng [7]. Vi bọt vỏ polymer chứa chất lỏng
cũng đã được bào chế thành công [6], [23].
1.1.4.7.

Hệ vi dẫn (Microfluidic)

Kỹ thuật hệ vi dẫn được sử dụng để tạo ra vi bọt có kích thước được kiểm sốt
một cách chính xác và thường áp dụng với các vi bọt vỏ polymer. Thành phần khí tạo
lõi được cung cấp nhờ một kênh mao dẫn, sau khi đi vào dung dịch polymer chứa bên
trong một kênh mao dẫn đồng trục khác sẽ được bao bọc lại, tạo thành vi bọt. Thơng
thường pha khí thường được tiêm vào pha dầu nhờ một kim đồng trục khác, khí trong
pha dầu sau khi thốt ra khỏi đầu mao dẫn sẽ đi vào dung dịch polymer để tạo một hệ
phân tán có chứa có vi bọt có cấu trúc lõi khí và vỏ trong pha nước. Vi bọt vỏ polymer
thu được sau đó sẽ được làm sạch bằng cách bay hơi dung môi.
Một cách tiếp cận khác tương tự cũng đã được sử dụng để tạo vi bọt nhiều lớp
với một nhũ tương kép và thiết bị hệ vi dẫn đồng trục hoặc kết hợp hai mơ hình hệ vi
dẫn khác nhau: dòng chảy tập trung và giao nhau hình chữ T [34], [37]. Kích thước
vi bọt có thể được kiểm sốt nhờ tốc độ dịng chảy, độ nhớt của chất lỏng, áp suất của
dịng khí và kích thước các đầu kim hệ vi dẫn.
Có thể tạo các vi bọt đa thành phần bằng cách kết hợp các thành phần này vào
pha dầu để tạo lớp vỏ trong cùng. Phương pháp bào chế này rất thuận lợi để nghiên
cứu số lượng vi bọt ổn định dựa vào bán kính và độ dày vỏ. Tuy nhiên so với các
phương pháp khác thì phương pháp hệ vi dẫn có năng suất tương đối thấp.
1.2.

Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới

Các sản phẩm thương mại về vi bọt xuất hiện đầu tiên trên thế giới vào những năm
1990 ở châu Âu và Hoa Kỳ đó là Echovist (Schering AG, Đức) và Alnunex (Hoa Kỳ).


13

Echovist gồm các vi tinh thể galactose đóng vai trị là mầm mống hình thành nên các
vi bọt khơng khí lơ lửng trong nước [33], còn Albunex gồm các vi bọt khơng khí có
vỏ là protein biến tính của con người [8]. Các dạng vi bọt này đã được sử dụng, tuy

nhiên chúng không đủ ổn định để vượt qua các lòng mao mạch phổi và đến được tâm
thất khi tiêm tĩnh mạch. Thời gian bán thải của chúng chỉ được tính bằng giây nên
việc sử dụng các dạng sản phẩm này là có giới hạn. Schering sau đó đã phát triển
Levovist bằng cách bổ sung thêm acid palmitic, lớp vỏ của vi bọt được hình thành
sau khi được khuấy mạnh, đồng thời cũng tăng tính ổn định của vi bọt [9], [27]. Nối
tiếp sau đó là sự ra đời của hàng loạt các sản phẩm khác nhau như:
-

Optisona: vỏ albumin người, lõi khí perfluoropropane

-

Sonovuea: vỏ albumin người và lõi khí SF6

-

PESDA: vỏ phospholipid đơn lớp và lõi khí Perluorobutane

-

Quantison: lõi khơng khí và vỏ albumin

-

Definty: lõi khí Perfluoropropane, vỏ albumin khô hoặc vỏ phospholipid đơn lớp
Năm 2005, Cui và các cộng sự đã mơ tả q trình tạo vi bọt PLGA từ một nhũ

