Bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy lactobacillus sporogenes

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THANH QUỲNH TRANG

BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI




NGUYỄN THANH QUỲNH TRANG

BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN
NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:

ThS. Kiều Thị Hồng
DS. Tô Ngọc Sắc
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược



HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Kiều Thị Hồng, người đã
trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa
luận.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Tô Ngọc Sắc đã
đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài này.
Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị
kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình nghiên cứu
và làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người
luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống.
Em xin trân trọng cảm ơn!



Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thanh Quỳnh Trang

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cƣơng về probiotic 2
1.2. Lactobacillus sporogenes 3
1.2.1.  4
1.2.2. Lactobacillus sporogenes 7
1.2.3. Lactobacillus sporogenes  7
1.3. Đại cƣơng về sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật 8
1.3.1. ng 8
1.3.2. ng cu kin nuôi cn s ng và phát trin ca vi
sinh vt 10
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 12
2.1.1. Nguyên vt liu 12
ng s dng trong nghiên cu 12
2.1.3. Thit b. 13
2.2. Nội dung nghiên cứu. 13
2.2.1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t ch phm Estromineral và
nhn bit mt s m ca vi khun trong quá trình nuôi cy. 13
2.2.2. Kh ng cu kin nuôi cng sinh khi t
c ca Lactobacillus sporogenes. 13
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 14
p L. sporogenes t ch phm Estromineral 14
 ging trên thch nghiêng 14
y ging trong bình nón 14

 ng ca vi khun 15
m màu quan sát bào t  15
nh tính ion lactat trong dch nuôi cy 16
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18
3.1 . Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes từ chế phẩm Estromineral và
nhận biết một số đặc điểm của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy 18
3.1.1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t ch phm Estromineral 18
3.1.2. Nhn bit mt s m ca vi khun Lactobacillus sporogenes trong quá
trình nuôi cy 20
3.2. Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến lƣợng sinh khối tế
bào thu đƣợc của Lactobacillus sporogenes 23
3.2.1. La chu kin cp khí thích hp 23
3.2.2. La chn thi gian nuôi cy Lactobacillus sporogenes 25
 la chng thích h nuôi cy Lactobacillus
sporogenes 27
3.2.4. Kh ng ca ngun hydrat carbon 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Acid deoxyribo nucleic
ATP
Adenosin triphosphat
B. subtilis
Bacillus subtilis
B. clausii
Bacillus clausii
C. butyricum

Clostridium butyricum
GYE
Glucose  cao nm men
h
Gi
L. acidophilus
Lactobacillus acidophilus
L. kefir
Lactobacillus kefir
L. sporogenes
Lactobacillus sporogenes
MRS (de Man, Rogosa and Sharpe)
ng nuôi cy vi khun lactic
OD (optical density)
M quang
rpm (revolutions per minute)
Vòng mi phút



DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1.1
n ca Lactobacillus sporogenes vi
các chi Bacillus và Lactobacillus
5
1.2
Mt s ch phm probiotic cha Lactobacillus sporogenes trên

th ng
8
2.1
Các hóa cht s d tài
12
2.2
Các thit b s d tài
13
3.1
Giá tr    ca dch nuôi cy Lactobacillus sporogenes
ng MRS ti các thm kho sát
21
3.2
ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus
sporogenes u kin cp khí khác nhau.
24
3.3
Giá tr pH và m  quang ca dch nuôi cy Lactobacillus
sporogenes ti các thm kho sát
26
3.4
ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus
sporogenes ng khác nhau
28
3.5
ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus
sporogenes      ng có s dng các
long khác nhau
30
3.6

ng sinh kh   c khi nuôi cy Lactobacillus
sporogenes ng vi các
n khác nhau.
32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
1.1
S  cha t probioticc g
d liu PubMed NIH (t 
3
1.2
Hình nh nhum Gram t bào vi khun Lactobacillus sporogenes
4
1.3
Gi cu to bào t Lactobacillus sporogenes
6
1.4
ng ca vi sinh vt trong h thng kín (Theo
sách ca Prescott, Harley và Klein)
9
2.1
 phn nh tính (1) ion lactat 
16
2.2
 phn nh tính (2) ion lactate
17
3.1

Hình nh khun lc Lactobacillus sporogenes petri
19
3.2
Hình nh t ng ca Lactobacillus sporogenes ti thi
m 24h
19
3.3
Hình nh t ng và bào t ca Lactobacillus sporogenes
ti thm 48h
21
3.4
Kt qu phn nh tính ion lactat (1)
21
3.5
Kt qu phn nh tính ion lactat (2)
21
3.6
 th biu din s bing sinh khc khi
nuôi cy L. sporogenes vu kin cp khí khác nhau
24
3.7
ng ca Lactobacillus sporogenes khi nuôi cy
ng MRS, 37
o
C, 110 rpm
26
3.8
 th biu din s bing sinh khc khi
nuôi cy L. sporogenes vng khác nhau
28

3.9
 th biu din s bing sinh khc khi
nuôi cy L. sporogenes vi các long khác nhau
30
3.10
 th biu din s bing sinh khc khi
nuôi cy L. sporogenes vi các n ng khác nhau
32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic c bin là các li khun có nhiu giá tr thit thi vi sc
khng nhing tiêu hóa, ci thin kh 
nng min dch, gi[23]. Probiotic  c s
dng t r rong vài thp k tr l ng nghiên cu v
probiotic  ch phm probiotic có mt trên th ng xut hin ngày
càng nhiu [22].
Trong s các probiotic c s dng, không th không k n Lactobacillus
sporogenest chng vi khun có rt nhic tính ni tri: có kh 
sinh bào t giúp chng chu tt vu kin bt li c
l su qu u tr; có kh ng hình to acid L (+)
 có th chuyn hóa h[6].
Ti Vit Nam, vi khun Lactobacillus sporogenes c nghiên cu
trong nh ng nghiên cu và tp trung
ch yu vào nhóm ngành thc phm và thú y. Vi mong mun góp phn nh vào
nghiên cu L. sporogenes  Vi tài “Bƣớc đầu khảo sát điều kiện nuôi
cấy Lactobacillus sporogenes” c thc hin vi các mc tiêu:
1. Phân lp vi khun Lactobacillus sporogenes t ch phm Estromineral và nhn
bit mt s m ca vi khun trong quá trình nuôi cy.

2. Kh ng cu kin nuôi cn ng sinh khi t bào
c ca Lactobacillus sporogenes.


2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về probiotic
Thut ng probiotic có ngun gc t Hy L     
 ch i sn, nên probiotic có th hiu
n vi si. Hi
cht b ng cha nhng vi khun hay vi nm có ích [17], [19].
t s dng các thc phm có vi sinh vt
sng có l       nhng sc khe,
nmãi n hái nim probiotic mc nêu ra ln u tiên bi nhà
khoa hc Eli Metchnikoff trong cu sa ông. Ông 
 ph thuc ca h vi sinh vt trong rut vào thc phng rut có
kh p nhn  m i các h vi khu và thay
th vi khun có hi bng vi khun có l[13], [20].
Theo Parker (1974), probiotic là nhng vi sinh vn hay nm men
mà có th thêm vào thc phm vi mu chnh qun th sinh vng
rut ca sinh vt ch. Van De Kerkove (1979), Barrows và Deam (1985), Lestradet
(1995) cùng cho rng probiotic c s dt liu pháp trong viu tr
bnh tiêu chnh  ng v gin mc
ti thiu s phát tán ca vi sinh vng rut, s kháng li liu pháp sinh hc và
s a chng viêm d dày ru  rnh ng
v probioticProbiotic là các vi khu l hay hn hp các vi sinh vt sng khi
i hong vt s có ng có li cho sinh vt ch bng
cách ci thin h vi khung rut[20].
  T ch    gii (FAO) và T chc Y t th gii

(WHO)  probiotic Probiotic là nhng vi sinh vt
s vi m ln s ng có li cho sc
khe vt ch [19], [20].  không phi tt c nhng vi sinh vt s
là probiotic, ta t chc FAO và WHO, vi khuc s dng trong
các ch phm probiotic dng thc phm phu kin: có ngun
3

gc rõ ràng, phc hiu dòng,  
9


               
[12].
Vic s dng thc phm có cha vi sinh vt có l r
nghiên cu v probiotic mi thc s bùng n trong vài thp k g c k
vng ngày càng phát trin. Mt phân tích v c g d
licho thy có s nh m v s 
cha t probioticu tham kho v
probioticn nay, con s i tháng
n so v [22].

Hình 1.1. S a t probioticc g d
liu PubMed NIH (t  [22]

1.2. Lactobacillus sporogenes
i khuc phân lp bi B.W. Hammer ti Phòng thí nghim
nông nghip Iowa (M  c bi n l   i tên gi Bacillus
coagulans do mt bùng phát ca vic mt sn phc bit ca sa 
[14]. Horowitz và Wlasowa phân
Lactobacillus sporogenes [16]


Bacillus coagulans [9]. 
4

Lactobacillus và Bacillus
             
[11].  
Lactobacillus sporogenes 
 
Lactobacillus sporogenes 
1.2.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy
Lactobacillus sporogenes   
.
1.2.1.1. Tế bào sinh dưỡng
 
- Lactobacillus sporogenes        , hình
que,  0,5  0,7µm × 1,6  7,1 µm, 
[10], [14].
- Lactobacillus sporogenes 
[10], [14].

Hình 1.2. Lactobacillus sporogenes
 
- L. sporogenes 
35  50
o
 6,5 [10], [14].
- 
khác nhau: glucose, lactose, maltose, dextrose, fructose, galactose[6],
[14].

5

 
- L. sporogenes cho  [10], [14].
- L. sporogenes    
-).
acid D (-) lactic và acid L (+) lactic


              
         -    


 [8], [22].
Lactobacillus sporogenes Lactobacillus và
BacillusLactobacillus sporogenes


Bảng 1.1Lactobacillus sporogenes 
Bacillus và Lactobacillus [10]
Đặc tính
L. sporogenes
Lactobacillus
Bacillus
Catalase
+
-
+
Oxidase

-
-
+
Nitrate
-
-
+

+
-
+

+
+/-
+
Sinh acid lactic
+
+
-
Acid meso-diaminopimelic
+
+/-
+


6

1.2.1.2. Bào tử
K
 

    Lactobacillus sporogenes       
. 

Lactobacillus sporogenes có hình  sinh
 1,2 µm × 1,0  1,7 µm [6]
Lactobacillus sporogenes 


Hình 1.3. Lactobacillus sporogenes
(exosporium), màng ngoài (outer coat), màng trong
              
(               
(incorporated mother cell cytoplasma), nguyên sinh ch 
 [6], [18].

Lactobacillus sporogenes:
 In vitro
Lactobacillus sporogenes các 
  
o
C trong 20
  phosphat     
7

   9,6),
 
 8 l[6].
 In vivo
, Lactobacillus sporogenes 


bào 



Lactobacillus sporogenes 
qua phân [6], [15].

1.2.2. Vai trò của Lactobacillus sporogenes
- .
  ; c
probiotic
 [15].
- N

[15].
- C. H
 [15].
- C [15].
- enzym -
 [15].
1.2.3. Một số chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus sporogenes trên thị trƣờng
             
Lactobacillus sporogenes 
8

probiotic 
Lactobacillus sporogenes 
Bảng 1.2. Mt s ch phm probiotic cha Lactobacillus sporogenes trên th ng
STT
Tên

thƣơng mại
Thành phần
Dạng
bào chế
Nhà sản xuất
1
Estromineral
L. sporogenes
Viên nén
Rottapharm | Madaus
(Italia)
2
Biobaby
L. sporogenes,
B. subtilis,
C. butyricum
Cm pha hn
dch ung
Ildong Pharmaceutical
Co., Ltd. (Hàn Quc)
3
Biolac
L. sporogenes,
L. acidophilus,
L. kefir
Viên nang
CT TNHH MTV Vacxin
và sinh phm Nha Trang
4
Biotis Q.

tablets
L. sporogenes,
B. subtilis
Viên nén
Ildong Pharmaceutical
Co., Ltd. (Hàn Quc)
5
Insotac
L. sporogenes,
B. clausii
Thuc bt
c Phm
Mê Linh


1.3. Đại cƣơng về sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật
ng và phát trin là thu ca sinh vng vt và
thc vt, vi sinh vng và phát trin. Do các vi sinh vt rt nh nên
vic nghiên cu  mt cá th là rt khó, vì vy, khi nghiên cu v ng,
ng xét s bii v s ng ca c qun th vi sinh vt [2].
1.3.1. Đƣờng cong sinh trƣởng
, 


9


Hình 1.4. ng ca vi sinh vt trong h thng kín (Theo sách
ca Prescott, Harley và Klein) [2]
 n tim phát)

 là khong thi gian tính t khi vi khuc c ng dinh
n khi chúng bng. Trong n này vi khun không
phân chia, s ng t phi thích ng vng
mi, vì vy vi sinh vt phi tng hp mnh m ADN và các enzym chun b cho s
phân bào [2].
 Pha ch s n logarit)
n này, vi khun ng và phân chia vi t t, s
ng t cp s nhân n ci, thi gian th h t ti hng
si cht din ra mnh m nht [2].
 Pha cân bng
T , s

 
[2].
 Pha suy vong
S ng t bào sng trong qun th gim dn do cn kit chng, tích
c hi, mt s t bào t phân gii do các enzym ni bào [2].
10

1.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và phát triển của
vi sinh vật
Trong quá trình sinh ng và phát trin, vi sinh vt s dng t
ng  tng ht cn thit và chng t các yu t bên
ngoài. Mun nghiên cu và ng dng bt k vi sinh vc ht cn hiu
c ng ca thành phu t khác lên s sinh
ng và phát trin ca chúng.
 ng ca thành phng cng nuôi cy n s sinh
ng ca vi sinh vt.
Vi sinh vt ch yu thu nhc chng t ng bên ngoài.
 vào ch ng chia các

chng thành 5 nhóm ln: ngun carbon, ngun mu
các nhân t c [2].
 c là thành phn trung tâm ca mi quá trình sinh h
trò: hoà tan và vn chuyn các chng ca t bào, tham
gia hàng lot các phn ng hóa hc trong t bào Ngu p
 tng hp nên các cht có ch bào (acid nucleic,
, còn ngun carbon cung cng cn thit cho s ng và
phát trin ca vi sinh vt [2].
Ngun hydrat carbon ch yc vi sinh vt s dng gng, acid hu
 ng là ngun carbon và ngung tt cho vi sinh vt.
Có th ng thành các loi:
- Ribose, Glucose, Fructose, Galactose.
- Saccharose, Maltose, Lactose.
- Tinh bt, Inulin, Glycogen.
      carbon      khác nhau là không
, c carbon khác nhau,
. 

11


 [2].
 ng ca các yu t ng ca vi sinh vt.
Các yu t ng lên t c chia làm ba nhóm: yu t lý hc
(nhi m, áp sut, tia t ngoiu t hóa hng, n
oxy cng, các cht dit khuu t sinh hc (cht kháng sinh) [2].
Trong các yu t trên, không th không k n ng ca n n
s ng ca vi sinh vt. Oxy có vai trò vô cùng quan tri vi hong
sng ca vi sinh vt. Tùy thuc nhu cu s di ta chia vi sinh vt ra
thành các nhóm sau:

- Vi khun hiu khí bt buc: ch có th ng khi có mt oxy phân t.
- Vi khun hiu khí không bt buc (hay k khí tùy nghi): có th ng
c u kin có oxy ln không có oxy, ng t
- Vi khun vi hiu khí: ch có th u kin n oxy
thp.
- Vi khun k khí chng: không s dng oxy  tn ti khi có
mt oxy.
- Vi khun k khí bt buc: không sc khi có mt oxy [2].


12

Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Ch phm cha Lactobacillus sporogenes: Estromineral ca hãng Rotta |
Madaus (Italia)
 Nguyên ling
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong đề tài
2.1.2. Môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu
 ng MRS lng (MT 1)
Glucose 2,0 g
Pepton 1,0 g
Cao tht 1,0 g
Cao nm men 0,5 g
Natri acetat 0,5 g
Triamoni citrat 0,2 g
K
2
HPO

4
0,2 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,02 g
MnSO
4
.4H
2
O 0,005 g
c máy v 100 mL
 ng MRS thch (MT 2)
MT 2 = MT 1 
 ng canh thang (MT 3)
Pepton 1,0 g
Cao tht 0,5 g
Natri clorid 0,5 g
c máy v 100 mL
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Glucose

MnSO
4
.4H
2

O

Pepton
Merck -  
Triamoni citrat
Trung Quc

Merck - 
Natri acetat


Merck - 


K
2
HPO
4


Natri clorid

MgSO4.7H2O



13

 ng glucose  cao nm men (MT 4)
Glucose 5,0 g

Cao nm men 0,5 g
Amoni sulfat 0,3 g
KH
2
PO
4
0,2 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,1 g
c máy v 100 mL

2.1.3. Thiết bị.
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng trong đề tài

2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes từ chế phẩm Estromineral và
nhận biết một số đặc điểm của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy.
 Phân lp vi khun L. sporogenes t ch phm Estromineral
 Nhn bit mt s m ca vi khun L. sporogenes trong quá trình nuôi
cy
2.2.2. Khảo sát sơ bộ ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy đến lƣợng sinh khối
tế bào thu đƣợc của Lactobacillus sporogenes.
 La chu kin cp khí thích hp
 La chn thi gian nuôi cy L. sporogenes
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Tên thiết bị

Nguồn gốc
Cân phân tích

Ni hp tit khun
ALP  
Cân k thut

T cy vô trùng
Trung Quc
Lò vi sóng
Hàn Quc
T lnh
Nht
Máy lc
c
Kính hin vi
Nht
Máy ly tâm
c
ng nghim, bình nón,


Máy Vortex
c


14

  la chng thích hp  nuôi cy L. sporogenes
 Kh nh ng ca ngun hydrat carbon

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.
2.3.1. Phƣơng pháp phân lập L. sporogenes từ chế phẩm Estromineral
Pha ng MRS (MT 1) theo công thc  mc 2.1.2 vào bình nón
dung tích 250 mL, nút kín, hp tit trùng  121
o
  ngui. Tin
hành cy ging L. sporogenes t ch phm vào bình nón (cho viên Estromineral vào
bình hot hóa ging) trong t cy vô trùng. t trong máy lc  37
o
C, t 110
rpm trong 24 gi [5].
Sau 24 gi, vi khun phát tring. Cng
ng MRS th
m 37
o
C trong 24 gi. Sau 24 gi, xut hin khun lc màu trng trên b mt thch
[5].
2.3.2. Phƣơng pháp giữ giống trên thạch nghiêng
ng MRS thng nht các thành phn
ng, phân phi vào các ng nghim, mi ng 7 mL, nút kín, hp tit
trùng  121
o
t các ng nghim nm nghiêng, ng không
lên quá 2/3 chiu cao ca  n khi mt thch i. Dùng que cy
cy ging t ng tht nuôi trong t m  37
o
C trong 24
gi [5].
nh k cy truyn gi  ng thch nghiêng mi sau mi 1  2
tháng nhm gi c hot tính vi khun.

2.3.3. Phƣơng pháp cấy giống trong bình nón
 Hot hóa ging
ng MRS (MT 1) theo công thc  mc 2.1.2 vào bình nón
dung tích 250 mL, hp tit trùng  121
o
 ngui. Dùng que cy cy
mt vòng khun lc t ng gi gi    t trong máy lc 
37
o
C, t 110 rpm trong 24 gi [4].

15

 Cy ging vào bình nón
Chun b ng trong bình nón dung tích 250 mL, hp tit trùng 
121
o
 ngui. Cy 5 mL hn dch gic hot hóa  trên
t trong máy lc  37
o
C, t 110 rpm [4].
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá sự sinh trƣởng của vi khuẩn
 Phƣơng pháp ly tâm thu sinh khối
Vi khuc nuôi cy ng s phát tri
sinh khi. Hn dch t bào vi khun trong tc ly tâm  t 4.000
rpm trong thi gian 15 phút. Tách riêng phn dch nc sinh khi t bào 
ng ly tâm [4].
ng sinh khc có th  ng vi sinh vt.
 Phƣơng pháp đo quang đánh giá sự sinh trƣởng của vi khuẩn
Nuôi cy Lactobacillus sporogenes   ng MRS trong máy lc 

37
o
C, t 110 rpm. Sau các khong thi gian nhnh tính t khi bu cy
ging, tin hành trích m quang  c sóng 610 nm vi mu trng
ng nuôi cy không có vi sinh vc chun b song song [4], [14].
2.3.5. Phƣơng pháp nhuộm màu quan sát bào tử (phƣơng pháp Ogietska)
 Nguyên tc:
Da trên cc bit ca màng bào t: dày, chc, khó bt màu, cha nhiu
u tiên: x  t bào cht ca bào t d bt màu vi nhit và acid. Tip
theo, nhum màu c t bào cht ca t bào và bào t bng thuc nhum có hot tính
mó, ty màu t bào cht ca t m bng thuc nhum màu
b sung. Kt qu là phân bic t bào ng và bào t ca vi sinh vt do
màu sc khác nhau [4].
 Tin hành:
- Làm tiêu bn vt bôi ca Lactobacillus sporogenes khô t nhiên.
- Nh vài git HCl 0,5% lên vn ln cho bc
 2 phút ri rc.
16

- t lên vt bôi ming giy lc, nh dung d
n khi bu thuc nhum cn phi b sung ngay và gi trong 5
phút.
- B giy ra, ra li vt bôi bc.
- Ty màu bng cách nhúng phin kính vào dd H
2
SO
4
1% trong 2 phút.
- Ra vt bôi bc.
- Nhum vt bôi bng Xanh methyen Loeffler trong 5  15 phút.

- R vt bôi khô t nhiên.
- i kính hin vi vi vt kính du: bào t b, t bào bt
màu xanh [4].
2.3.6. Phƣơng pháp định tính ion lactat trong dịch nuôi cấy
 Phn nh tính (1).
ng ch phc. Hoc
ly 5 mL dung dch theo chuyên lun vào trong ng nghim.
Tin hành phn nh tính bng cách thêm các hóa cht và thc hin theo
quy trình sau:

Hình 2.1.  phn nh tính (1) ion lactat 

17


 Phn nh tính (2).


Hình 2.2.  phn nh tính (2) ion lactat [5]