Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương phản trong siêu âm chẩn đoán

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG PHƯƠNG HẢO
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
BÀO CHẾ VI BỌT
DÙNG LÀM CHẤT TƯƠNG PHẢN
TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2015



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


HOÀNG PHƯƠNG HẢO
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
BÀO CHẾ VI BỌT
DÙNG LÀM CHẤT TƯƠNG PHẢN
TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Phúc Nghĩa

Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI- 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
TS. Nguyễn Phúc Nghĩa
Là người đã dành rất nhiều thời gian và công sức trực tiếp hướng dẫn và tạo
điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này.
Để có được những kết quả đúng thời hạn, có độ chính xác trong phạm vi khoá
luận này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của:
Các cán bộ thuộc Viện công nghệ dược phẩm quốc gia.
Các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ môn Tổng hợp Hoá Dược, bộ
môn Vật lý- Hoá lý- Trường Đại học Dược Hà Nội.
Và toàn thể các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện- Trường
Đại học Dược Hà Nội.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi
trong suốt quá trình vừa qua.
Hà Nội ngày 14 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Hoàng Phương Hảo



MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Sự cần thiết của tác nhân siêu âm tương phản 2
1.2. Cơ chế tăng cường tương phản của vi bọt 2
1.3. Những vi bọt lý tưởng cho siêu âm tương phản 3
1.4. Cấu tạo vi bọt 4
1.4.1. Lõi khí 5
1.4.2. Vỏ ngoài 6
1.5. Phương pháp bào chế vi bọt bằng siêu âm 9
1.6. Cơ chế hoà tan vi bọt 10
1.6.1. Vi bọt với lõi không khí 10
1.6.2. Vi bọt với lõi không khí kết hợp với khí ổn định 11
1.6.3. Cơ chế hoà tan vi bọt có vỏ được ổn định bằng các chất diện
hoạt 11
1.7. Ứng dụng khác của vi bọt trong y học 12
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 13
2.1.1. Nguyên vật liệu 13
2.1.2. Thiết bị 13
2.2. Nội dung nghiên cứu 14


2.3. Phương pháp nghiên cứu 14
2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt 14
2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt 16
2.3.3. Phương pháp đánh giá độ bền vi bọt 16
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1. Thực nghiệm và kết quả 18
3.1.1. Khảo sát khả năng tạo bọt từ dịch tạo bọt một thành phần 18
3.1.2. Khảo sát khả năng tạo bọt từ dịch tạo bọt nhiều thành phần 20
3.1.3. Khảo sát thông số siêu âm tạo vi bọt từ nguyên liệu vỏ thích
hợp 24
3.1.4. Đánh giá độ bền vi bọt 31
3.2. Bàn luận 32
3.2.1. Về phương pháp bào chế 32
3.2.2. Về nguyên liệu bào chế 33
3.2.3. Về thông số bào chế 33
3.2.4. Về phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt 34
3.2.5. Về đặc tính hoá lý của vi bọt 34
3.2.6. Về độ bền vi bọt 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
1. KẾT LUẬN 36
2. KIẾN NGHỊ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
GMS Glycerol monostearate
PVA Poly vinyl ancol
PLGA Copolyme poly (D, L-lactide-co-glycolide)
DNA Axit deoxyribo nucleic
PFC Perfluorocarbon
CT Công thức

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng
Tên bảng
Trang
1
1.1
Âm trở một số môi trường
2
2
2.1
Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
13
3
2.2
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
14
4
2.3
Công thức các dịch nhiều thành phần
15
5
3.1
Thời gian phân lớp vi bọt của các dịch tạo bọt một
thành phần
19
6
3.2
Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt
thay đổi theo nguyên liệu tạo vỏ

22
7
3.3
Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt
thay đổi theo cường độ siêu âm I
25
8
3.4
Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt
thay đổi theo xung siêu âm d
27
9
3.5
Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt
thay đổi theo thời gian siêu âm t
29



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
Hình/ Đồ thị
Tên hình/ đồ thị
Trang
1
Hình 1.1
Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ
khác nhau
5
2

Hình 3.1
Cột bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) thời
điểm phân 3 lớp (trái) và phân 2 lớp (phải)
18
3
Hình 3.2
Vi bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) quan sát
ở vật kính 10x
19
4
Hình 3.3
Cột bọt tạo từ CT 3 thời điểm phân 3 lớp (trái)
và phân 2 lớp (phải)
20
5
Hình 3.4
Vi bọt tạo từ CT 3 quan sát ở vật kính 40x
21
6
Hình 3.5
Phân bố kích thước vi bọt tạo từ các nguyên liệu
khác nhau
23
7
Hình 3.6
Phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi cường độ
siêu âm
26
8
Hình 3.7

Phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi xung siêu
âm
28
9
Hình 3.8
Phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi thời gian
siêu âm
30
10
Hình 3.9
Độ bền vi bọt trên một vi trường
31
11
Hình 3.10
Độ bền vi bọt trong ống nghiệm
32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Siêu âm là phương pháp chẩn đoán hình ảnh quan trọng trong y học. Đây là
phương pháp thăm khám không gây chảu máu, không nguy hiểm và rất kinh tế nên
được ứng dụng rộng rãi tại các cơ sở y tế từ trung ương đến địa phương.
Siêu âm được sử dụng phổ biến nhất trong các kỹ thuật chẩn đoán bằng hình
ảnh trên thế giới. Ví dụ ở Hoa Kỳ có khoảng 75000 dụng cụ cho siêu âm, trong khi
đó chỉ có 7000 dụng cụ cho chụp cắt lớp vi tính và 5000 dụng cụ cho hình ảnh cộng
hưởng từ [22]. Ở Việt Nam, siêu âm đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 1970.
Tuy nhiên không giống các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, như X- quang hay
chụp cộng hưởng từ, siêu âm đã bị hạn chế nhiều trong chẩn đoán do thiếu tác nhân
tăng cường độ tương phản. Ví dụ trong siêu âm tim có đến 20% các trường hợp không

cung cấp chất lượng hình ảnh đầy đủ cho phép quan sát trực quan bên trong tim để
chẩn đoán chính xác về rối loạn chức năng tâm thất. Do đó bắt buộc phải bổ sung
thêm các quy trình kiểm tra khác mà những phương pháp đó thường xâm lấn, đắt tiền
hơn và đôi khi rủi ro cao hơn [22].
Tác nhân tương phản siêu âm được định nghĩa là tác nhân có thể làm thay đổi
độ tương phản của hình ảnh siêu âm một cách có ý nghĩa giúp các chẩn đoán có thể
phân biệt được điều kiện bình thường và bất thường [22]. Trên thế giới, vi bọt đã
được sử dụng phổ biến làm tác nhân tương phản lí tưởng cho siêu âm. Tuy vậy, ở
Việt Nam, bào chế và ứng dụng vi bọt trong siêu âm tương phản là một vấn đề rất
mới mẻ. Do vậy, đề tài: “Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương
phản trong siêu âm chẩn đoán” được thực hiện nhằm mục đích:
1. Khảo sát lựa chọn nguyên liệu và thông số bào chế vi bọt
2. Đánh giá một số đặc tính hoá lý và độ bền của vi bọt
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Sự cần thiết của tác nhân siêu âm tương phản
Vi bọt được sử dụng làm tác nhân tăng cường tương phản trong siêu âm vì:
- Phần lớn cơ thể người là nước (73%) nên cơ thể đồng nhất về âm. Máu và mô
xung quanh có cùng mức độ phản xạ âm nên khó phân biệt rõ ràng dòng máu,
tưới máu hoặc mặt phân cách giữa mô và máu trong siêu âm [15].
- Siêu âm với tác nhân vi bọt có thể đánh giá dòng máu trong thời gian thực.
- Siêu âm với tác nhân vi bọt an toàn hơn các hình ảnh học phân tử khác (ví dụ
như hình ảnh học đồng vị phóng xạ sử dụng chất phóng xạ ảnh hưởng không
tốt đến sức khoẻ bệnh nhân trong khi đó vi bọt khá an toàn) [16].
- Các hình ảnh học phân tử khác như chụp cộng hưởng từ, chụp cắt lớp bằng
bức xạ positron và chụp cắt lớp đơn photon rất đắt tiền. Trong khi đó siêu âm
là phương pháp chẩn đoán kinh tế và phổ biến [14].
- Vì vi bọt tạo phản xạ âm rất mạnh nên chỉ cần liều tiêm tĩnh mạch nhỏ khoảng
microgram vi bọt. Trong khi đó các phương pháp hình ảnh học phân tử khác

(như chất tương phản của cộng hưởng từ) cần tới vài milligram tác nhân tương
phản [14].
1.2. Cơ chế tăng cường tương phản của vi bọt
Âm trở (Z): Mỗi một môi trường có đặc điểm cấu trúc, tính chất và mật độ
khác nhau gây ra những cản trở vận tốc siêu âm khác nhau. Sự cản trở đó là âm trở
của môi trường. Âm trở của môi trường tỉ lệ với mật độ của môi trường và tốc độ lan
truyền siêu âm.
Bảng 1.1. Âm trở một số môi trường
Môi trường
Âm trở (g/cm
2
.s)
Nước 37
o
C
1,49 x 10
5