tương kép bằng phương pháp bay hơi dung mơi [5]. Kích thước khảo sát bằng máy
đếm Coulter cho kết quả đường kính nằm trong khoảng 1-2μm. Sử dụng kính hiển vi
điện tử quét, cho thấy vi bọt tạo thành là những hạt hình cầu có bề mặt nhẵn khơng

bị thủng hoặc có các lỗ hổng.
Năm 2005, Cavalieri và cộng sự mô tả phương pháp tạo vi bọt với vật liệu bao
ngoài là PVA [3]. Bằng cách khuấy tốc độ cao (8000 vòng/phút) dung dịch đã được
xử lý của PVA, vi bọt sẽ được tạo nên nhờ các liên kết hóa học ngang giữa các phân
tử PVA ngay trên bề mặt phân cách pha lỏng là pha khí. Đường kính trung bình vi
bọt nằm trong khoảng 6±1μm. Độ dày của lớp vỏ ngồi có thể được giảm từ 0,9μm
xuống 0,7μm bằng cách giảm nhiệt độ quá trình bào chế xuống 4oC. Vi bọt PVA được
tạo ra bằng phương pháp này đã có hạn sử dụng trong vài tháng và có khả năng vận
chuyển thuốc kỵ nước, gen hoặc các phối tử hướng đích.


14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi bọt
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1: Nguyên vật liệu sử dụng
STT

Tên ngun liệu

Vai trị

Nguồn gốc

Tiêu
chuẩn

1

Cơng ty cổ phần Sao

Glycerylmonostearate

2
3

Thái Dương
Cấu thành lớp vỏ

Poloxamer 188

USP

Cremophor A25

Trung Quốc

USP

Công ty cổ phần Sao TCCS
Thái Dương

4

Nitrogen

Thành phần lõi khí

Việt Nam

TCCS

5

Nước cất

Dung mơi

Việt Nam

TCCS

2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng
STT

Tên thiết bị

Nguồn gốc

1

Cân kỹ thuật

Ohaus

2

Bể cách thủy

Buchi-Đức

3

Máy khuấy tốc độ cao UNDRIVER X 1000

Đức

4

Máy siêu âm

Sonic & Material-Mỹ

5

Kính hiển vi gắn camera Nikon Eclipse Ci-L

Đức

6

Cốc có mỏ, pipet, lam lính, lá kính…

Việt Nam

2.2.

Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát thông số kỹ thuật tối ưu cho hai phương pháp


15

Khảo sát sự ảnh hưởng của các thông kỹ thuật đến quá trình bào chế vi bọt và
chất lượng hệ bọt, từ đó lựa chọn các thơng số tối ưu.
 Phương pháp siêu âm:
-

Cường độ siêu âm

-

Thời gian siêu âm

-

Xung siêu âm

 Phương pháp khuấy cơ học:
-

Thời gian khuấy

-

Tốc độ quay của roto
Sự ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến q trình tạo bọt được đánh giá

thơng qua các chỉ tiêu:
 Hình thức vi bọt
 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt
 Thể tích cột bọt
 Thời gian phân lớp của hệ bọt
2.2.2. So sánh khả năng tạo vi bọt của hai phương pháp
Sau khi lựa chọn được các thông số kỹ thuật tối ưu, tiến hành tạo vi bọt bằng
hai phương pháp theo các thông số đó, rồi so sánh khả năng tạo bọt của hai phương
pháp bằng cách đánh giá và so sánh các chỉ tiêu:
 Hình thức vi bọt
 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt
 Thể tích cột bọt
 Thời gian phân lớp của hệ bọt
 Độ bền của vi bọt theo thời gian
2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt
2.3.1.1.

Chuẩn bị dịch tạo bọt

16

-

Cân pha nước: 0,1g poloxamer 188 và 0,1g cremophor A25.

-

Cân pha dầu: 0,1g glycerolmonostearat.

-

Pha nước: hòa tan vào 30ml H2O trong cốc có mỏ, ngâm trong bể cách thủy ở
65oC trong 2 phút.