Không khí
0,0004 x 10
5

Cơ
1,60 x 10
5

3

Máu
1,60 x 10

5

Thận
1,62 x 10
5

Gan
1,65 x 10
5

Xương
6,10 x 10
5

Khi một nguồn siêu âm lan truyền qua hai môi trường có âm trở khác nhau sẽ
tạo nên hiện tượng phản xạ siêu âm, còn một phần siêu âm xuyên qua môi trường.
Chênh lệch âm trở càng lớn thì cường độ chùm siêu âm phản xạ càng tăng. Thiết bị
siêu âm sẽ thu sóng phản xạ có cường độ khác nhau và biến đổi thành hình ảnh, như
vậy hình ảnh siêu âm được tạo nên nhờ chùm siêu âm phản xạ từ các mặt phân cách
đối tượng khảo sát với môi trường xung quanh. Cường độ chùm siêu âm phản xạ càng
lớn thì hình ảnh siêu âm càng rõ.
Mặt khác, chất khí có khả năng nén cao hơn vài lần so với chất lỏng và chất
rắn, điều này làm cho vi bọt có khả năng tăng cường âm tốt hơn. Chỉ cần tiêm tĩnh
mạch một lượng nhỏ tác nhân vi bọt thì phần không gian máu chứa vi bọt, bao gồm
cả các buồng tim sẽ trở nên sáng hơn, cho phép phân biệt máu với các mô xung quanh
[22].
Ngoài việc tạo một chênh lệch âm trở lớn giữa vi bọt và các bộ phận cơ thể, vi
bọt cũng cộng hưởng với sóng siêu âm, làm tăng mức phản xạ tại vị trí có vi bọt lên
rất nhiều, điều này cho phép thiết bị siêu âm nhận được duy nhất tín hiệu phản xạ siêu
âm từ vi bọt [17]. Đặc biệt, vi bọt với kích thước micromet thường cộng hưởng trong

dải tần số siêu âm chẩn đoán thông thường (1-3 MHz). Các vỏ bao quanh các vi bọt
có thể cản trở khả năng cộng hưởng, mức độ cản trở này phụ thuộc vào bản chất của
vỏ.
Tuy nhiên, quá nhiều vi bọt lại tạo ra một phản xạ âm quá lớn có thể cản trở
sự xâm nhập của chùm siêu âm vào sâu các mô tạo ra hình ảnh quá sáng gây khó
khăn trong chẩn đoán [22].
1.3. Những vi bọt lý tưởng cho siêu âm tương phản
4

Vi bọt khi sử dụng làm tác nhân tương phản siêu âm thì đầu tiên, kích thước
cần phải được kiểm soát trong giới hạn quy định (1- 10μm) và phân bố kích thước
càng hẹp càng tốt. Kích thước vi bọt quá nhỏ sẽ phản xạ âm kém và vi bọt không bền,
kích thước quá lớn vi bọt sẽ không đi qua được lòng mao mạch và có thể gây tắc
mạch. Kích thước vi bọt cần phải được kiểm soát tại cả hai thời điểm trước khi tiêm
và trong suốt thời gian lưu thông trong cơ thể, cần phải hạn chế việc tăng kích thước
do hợp nhất các vi bọt.
Thứ hai, vi bọt cần phải ổn định trong thời gian một cuộc siêu âm chẩn đoán.
Vì vậy, thời gian bán thải thích hợp của vi bọt trong cơ thể là một yêu cầu quan trọng
[24].
Ngoài ra, vi bọt sẽ tốt hơn nếu:
- Không chứa các thành phần có nguồn gốc từ protein máu
- Có một lớp vỏ đàn hồi giúp tăng khả năng cộng hưởng
- Đạt hiệu quả tăng cường tương phản ở liều thấp
- Dễ dàng chuyển hóa hoặc bài tiết và có rất ít tác dụng phụ
- Dễ dàng để sản xuất hàng loạt
- Có thể vô trùng bằng nhiệt
1.4. Cấu tạo vi bọt
Vi bọt là tác nhân tương phản quan trọng đối với siêu âm chẩn đoán. Đường
kính của một vi bọt xấp xỉ bằng kích thước của một tế bào hồng cầu (dưới 10µm)
[17]. Lõi khí chiếm phần lớn khối lượng vi bọt, phân bố đồng đều trong vi bọt và

quyết định cơ chế phản xạ siêu âm. Do chứa lõi khí với mức độ phản xạ âm cao hơn
hẳn mức độ phản xạ âm của mô mềm cơ thể nên khi sử dụng tác nhân tương phản là
vi bọt, mức độ phản xạ âm được tăng cường sẽ cung cấp hình ảnh có chất lượng cao
hơn, qua đó tăng độ chính xác và độ tin cậy của việc chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, nếu
chỉ riêng lõi khí tồn tại trong môi trường nước sẽ không ổn định do ảnh hưởng của
sức căng bề mặt [24], vì thế vi bọt cần một vỏ bao quanh bên ngoài. Vỏ ngoài bao
5

bọc có vai trò như một rào cản giữa lõi khí và môi trường nước xung quanh và giúp
ổn định vi bọt. Vỏ có thể được tạo bởi chất diện hoạt, lipid, protein, polyme, hoặc kết
hợp các vật liệu này.

Hình 1.1. Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ khác nhau
1.4.1. Lõi khí
Lõi khí là phần quan trọng nhất của vi bọt vì nó quyết định mức độ phản xạ
âm. Khi được siêu âm, vi bọt sẽ bị nén, dao động, và sau đó phản xạ lại âm. Điều này
tạo ra một hình ảnh có độ tương phản cao hơn hẳn trong siêu âm. Lõi khí có thể là
không khí, perfluorocarbon (PFC), hoặc nitơ [15]. Những khí kém tan trong nước sẽ
khó thoát khỏi vi bọt hơn và tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn máu [18].
Các dẫn chất PFC được dùng rất phổ biến trong bào chế vi bọt do tính tan trong
nước thấp và áp suất hơi cao, các khí này giúp vi bọt đạt được sự ổn định cần thiết
khi làm tác nhân siêu âm tương phản. Độ tan trong nước thấp sẽ làm giảm sự thoát
khí vào máu (một nguyên nhân gây co nhỏ vi bọt). Áp suất hơi cao sẽ làm khí chậm
hoá lỏng hơn khi mà áp lực Laplace không ngừng tăng lên do vi bọt bị co nhỏ theo
thời gian, mà khí hoá lỏng là nguyên nhân vi bọt bị méo mó, nhăn nhúm hoặc biến
mất. Khi tiêm vào cơ thể, vi bọt được phân phối trong khắp không gian mạch máu và
tồn tại trong suốt thời gian của một cuộc kiểm tra siêu âm, do đó, độ tan thấp và áp
suất hơi cao của khí sẽ kiểm soát chặt chẽ kích thước, sự phồng lên của vi bọt và đặc
biệt tạo vỏ có biến dạng đàn hồi cao tránh gây vỡ bọt khi siêu âm [22].
6

Nitơ là chất khí không màu, không mùi, không vị, hơi nhẹ hơn không khí, hoá
lỏng ở -196
o
C, hoá rắn ở -210
o
C. Khí nitơ tan rất ít trong nước (ở điều kiện thường,
1 lít nước hoà tan được 0,015 lít khí nitơ). Nitơ không duy trì sự cháy và sự hô hấp.
Vì có liên kết ba với năng lượng liên kết lớn nên phân tử nitơ rất bền. Ở nhiệt độ
thường, nitơ khá trơ về mặt hoá học. Vì độ tan thấp trong nước nên nitơ cũng được
dùng trong bào chế vi bọt.
1.4.2. Vỏ ngoài
Nguyên liệu vỏ cần phải có sự tương thích sinh học, chất liệu càng ưa nước sẽ
càng nhanh được thải trừ khỏi cơ thể sau khi đã siêu âm xong. Chất liệu vỏ còn ảnh
hưởng đến độ đàn hồi cơ học của vi bọt. Chất liệu càng đàn hồi, càng chịu được năng
lượng siêu âm cao trước khi bị phá vỡ. Các nguyên liệu có thể sử dụng để tạo vỏ gồm
lipid (vỏ dày ~ 3nm), protein (vỏ dày 15-20nm) và polyme (vỏ dày 100-200nm). Các
phân tử lipid được liên kết chặt chẽ với nhau thông qua lực Van der Waals và do bản
chất kỵ nước của chúng. Các protein được liên kết bằng cầu nối disulfide giữa các
nhóm thiol trong quá trình siêu âm. Các chuỗi polyme liên kết ngang hoặc liên kết
chéo [24].
1.4.2.1. Vỏ protein
Albumin là thành phần cấu tạo vỏ vi bọt đầu tiên được sử dụng làm tác nhân
tương phản trong hình ảnh siêu âm. Công thức vi bọt albumin đầu tiên được sự chấp
thuận của Cục Quản lý Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) là Albunex. Albunex bao
gồm khoảng 7x10
8
vi bọt/ ml với đường kính khoảng 1-15µm [5]. Khi bảo quản lạnh,
Albunex ổn định ít nhất hai năm. Vi bọt vỏ albumin được tạo thành bằng cách siêu
âm dung dịch albumin huyết thanh nóng 5% (kl/tt) trong điều kiện có không khí. Cần

phải làm nóng để làm biến tính các albumin trước khi siêu âm và tạo điều kiện đóng
vỏ [19]. Vỏ albumin được liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide giữa các phân
tử cystein trong quá trình tạo bọt [12].
7

Từ Albunex, một loại vi bọt vỏ albumin khác được tạo ra nhưng với lõi khí là
perfluorocarbon, được đặt tên là Optison ™ [7]. Độ hòa tan thấp của khí
perfluorocarbon giúp các vi bọt lưu thông ổn định lâu dài trong cơ thể [21].
Một số protein khác cũng được sử dụng để làm vỏ vi bọt. Cavalieri và đồng
nghiệp sử dụng lysozyme để tạo vi bọt và nhận thấy chúng khá ổn định [3]. Trong
báo cáo của mình, Cavalieri và đồng nghiệp đã khẳng định vai trò của cầu nối
disulfide trong việc hình thành lớp vỏ protein ổn định.
1.4.2.2. Vỏ chất diện hoạt
Chất diện hoạt là một nhóm khá lớn của các hợp chất hoá học. Do cấu tạo gồm
hai phần: phần thân nước và phần thân dầu nên các chất diện hoạt có khả năng hấp
phụ trên bề mặt phân cách pha và tạo thành một lớp đơn, đa phân tử hoặc các ion
được định hướng làm thay đổi bản chất phân cực của lớp bề mặt và giảm năng lượng
bề mặt giữa hai pha [1]. Nhờ vậy, vỏ chất diện hoạt dễ dàng hình thành bao quanh lõi
khí và giúp vi bọt ổn định.
Wheatley và đồng nghiệp đã xây dựng công thức vi bọt với vỏ là hỗn hợp các
chất diện hoạt Span- 40 và Tween- 40 [23] [25]. Dung dịch Span/ Tween với tỉ lệ 1:1
được siêu âm trong không khí để tạo thành các vi bọt ổn định. Tỷ lệ này được xác
định nhờ phương pháp màng phim Langmuir Blodgett [25].
Một công thức khác về vi bọt liên quan đến chất diện hoạt được Dressaire và
đồng nghiệp thiết kế từ sucrose stearat (mono và di-ester) kết hợp với 75% khối lượng
siro glucose ở 70°C [9]. Những vi bọt này ổn định hơn một năm và cho thấy nhiều
ưu điểm đáng chú ý.
1.4.2.3. Vỏ lipid
Vi bọt vỏ lipid là một trong những công thức có nhiều ứng dụng nhất trong
hình ảnh y sinh học và phân phối thuốc. Lipid có nhiều trong tự nhiên và khá tương

thích sinh học.
8

Vỏ lipid có khá nhiều ưu điểm. Nhờ cấu tạo lưỡng cực một đầu thân nước và
một đầu thân dầu, phospholipid sẽ dễ dàng tạo vỏ bao xung quanh lõi khí. Mặt khác
vỏ lipid làm giảm sức căng bề mặt giúp ổn định các vi bọt [10], bởi vì sức căng bề
mặt phân cách gây ra áp suất Laplace cao, là nguyên nhân chính làm lõi khí bị hoá
lỏng [10]. Ngoài ra, nhờ bản chất kỵ nước và lực liên kết Van der Waals giữa các
chuỗi acyl mà các phân tử lipid liên kết rất chặt chẽ với nhau làm tăng khả năng đàn
hồi của vi bọt và giảm sự thoát khí ra bên ngoài giúp chúng ổn định cho tới khi siêu
âm phá vỡ bọt [13].
1.4.2.4. Vỏ polyme
Trong vi bọt hình thành từ nguyên liệu polyme, các phân tử polyme tạo vỏ liên
kết với nhau bằng liên kết ngang hoặc liên kết chéo. Vì thế vỏ polyme tương đối dày,
có khả năng đàn hồi, khả năng tăng độ hồi âm và phân phối thuốc tốt hơn hơn vỏ lipid
và albumin.
Wheatley và đồng nghiệp (1990) báo cáo về vi bọt có vỏ được bào chế bằng
phương pháp gel hoá ion [26]. Vi bọt được tạo ra bằng cách phun dung dịch alginate
vào thùng chứa để tạo một lớp màng giữa pha khí và pha lỏng rồi hoá rắn khi nhúng
vào dung dịch canxi. Siêu âm các dung dịch này trước khi tạo bọt làm tăng chất lượng
vi bọt. Tuy nhiên đường kính vi bọt tạo ra khá lớn (từ 30 đến 40µm) nên không thể
truyền tĩnh mạch.
Bjerknes và đồng nghiệp (1997) đã mô tả một phương pháp để tạo vi bọt với
vỏ kép este polyme với các mắt xích ethylidene, sử dụng phương pháp bay hơi dung
môi nhũ tương [2]. Các vi bọt này có đường kính phân bố rộng từ 1-20µm. Quan sát
trên kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy các vi bọt đã
bị kéo dài ra, hình dạng nhăn nhúm. Vỏ polyme thường dày 150-200nm.
Nayaran và Wheatley (1999) đã báo cáo về vi bọt tạo thành bởi sự phân hủy
sinh học copolyme poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA). Các vi cầu đã được sử
9

dụng một lõi rắn dễ bay hơi, sau này có thể thăng hoa đi và tạo ra vi bọt. Đường kính
vi bọt dao động trong khoảng 2-20µm.
Vào năm 2005, Cavalieri và đồng nghiệp mô tả một phương pháp để tạo ra vi
bọt có vỏ là PVA [4]. Vi bọt được tạo ra bằng cách khuấy dung dịch PVA đã được
xử lý ở tốc độ cao (8000 vòng/ phút). Đường kính trung bình vi bọt là khoảng 6 ±
1µm. Độ dày vỏ có thể được giảm từ 0,9 xuống 0,7µm khi giảm nhiệt độ tác động từ
nhiệt độ phòng đến 4°C. Vi bọt PVA có hạn sử dụng trong vài tháng và có khả năng
vận chuyển thuốc kỵ nước, chất mang polyme (ví dụ DNA), phân phối thuốc tới đích.
1.5. Phương pháp bào chế vi bọt bằng siêu âm.
Siêu âm là phương pháp phổ biến nhất để bào chế vi bọt. Khi sóng siêu âm đi
qua một chất lỏng, sự giãn nở do siêu âm sẽ gây ra áp suất âm trong chất lỏng và kéo
các phân tử ra xa nhau. Khi áp suất âm này lớn hơn sức căng bề mặt của chất lỏng
(sức căng cực đại này lại phụ thuộc vào từng chất) tức là cường độ siêu âm đủ mạnh
thì sự giãn nở này sẽ tạo ra những lỗ hổng. Sau đó nguyên liệu tạo vỏ sẽ bao phủ dần
lên lỗ hổng và vi bọt được hình thành. Nhiệt độ và áp suất cao do sóng siêu âm tạo ra
những biến đổi hoá học của nguyên liệu tạo vỏ làm tăng độ ổn định cho vi bọt [12].
Phân bố kích thước vi bọt bào chế bằng siêu âm phụ thuộc vào tần số, cường
độ và xung siêu âm. Phân bố kích thước này tương đối rộng nên cần phải kiểm soát
chặt chẽ [20].
Trong đề tài này, máy siêu âm sử dụng bào chế vi bọt có các thông số sau:
Cường độ, xung và thời gian siêu âm. Các thông số này đều ảnh hưởng đến chất lượng
vi bọt bào chế được:
- Cường độ siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng tạo lỗ hổng để hình thành nên vi
bọt và ảnh hưởng đến độ ổn định vi bọt tạo ra
- Xung siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng lấy khí tạo lõi khí cho vi bọt
- Thời gian siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng tạo lớp vỏ bền cho vi bọt
10

1.6. Cơ chế hoà tan vi bọt

1.6.1. Vi bọt với lõi không khí
Trong dung dịch, một vi bọt với lõi không khí chịu tác động của áp suất
Laplace và áp suất khí quyển. Áp suất không khí bên trong vi bọt (P
int
) cân bằng với
tổng áp suất Laplace (P
lap
) và áp suất khí quyển (P
atm
) theo phương trình:
P
int
= P
lap
+ P
atm
=


+ P
atm
(1)
σ: sức căng bề mặt giữa vi bọt và môi trường; r: bán kính vi bọt
Theo định luật Henry: Ở nhiệt độ không đổi, lượng một chất khí tan trong một
chất lỏng tỉ lệ thuận với áp suất riêng phần của chất khí đó trên chất lỏng.
Ban đầu, áp suất không khí trong vi bọt đang rất cao nên nó có xu hướng
chuyển dịch một phần không khí ra ngoài môi trường lỏng. Điều này làm cho kích
thước vi bọt giảm đi nhanh chóng [22].
Dựa theo phương trình (1), khi kích thước vi bọt (r) giảm đi, áp suất Laplace
tăng lên càng khiến vi bọt co nhỏ nhanh hơn. Phương trình mô tả động học hoà tan

của một vi bọt lõi không khí trong môi trường nước được Epstein và Plesset đưa ra
như sau:
















) (2)
Dw: Hệ số khuếch tán pha khí
F: Tỉ lệ giữa nồng độ không khí tan trong nước và nồng độ không khí khi đã
cân bằng với áp suất khí quyển
L: Hệ số Ostwald. L =



11

Từ phương trình (2) ta thấy để làm giảm tốc độ hoà tan của vi bọt cần sử dụng
khí ổn định (như PFC hoặc nitơ). Khí sử dụng tốt nhất là không hoà tan trong nước,

có tốc độ hoà tan trong nước thấp và kích thước phân tử lớn.
1.6.2. Vi bọt với lõi không khí kết hợp với khí ổn định
Với vi bọt có lõi khí gồm không khí và khí ổn định, sự thay đổi kích thước vi
bọt sẽ theo ba bước [22]:
- Bước 1: Trong một vài giây ngay sau khi được tạo ra, khí ổn định vẫn giữ
trong vi bọt. Lúc này chỉ xảy ra sự trao đổi không khí nhằm cân bằng áp suất
bên trong với áp suất khí quyển bên ngoài. Nếu lượng khí ổn định nhiều, không
khí sẽ từ bên ngoài khuếch tán vào bên trong vi bọt làm vi bọt to lên và ngược
lại. Như vậy, lượng khí ổn định ban đầu sẽ quyết định vi bọt to lên hay nhỏ đi
nhờ lượng không khí đi ra hoặc vào vi bọt.
- Bước 2: Khi đã có sự cân bằng về áp suất không khí, khí ổn định bắt đầu
khuếch tán ra bên ngoài làm giảm kích thước vi bọt. Khi kích thước vi bọt
giảm, áp suất Laplace tăng lên do đó áp suất của khí ổn định cũng tăng lên để
tạo cân bằng.
- Cuối cùng, khi áp suất khí ổn định trong vi bọt quá lớn sẽ làm ngưng tụ khí ổn
định. Lúc này trong vi bọt khí ổn định tồn tại ở dạng lỏng, vi bọt bị biến dạng
hoặc thậm chí biến mất.
1.6.3. Cơ chế hoà tan vi bọt có vỏ được ổn định bằng các chất diện hoạt
Trong phần lớn các trường hợp, một màng chất diện hoạt tan trong nước bao
quanh lõi khí có tác dụng làm chậm quá trình hoà tan vi bọt nhờ làm giảm áp suất
Laplace đồng thời làm giảm khả năng khuếch tán khí ra ngoài.
Thực tế, trên bề mặt vi bọt luôn tồn tại sự trao đổi các phân tử chất diện hoạt
với môi trường xung quanh nhằm cân bằng nồng độ chất diện hoạt. Sự hấp thụ hoặc
rời đi của các chất diện hoạt khỏi bề mặt vi bọt sẽ tạo ra một lỗ trống tạm thời, cho
phép các phân tử khí di chuyển tự do qua đó.
12

Đối với màng phim chất diện hoạt không tan trong nước, sự trao đổi khí với
môi trường xung quanh giảm đi một cách có ý nghĩa. Borden và Longo đưa ra phương
trình hoà tan vi bọt như sau:



=




(







) (3)
Trong đó Rp là khả năng hạn chế sự khuếch tán khí của màng vi bọt.
1.7. Ứng dụng khác của vi bọt trong y học
Ngoài vai trò là tác nhân tương phản trong siêu âm, vi bọt còn nhiều ứng dụng
quan trọng trong y học như hình ảnh phân tử, liệu pháp gen và vận chuyển thuốc tới
đích.
Để ứng dụng trong hình ảnh phân tử, những vi bọt được thiết kế có khả năng
chọn lọc các receptor đích và tại đó, vi bọt sẽ tăng cường mức độ phản xạ âm. Nhờ
vậy mà các tín hiệu từ receptor đích được ghi lại [6] [14]. Một số bệnh sử dụng
phương pháp này như viêm và xơ vữa động mạch [8] [11].
Trong liệu pháp gen, người ta tiêm đồng thời DNA plasmid với vi bọt. DNA
tạo liên kết tĩnh điện với bề mặt vi bọt, nhờ đó DNA được phân phối tới đích cùng
với vi bọt. Việc sử dụng vi bọt làm chất mang còn giúp bảo vệ DNA khỏi sự phân
giải của nuclease qua đó tăng thời gian lưu thông của DNA trong máu.
Trong ứng dụng làm chất trung gian vận chuyển thuốc tới đích, các phân tử

thuốc nhỏ sẽ gắn vào ngay hoặc dưới lớp vỏ vi bọt hoặc thuốc được nạp vào trong
chất mang và sau đó liên kết với bề mặt vi bọt. Thuốc có thể được giải phóng bằng
cách siêu âm phá vỡ bọt [24]. Vận chuyển thuốc thông qua vi bọt thường ứng dụng
trong điều trị ung thư, khi vi bọt tiêm vào máu bệnh nhân và tiến tới vị trí khối u, sự
có mặt của vi bọt tại khối u có thể được theo dõi bằng hình ảnh siêu âm, và khi siêu
âm làm vỡ vi bọt, các thuốc chống ung thư được giải phóng tại vị trí khối u, qua đó
giảm ảnh hưởng của thuốc tới các bộ phận khác trong cơ thể, giúp giảm tác dụng phụ
không mong muốn của các thuốc đó.
13

Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã sử dụng một số nguyên liệu chính
được trình bày ở bảng sau:
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Khí Nitơ
Việt Nam
TCCS
2
Glycerol
monostearat
Công ty cổ phần sao Thái
Dương

USP
Cremophor A25
Công ty cổ phần sao Thái
Dương
TCCS
Poloxamer 188
Công ty cổ phần sao Thái
Dương
USP
Tween 80
Trung Quốc
TCCS
Cremophor RH40
Đức
EP
Nước cất
Việt Nam
TCCS
2.1.2. Thiết bị

14

Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT
Thiết bị
Ghi chú
1
Bể điều nhiệt
Hãng Buchi- Đức
2

Máy siêu âm Vibra cell
Sonics & Materials- Mỹ
3
Kính hiển vi gắn camera
Nikon Eclipse Ci-L
4
Cân kỹ thuật
Ohaus
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng tạo bọt từ một số chất diên hoạt thường dùng trong phòng
thí nghiệm.
- Khảo sát ảnh hưởng của các thông số máy siêu âm đến khả năng tạo vi bọt.
- Đánh giá một số đặc tính hoá lý và độ bền vi bọt.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt
Bước 1: Chuẩn bị các dịch tạo bọt:
Dịch 1 thành phần:
Pha các dịch có nồng độ 1% và 5% (kl/tt) của từng chất sau: cremophor A25,
poloxamer 188, tween 80, cremophor RH40.
Dịch 1%: Cân 0,2g chất hoà tan hoàn toàn với nước thành 20ml dung dịch
Dịch 5%: Cân 1,0g chất hoà tan hoàn toàn với nước thành 20ml dung dịch
Dịch nhiều thành phần:
15

Bảng 2.3. Công thức các dịch nhiều thành phần
CT
Pha
Hoá chất
CT
1

CT
2
CT
3
CT
4
Pha nước
Cremophor A25
0,2g
0,2g


Poloxamer 188
0,2g

0,2g
0,2g
Tween 80

0,2g

0,2g
Cremophor RH40


0,2g

Pha dầu
GMS
0,2g

0,2g
0,2g
0,2g

Với từng CT, tiến hành bào chế tương tự nhau:
- Chuẩn bị nguyên liệu như bảng 2.3
- Đun nóng 2 pha đến 65
o
C
- Siêu âm phân tán
 Đổ pha nước vào pha dầu
 Chọn thông số máy siêu âm:
Cường độ: I= 100W
Xung: Siêu âm liên tục
Thời gian: t= 5 phút
 Tiến hành siêu âm phân tán
Bước 2: Siêu âm tạo bọt
- Chỉnh máy siêu âm với các thông số cường độ, xung, thời gian thích hợp
16

- Đong 15ml dịch tạo bọt rồi đổ vào cốc có mỏ 50 ml
- Sục khí nitơ để bão hoà khí nitơ trong và ngoài dịch tạo bọt
 Cố định lưu lượng khí nitơ
 Sục sâu trong dịch tạo bọt 1 cm trong 1 phút
 Sau đó sục khí đuổi không khí bên ngoài bề mặt dịch tạo bọt
- Siêu âm bề mặt dịch tạo bọt để hình thành vi bọt mong muốn
- Chuyển phần dịch bọt vừa tạo vào ống nghiệm để thực hiện việc đánh giá
2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt
- Thời gian phân lớp:
Sau khi tạo bọt, bấm thời gian từ lúc đổ bọt vào ống nghiệm (lúc này cột bọt

phân 3 lớp) đến lúc cột bọt phân 2 lớp.
- Kích thước trung bình:
 Làm tiêu bản: Sau khi tạo bọt, tiến hành hút bọt bằng micro pipet ở thời điểm
10 phút tại vi trí cố định, làm tiêu bản.
 Soi dưới kính hiển vi gắn camera, chụp ảnh ở vật kính 40x, lưu ảnh.
 Xử lý hình ảnh bằng phần mềm ImageJ cho kết quả là số lượng bọt và diện
tích bọt tương ứng. Từ diện tích S của vi bọt, tính ra đường kính vi bọt theo
công thức: d= 2 x




Xử lý thống kê dữ liệu về đường kính vi bọt bằng Microsoft Office Excel từ
đó tính đường kính trung bình.
- Phân bố kích thước:
Xử lý thống kê dữ liệu về đường kính vi bọt bằng Microsoft Office Excel để
tính đường kính trung bình d và độ lệch chuẩn SD. Lấy phân bố kích thước
nằm trong khoảng d ± 2SD tức là 95,45% vi bọt có đường kính nằm trong
khoảng phân bố này.
2.3.3. Phương pháp đánh giá độ bền vi bọt
- Đánh giá độ ổn định vi bọt trong một tiêu bản
17

Sau khi tạo bọt, làm tiêu bản như mục 2.3.2, quan sát diễn biến quá trình thay
đổi kích thước của hệ bọt trên một vi trường bọt cố định.
Chụp lại ảnh ở vật kính 40x ở các thời điểm 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120
phút, 180 phút, 240 phút, xử lý hình ảnh, dùng phần mềm ImageJ đếm số bọt còn
trong giới hạn đường kích từ 1- 10μm.
- Đánh giá độ ổn định vi bọt trong ống nghiệm
Sau khi tạo bọt, làm tiêu bản như mục 2.3.2, quan sát dưới kính hiển vi gắn

camera và chụp ảnh.
Làm thêm 5 mẫu tương tự như trên nhưng hút bọt ở các thời điểm 30 phút, 60
phút, 120 phút, 180 phút, 240 phút, làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi gắn
camera, chụp ảnh.
Chụp ảnh ở vật kính 40x. Xử lý hình ảnh, dùng phần mềm ImageJ đếm số bọt
còn trong giới hạn đường kích từ 1- 10μm.