-

Pha dầu: cho vào cốc có mỏ, ngâm trong bể cách thủy ở 60oC trong 2 phút.

-

Đổ pha nước vào pha dầu, đặt đầu dị chìm sâu trong lòng dịch rồi tiến hành siêu
âm phân tán với cường độ siêu âm I= 20%, xung siêu âm 01/00 (s/s) trong thời
gian 5 phút.

-

Để nguội dịch tạo bọt về nhiệt độ phòng.

2.3.1.2.

Tạo vi bọt

 Tạo vi bọt bằng phương pháp khuấy cơ học
-

Cho 15ml dịch tạo bọt vào ống ly tâm. Cố định ống ở một ví trí nhất định.

-

Đuổi khơng khí: Sục khí N2 trong 1 phút, sau đó nâng đầu ống dẫn khí N2 lên khỏi
bề mặt dịch tạo bọt. Cố định lưu lượng khí N2.

-

Hạ bộ phận trục khuấy xuống ống ly tâm sao cho mặt phẳng dưới của trục cách
bề mặt dịch tạo bọt 3cm, cài đặt thông số máy và bắt đầu tạo bọt.

-

Sau khi tạo bọt xong, đổ dịch đã tạo bọt vào một ống nghiệm thủy tinh để tiến
hành các bước đánh giá.

 Tạo vi bọt bằng phương pháp siêu âm
-

Cho 15ml dịch tạo bọt vào cốc có mỏ 50ml. Cố định cốc trên giá tại một vị trí.

-

Đuổi khơng khí: Sục khí N2 trong 1 phút, sau đó nâng đầu ống dẫn khí N2 lên khỏi
bề mặt dịch tạo bọt. Cố định lưu lượng khí N2.

-

Đặt đầu dị của máy siêu âm sâu tiếp xúc với bề mặt dịch tạo bọt. Cài đặt thơng
số máy rồi bắt đầu q trình tạo bọt.

-

Sau khi tạo bọt xong, đổ dịch đã tạo bọt vào một ống nghiệm thủy tinh để tiến
hành các bước đánh giá.

2.3.2. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt
2.3.2.1.

Hình thức vi bọt: quan sát vi bọt trong tiêu bản qua kính hiển vi.

2.3.2.2.

Kích thước và phân bố kích thước vi bọt


17

Các bước tiến hành:
-

Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo bọt, tại thời điểm t= 10 phút, hút dịch chứa bọt tại một
vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản, đem soi trên kính

hiển vi kết nối camera ở vật kính 40, chụp và lưu hình ảnh.

-

Xử lý hình ảnh: sử dụng phần mềm hỗ trợ Image J.

-

Xử liệu thống kê dữ liệu về đường kính của vi bọt trong ảnh.
Đánh giá:

 Kích thước: đường kính trung bình của vi bọt
 Phân bố kích thước: đường kính trung bình ± 2SD (độ lệch chuẩn)
95,45% vi bọt có kích thước nằm trong khoảng này.
2.3.2.3.

Thể tích cột bọt: Thể tích cột bọt tạo thành được tính theo cơng thức:
V= V1–V0

Trong đó: V là thể tích cột bọt (ml)
V1 là thể tích dịch sau khi mới tạo bọt xong (ml)
V0= 15ml là thể tích dịch tạo bọt ban đầu
2.3.2.4.

Thời gian phân lớp của hệ bọt

Thời gian phân lớp của hệ bọt được tính kể từ khi đổ dịch vừa tạo bọt vào ống
nghiệm thủy tinh sau đó đậy kín đến khi dịch này phân thành 2 lớp rõ rệt, phía trên là
bọt trắng cịn ở dưới là lớp dịch trong (xem Phụ lục 1).
2.3.2.5.

Phương pháp đánh giá độ bền của vi bọt

 Đánh giá sự thay đổi của vi bọt khi giữ trong tiêu bản
Cách tiến hành:
-

Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo bọt, tại thời điểm t= 10 phút, hút dịch chứa bọt tại một
vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản.