Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid và thời gian tạo hạt đến quá trình cổ định tế bào nấm men sacharomyces cerevissiae

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI







CAO HÀ PHƢƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG
ĐỘ CALCI CLORID VÀ THỜI GIAN
TẠO HẠT LÊN QUÁ TRÌNH
CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN
Saccharomyces cerevisiae

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



HÀ NỘI – 2014


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

CAO HÀ PHƢƠNG

KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG
ĐỘ CALCI CLORID VÀ THỜI GIAN
TẠO HẠT LÊN QUÁ TRÌNH
CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN
Saccharomyces cerevisiae


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp dược


HÀ NỘI – 2014



LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường
Đại học Dược Hà Nội và cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân, thầy giáo DS. Lê Ngọc
Khánh, những người thầy đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn, để tôi có thể hoàn thành đề tài
này.
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ
môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể thầy cô giáo trong trường đã
dạy dỗ, dìu dắt tôi trong suốt những năm học tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên


Cao Hà Phương


MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… …1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ………………………………………………….….2
1.1. Phƣơng pháp cố định (bất động) tế bào ………………………………… 2
1.1.1. Phương pháp cố định tế bào ………………………………………….….2
1.1.1.1. Phân loại…………………………………………………………….….2
1.1.1.2. Ưu nhược điểm ……………………………………………………… 3
1.1.1.3. Ứng dụng …………………………………………………………… 4
1.1.2. Alginat ………………………………………………………………… 5
1.1.2.1. Nguồn gốc…………………………………………………………… 6
1.1.2.2. Cấu tạo, tính chất…………………………………………………….…6
1.1.2.3. Ứng dụng…………………………………………………………….…9
1.2. Nấm men Saccaromyces cerevisiae……………………………………… 10
1.2.1. Phân loại khoa học ……………………………………………………….10
1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo ………………………………………………11
1.2.3. Đặc điểm sinh lý ………………………………………………………….11

1.2.4. Ứng dụng …………………………………………………………………13
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị …………………………………………………… 15
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất …………………………………………………….15
2.1.2. Vi sinh vật sử dụng ……………………………………………………….15
2.1.3. Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men …………………………………15
2.1.4. Dụng cụ, thiết bị ………………………………………………………….16
2.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………… 17
2.2.1. Khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt….………… 17
2.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong hạt.……….17


2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ………………………………………………….17
2.3.1. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng……….….…….17
2.3.2. Phương pháp cấy nhân giống từ môi trường thạch nghiêng…….…… 17
2.3.3. Phương pháp xác định sinh khối trong mẫu nuôi cấy ………….…… 18
2.3.4. Phương pháp đồng nhất alginat với sinh khối………………………….18
2.3.5. Phương pháp tạo hạt bất động tế bào……………………………….… 18
2.3.6. Phương pháp nuôi cấy hiếu khí hạt chứa sinh khối…………………….19
2.3.7. Phương pháp phá hạt……………………………………………………19
2.3.8. Phương pháp đo các kích thước của hạt…………………………….… 19
CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………….20
3.1. Khảo sát các thông số ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt ……….…….…20
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid đến kích thước hạt…… 20
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm trong calci clorid lên sự
hình thành hạt……………………………………………………………………22
3.1.3. Khảo sát lượng sinh khối tối đa cố định được……………………… ….27
3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào trong hạt………30
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch
calci clorid lên khả năng giữ tế bào nấm men của hạt cố định trong

nuôi cấy hiếu khí…………………………………………………………….… 30
3.2.2. Khảo sát mối liên quan giữa kích thước hạt và số lượng tế bào
cố định trong quá trình tạo hạt……………………………………………… 33
3.2.3. Khảo sát mối liên quan giữa kích thước hạt và số lượng tế bào
cố định trong quá trình nuôi cấy hiếu khí…………………………………… 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ………………………………………………… 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng
Trang
Bảng 2.1
Nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất
15
Bảng 3.1
Sự thay đổi đường kính hạt gel alginat theo kích thước đầu
kim và nồng độ dung dịch calci clorid.
20
Bảng 3.2
Sự thay đổi đường hạt và bề dày lớp vỏ hạt đã tạo thành theo
thời gian.
23
Bảng 3.3
Lượng sinh khối giữ được sau khi tạo hạt.
28
Bảng 3.4
Lượng sinh khối trong mỗi bình nuôi cấy hiếu khí sau 24h
chứa các hạt với thời gian ngâm trong calci clorid là 2 phút và

7 phút.
31
Bảng 3.5
Biến thiên lượng sinh khối trong 10g hạt theo các kích thước
hạt
33
Bảng 3.6
Lượng sinh khối trong mỗi bình nuôi cấy hiếu khí sau chứa các
hạt khác nhau về kích thước sau 24h.
35
Bảng 3.7
Lượng sinh khối ban đầu dùng để trộn và lượng sinh khối sau
khi nuôi cấy hạt ở mỗi bình trong điều kiện hiếu khí.
36



DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Tên hình ảnh, đồ thị
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc của natri alginat
7
Hình 1.2
ion Ca
2+
kết hợp với sợi alginat tạo thành mạng lưới
7
Hình 3.1

Hạt bị cắt sau các khoảng thời gian ngâm khác nhau (hạt to)
trong calci clorid 2%
23
Hình 3.2
Hình ảnh hạt được tạo thay đổi theo thời gian (hạt to) ngâm
trong calci clorid 2%
25
Hình 3.3
Hạt bị kéo đuôi
28
Hình 3.4
Sắp xếp của tế bào nấm men trong cấu trúc hạt alginat cố định
dưới kính hiển vi
29
Đồ thị 3.1
Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt
cố định theo thời gian của loại hạt nhỡ.
24
Đồ thị 3.2
Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt
cố định theo thời gian của loại hạt to.
24

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cố định tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù chỉ mới ra đời chưa lâu
nhưng nó thể hiện ưu điểm vượt trội so với các kĩ thuật truyền thống sử dụng tế bào
tự do và cả với các kĩ thuật bất động enzym đã được nghiên cứu sâu từ trước đó.
Sản xuất các chế phẩm sinh học bằng cố định tế bào đơn giản hơn, cho năng suất

tạo sản phẩm cao hơn và đặc biệt có thể sản xuất liên tục trong qui trình tự động
hóa. Ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất
động tế bào ở qui mô công nghiệp như: sản xuất siro fructose từ tinh bột, sản xuất
6APA là tiền chất để tổng hợp nhiều kháng sinh nhóm β – lactam, sản xuất ethanol
dùng trong nhiều ngành công nghiệp và năng lượng… Trong đó alginat là một chất
mang hay dùng nhất trong cố định tế bào. Nhằm mục đích nghiên cứu các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình cố định tế bào sử dụng alginat, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu trên tế bào vi sinh vật nấm men với khóa luận:
“Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ CaCl
2
và thời gian tạo hạt lên quá
trình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae”.
Với các mục tiêu:
1. Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt.
2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào trong hạt.
2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Phƣơng pháp cố định (bất động) tế bào:
1.1.1. Phƣơng pháp cố định tế bào:
Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy enzym invertase của nấm
men khi hấp phụ trên than hoạt vẫn giữ nguyên hoạt tính cho phản ứng thủy phân
đường mía. Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzym, sau đó đã có rất nhiều
nghiên cứu và báo cáo về bất động enzym trên thế giới.
Phương pháp cố định tế bào ngày nay bắt nguồn từ phương pháp cố định
enzym. Nguyên lý của phương pháp cố định enzym có thể được mô tả như sau:
Enzym ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói vào những polymer không hòa tan
trong nước. Các hạt enzym này được nhồi vào trong cột hình trụ có kích thước thích
hợp, sau đó cho dung dịch cơ chất chảy qua, enzym sẽ thực hiện phản ứng phân cắt
tạo các sản phẩm tương ứng.

1.1.1.1. Phân loại:
Có thế chia phương pháp cố định tế bào ra làm 4 loại: liên kết với chất mang,
liên kết ngang, bẫy và kết hợp các phương pháp trên.
o Phương pháp liên kết với chất mang:
Bản chất của phương pháp này là liên kết của các chất xúc tác sinh học (tế
bào, enzym…) với các chất mang không tan trong nước thông qua các liên kết đồng
hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh học đặc biệt. Đặc tính của vật
liệu làm chất mang: độ cứng cơ học, vật lý, hóa học, độ ổn định sinh học và không
độc. Thường dùng các polysaccharide không tan trong nước (cellulose, dextran, dẫn
xuất agarose…), các protein (gelatin, albumin…), các polymer nhân tạo
(polystyrene, nhựa trao đổi ion, polyerethan…), các vật liệu vô cơ (thủy tinh,
ceramic…). Phương pháp đồng hóa trị được sử dụng thường xuyên để bất động các
enzym, nhưng ít dùng cho bất động tế bào vì tác nhân cần có sự hình thành liên kết
đồng hóa trị thường là các chất độc với tế bào [15],[17],[24].
3

o Phương pháp tạo liên kết ngang:
Tác nhân tạo liên kết ngang như glutaraldehyd, các diisocyanat… trong đó
glutaraldehyd là tác nhân phổ biến nhất. Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo
thành liên kết ngang với tế bào. Các tác nhân nhóm diisocyanat (toluene
diisocyanat…) tạo liên kết ngang bằng cách liên kết nhóm urea với các nhóm
amoni. Enzym aspetase của E. coli và Bacillus coagulans được bất động bằng
phương pháp này [22].
o Phương pháp bẫy:
Dựa theo tính chất vật liệu để bẫy các tế bào chia làm 4 loại: dạng lưới, dạng
nang nhỏ (microcapsule), dạng liposome và dạng màng.
Ở dạng lưới bẫy, các chất xúc tác sinh học được bẫy trong các khuôn gel của
nhiều loại polymer khác nhau. Ở dạng microcapsule, các tế bào được gói trong các
màng polymer thẩm thấu nhân tạo thành các nang nhỏ. Ở dạng liposom, các tế bào
được bẫy trong các màng chất lỏng tạo thành từ hợp chất amphiphatic. Còn ở dạng

màng, chất xúc tác sinh học tách riêng khỏi môi trường bằng các màng siêu lọc,
màng lọc hoặc bằng các sợi rỗng [14].
Nguồn nguyên liệu tự nhiên để bất động tế bào thường sử dụng là các
polysaccharide như: alginat, k-carageenan, agar…, trong đó alginat được sử dụng
phổ biến nhất [15],[30]. Một số nghiên cứu gần đây về gel Calci-pectat cũng là một
sự lựa chọn mới cho bất động tế bào [30].
1.1.1.2. Ƣu nhƣợc điểm:
Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp bẫy với chất
mang là alginat có những ưu nhược điểm như sau:
■ Ưu nhược điểm của phương pháp:
- Ưu điểm: Đảm bảo cho các quá trình sản xuất liên tục. Có thể ngừng nhanh
quá trình phản ứng bằng cách tách hệ chất mang chứa tế bào ra khỏi cơ chất. Mật độ
tế bào trên mỗi đơn vị thể tích của hệ cao hơn nên có thể dùng các thiết bị phản ứng
nhỏ hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn, sự hấp thu cơ chất tăng và cải thiện năng
4

suất. Mật độ tế bào cao hơn còn giúp hạn chế sự sinh trưởng các vi sinh vật có hại
nên giảm khả năng nhiễm. Quá trình lọc, tách chiết, tinh chế sản phẩm dễ dàng hơn
do giảm lẫn vi sinh vật trong sản phẩm. Đơn giản hóa công nghệ, giảm chi phí. Chất
mang bảo vệ vi sinh vật chống lại thực khuẩn hoặc tế bào ngoại lai và tác nhân lý
hóa như nhiệt độ, pH, dung môi, thậm chí là kim loại nặng.
- Nhược điểm: Khi tế bào tăng quá nhiều sẽ làm giảm độ bền gel. Tế bào trên
bề mặt tăng lên nhiều lần và dễ thoát khỏi mạng gel rồi phát triển trong môi trường
như tế bào tự do.
■ Ưu nhược điểm của tế bào cố định:
- Ưu điểm: Hoạt tính của chất xúc tác sinh học trong tế bào bất động được giữ
ổn định và kéo dài. Khả năng chịu đựng nồng độ cơ chất cao, giảm sự ức chế từ sản
phẩm cuối.
- Nhược điểm: Có hiện tượng rò rỉ tế bào vào dịch sản phẩm ít nhiều ảnh
hưởng đến quá trình tinh chế. Chất xúc tác sinh học ngoài sự bao bọc bởi thành tế

bào, màng sinh chất thì lại có thêm chất mang làm cản trở sự thẩm thấu cơ chất và
sản phẩm giữa tế bào và môi trường. Những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ rất
khó tiếp xúc với tế bào nên hoạt lực có thể sẽ thấp hơn so với tế bào tự do. Tế bào
cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng đảm bảo khả năng
phát triển và hoạt động bình thường. Khi đó, trong hệ thống sử dụng tế bào cố định
có thể xảy ra hiện tượng phân hủy sản phẩm để cung cấp đầy đủ năng lượng và chất
dinh dưỡng đầy đủ cho tế bào, vì thế mà có thể hiệu suất sử dụng tế bào cố định lại
thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do.
1.1.1.3. Ứng dụng:
o Sản xuất kháng sinh:
Một số kháng sinh được nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp bất động tế
bào như: oxytetracyclin, neomycin, cephalosporin… Ampicillin và amoxicillin là 2
kháng sinh được tổng hợp từ 6-APA. 6-APA được sản xuất ở qui mô công nghiệp
bằng cách cho penicillin G chảy qua các tế bào E. coli hoặc Bacillus megatherium
5

(có hoạt tính enzym penicillinase cao) bất động trên các chất mang khác nhau, hiệu
suất đạt tối 99,5% [5],[30].
o Sản xuất các acid hữu cơ:
Một số acid hữu cơ được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào: acid
citric, acid lactic, acid acetic. Trong sản xuất acid citric, tế bào Aspergillus niger
được bất động bằng gel alginat, agarose, polyacrylamide hoặc hấp phụ trên cột
polyurethane. Bất động tế bào làm tăng đáng kể hiệu suất sản xuất acid citric [7].
o Sản xuất enzym:
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzym. Trong các enzym thì enzym
thủy phân tinh bột α-amylase và glucoamylase được nghiên cứu nhiều hơn cả. Tế
bào Bacillus cereus được bất động bằng Calci alginat, nhồi vào thiết bị phản ứng
tầng sôi để sản xuất liên lục α-amylase chịu nhiệt cho tốc độ phản ứng tăng gấp 24
lần so với lên men mẻ bằng tế bào tự do. Ngoài ra, ta có thể sản xuất α-amylase từ
các tế bào biến đổi của E.coli bất động trong -carrageenan có bổ sung thêm glycin.

Vài enzym quan trọng khác cũng được nghiên cứu bằng phương pháp bất động tế
bào như: invertase, lipase, protease…[13],[30].
o Sản xuất ancol:
Các vi sinh vật phổ biến để sản xuất ancol bằng phương pháp bất động tế bào
là Saccaromyces cerevisiae và Zimomonas mobilis. Nhiều chất được nghiên cứu,
phát triển, đưa vào ứng dụng rộng rãi như sorbitol, glycerol, propan – diol, 2,3 –
butandiol, ethanol, mannitol, xylitol. Trong đó sản xuất ethanol được nghiên cứu,
ứng dụng rộng rãi [8].
1.1.2. Alginat:
Hiện nay, trong các phương pháp cố định tế bào, phương pháp bẫy tế bào
trong chất nền polymer được quan tâm nhất, đặc biệt là sử dụng gel alginat. Hạt gel
alginat có dạng hình cầu, trong mỗi hạt, gel alginat tạo thành một mạng lưới bao
quanh tế bào, cố định các tế bào trong đó. Gel alginat có nhiều ưu điểm: dễ chuẩn
6

bị, không độc với tế bào, độ bền cơ học khá tốt, độ xốp thuận lợi cho sự khuếch tán
cơ chất và sản phẩm. Nhược điểm là có thể bị nứt vỡ dưới các tác động cơ học, hoặc
bị hòa tan dần khi có mặc các chất cạnh tranh với các ion Ca
2+
[27].
1.1.2.1. Nguồn gốc:
Alginat có nhiều nhất trong tảo nâu, rong mơ, là muối của acid alginic với
các ion kim loại chủ yếu là Ca
2+
, Mg
2+
, Na
+
, Ba
2+

. Acid alginic được Stanford phát
hiện đầu tiên năm 1881 trong tảo nâu, là acid hữu cơ có trọng lượng phân tử
32.000- 200.000.
1.1.2.2. Cấu tạo, tính chất:
o Cấu tạo:
Acid alginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng cấu tạo từ 2 gốc
uronic là acid α-L-guluronic (G) và acid β-D-mannuronic (M) nối với nhau bằng
liên kết 1-4-glucosid. Tuy nhiên, hai monomer này không liên kết một cách ngẫu
nhiên mà tạo thành 3 loại block: block homopolymeguluronic gồm các gốc acid
guluronic nối tiếp nhau GGGG, block homopolymeemannuronic gồm các gốc acid
mannuronic nối tiếp nhau MMMM, và block liên hợp MGMG. Tùy theo nguồn gốc
của alginat và độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block và trình tự
kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này làm cho tính chất của alginat
biến đổi trong một khoảng rộng [9].
7


Hình 1.1: Cấu trúc của natri alginat

Hình 1.2: ion Ca
2+
kết hợp với sợi alginat tạo thành mạng lưới [31]
8

o Tính chất:
 Độ hòa tan: các muối alginat kim loại hóa trị I (Na
+
, K
+
…), muối amoni và

các muối của các amin phân tử lượng thấp tan được trong nước. Còn các muối
alginat của các kim loại đa hóa trị (Ca
2+
, Ba
2+
) thì không tan được (trừ muối Mg
+
).
Các muối alginat hòa tan trong các dung môi than nước như alcol, aceton… và dễ
dàng hòa tan hơn khi đun nóng.
Natri alginat là một vật liệu hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu được bảo quản
trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp. Dung dịch natri alginat ổn định
nhất ở pH 4-10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại, hấp tiệt khuẩn có thể làm giảm
độ nhớt của dung dịch [20],[29]. Natri alginat tan chậm trong nước tạo dung dịch
keo nhớt; thực tế không tan trong ethanol (95%), ether, chloroform, và dung dịch
ethanol nước có chưa hơn 30% ethanol; không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
[16],[25]
 Độ nhớt: Natri alginat khi tan trong nước tạo thành các dung dịch có độ nhớt
dao động từ 10-3500 cps. Độ nhớt này tỉ lệ thuận vối khối lượng phân tử trung bình
của alginat, nồng độ alginat sử dụng và giảm đi khi tăng nhiệt độ. Khi duy trì nhiệt
độ ở 50
o
C trong nhiều giờ thì alginat sẽ bị cắt mạch và giảm độ nhớt. Nhưng khi hạ
nhiệt độ đến đông đặc rồi làm rã bằng thì độ nhớt của dung dịch không thay đổi
đáng kể. Độ nhớt của dung dịch alginat còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion
kim loại có trong dung dịch.
 Độ ổn định: alginat khô giống như các polysaccharide tự nhiên khác, rất
không bền với oxy, nhiệt độ và ion kim loại. Khi có mặt các tác nhân này alginat sẽ
bị rã ra. Độ ổn định của các muối alginat xếp theo thứ tự: natri alginat > amoni
alginat > acid alginic. Alginat có độ nhớt cao nhanh bị rã hơn alginat có độ nhớt

trung bình hoặc thấp. Ở nhiệt độ thường bột natri alginat khô chỉ bảo quản được vài
tháng nhưng nếu hạ nhiệt độ và bảo quản tối thì sẽ duy trì được lâu hơn. Còn nếu
đông sâu thì có thể bảo quản được vài năm mà không giảm đáng kể khối lượng
phân tử. Các dung dịch alginat ổn định ở pH 5,5-10 và chuyển thành dạng gel ở pH
9

< 5,5. Ngoài ra thêm một lượng nhất định ion Ca
2+
cũng làm tăng độ ổn định của
các dung dịch alginat.
 Sự gel hóa: dung dịch alginat natri có khả năng tạo gel khi phản ứng cới các
ion kim loại hóa trị II, III. Các gel này được hình thành ở mức nhiệt độ < 100
o
C,
chúng cũng không tan chảy khi đun nóng. Sự tạo gel này được giải thích bằng mô
hình cấu trúc của alginat – mô hình vỉ trứng: đoạn mạch của polymannuronic
(MMMM) là các dải hẹp, đoạn mạch của polyguluronic (GGGG) có dạng gấp nếp.
Khi có mặt các ion hóa trị II, III ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra, các phân
tử alginat sắp xếp lại song song với nhau, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạp
thành không gian trống giống như chỗ đặt quả trứng. Các ion Ca
2+
khớp vào các
khoảng trống này, liên kết với nhóm cacboxyl và các nguyên tử oxy ở mỗi đoạn
song song, khi đó gel alginat được hình thành. Khả năng tạo gel của các muối
alginat cũng phụ thuộc vào kích thước của các ion kim loại. Ion stronti có kích
thước lớn hơn ion calci nên liên kết mạnh mẽ hơn và được ưu tiên giữ lại hơn nếu
có sự cạnh tranh giữa Ca và Sr. Ái lực ion của các kim loại đối với alginat xếp theo
thứ tự Pb > Cu > Cd > Ba > Sr > Ca > Co.
Khi nghiên cứu gel Calci alginat người ta thấy modul đàn hồi phụ thuộc
mạnh mẽ vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronat. Alginat có block G

nhiều và dài sẽ cho gel bền hơn. Modul đàn hồi còn phụ thuộc vào loại liên kết
ngang và ái lực giữa các cation liên kết ngang. Ngoài ra, độ bền của gel còn phụ
thuộc vào yếu tố môi trường. Về ảnh hưởng cấu trúc phân tử tới độ bền gel: đoạn
M-block thể hiện tính đàn hồi, còn đoạn G thể hiện mức độ cứng rắn của gel. Các
đặc tính này được quan tâm nhiều trong ứng dụng của alginat [9].
1.1.2.3. Ứng dụng:
Alginat được sản xuất nhiều nhất ở Scotland, Nhật, Mỹ, Tây Ban Nha, Trung
Quốc… Ở Việt Nam, chúng ta có nguồn rong mơ khá phong phú thích hợp cho việc
sản xuất alginat thương phẩm đạt chất lượng, thực tế đã sản xuất ở Nha Trang –
Khánh Hòa [9]. Alginat có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như dệt
10

thực phẩm, giấy và dược phẩm. Natri alginat được sử dụng nhiều nhất và là thành
phần phụ gia để tạo hình, ổn định, tăng độ dày, tạo hình dáng, hương vị,…
Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã,
tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng ở viên giải phóng kéo
dài. Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược độn trong dạng viên nang, tá dược
tăng độ nhớt, ổn định thể chất trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại
chỗ; chất ổn định thể chất trong nhũ tương, hỗn dịch. Trong thời gian gần đây, natri
alginat được sử dụng để bào chế dạng vi nang và siêu vi tiểu phân chứa dược chất,
hay được sử dụng trong một số chế phẩm có tác dụng tại chỗ như thuốc nhỏ mắt,
nhỏ mũi [25]. Trong công nghệ vi sinh, alginat được sử dụng trong phương pháp bất
động tế bào, hiện nay còn được nghiên cứu sử dụng để tăng khả năng sống của
chúng trong những điều kiện bất lợi [19],[23],[24].
Trong ngành y tế, loại vải sợi được sản xuất từ natri và calci alginat được sử
dụng để bằng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn. Ngoài ra do
tính trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong nước, natri
alginat còn được sử dụng trong một số thuốc để ngăn cản trào ngược dạ dày – thực
quản, giảm triệu chứng ợ hơi… [25]
1.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae:

1.2.1. Phân loại khoa học:
Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn,
hiển vi. Nấm men có thể thuộc về 2 lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất
toàn (Deuteromecetes hoặc Fungi imperfect). Saccharomyces cerevisiae là loài nấm
men thuộc chi saccharomyces, họ sacchromyce-taceae, bộ saccharomyces-tales,
lớp nấm túi trần, ngành nấm, giới nấm. S. cerevisiae phân bố rộng rãi trong tự
nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, pH thấp như trong hoa quả, rau
dưa.


11

1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo:
Tế bào nấm men có nhiều hình dạng: hình cầu, hình oval hoặc elip, hình quả
chanh, hình trụ, hình chùy, có thể kéo dài thành dạng sợi. Nấm men có thể thay đổi
hình dạng và kích thước tùy thuộc vào điều kiện môi trường xung quanh. Để cho
hình dạng không thay đổi thì cần nuôi cấy giống còn trẻ trong môi trường tiêu
chuẩn. Về kích thước, so với tế bào các vi sinh vật khác thì tế bào nấm men khá lớn
khoảng 7×8-12µm. Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật với cấu
trúc tế bào có 3 phần chính: thành tế bào, tế bào chất và nhân. Thành tế bào có cấu
tạo bởi glucan và manan giúp chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh [5].
1.2.3. Đặc điểm sinh lý:
Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật tự dưỡng, kỵ khí tùy tiện, rất dễ phát triển
trong môi trường nuôi cấy nên không đòi hỏi những điều kiện khắt khe như nuôi
cấy vi khuẩn. Nguồn dinh dưỡng gồm có:
 Nguồn carbon: gồm các loại đường và dẫn chất, các rượu, acid hữu cơ, acid
amin,… Tất cả các loại nấm men đều sử dụng glucose. Saccharomyces không
sử dụng được pentose, các disaccharide (maltose và saccarose), cũng không sử
dụng trực tiếp tinh bột, cellulose và hemicellulose [10].
 Nguồn nitơ: bao gồm nitơ vô cơ và hữu cơ. Nguồn nitơ vô cơ thường là các

muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ. Đó là amoni sulfat, phosphate hay
muối acetat, lactat, malat và succinat. Nấm men chỉ sử dụng được acid amin ở
dạng tự nhiên (L- acid amin). Muốn tiêu hóa được các hợp chất (acid amin và
amit) nấm men cần có các vitamin như biotin, acid pantoteic, pyridoxin,
thiamin [8].
 Các nguyên tố vô cơ: Phospho, kali, magie, lưu huỳnh… Phospho đóng vai trò
rất quan trọng trong cấu tạo tế bào, xác định biến đổi hóa sinh, đặc biệt là trao
đổi chất và vận chuyển năng lượng. Lưu huỳnh là thành phần một số acid amin
trong phân tử protein, là nhóm phụ (-SH) của một số enzym CoA nên nếu thiếu
sẽ không tổng hợp được protein. Các ion Ca
2+
, K
+
, Mg
2+
cũng rất cần trong
nuôi cấy nấm men. Thông thường K
+
được bổ sung cùng các muối sulfat hoặc
12

phosphat, còn Mg
2+
và Ca
2+
thường đủ trong nước máy. Các nguyên tố vi
lượng Mn, Cu, Fe, Zn, Bo, Li,… chỉ cần một lượng rất nhỏ.
 Các chất sinh trưởng bao gồm vitamin, bazơ purin và pyrimidin. Trong công
nghiệp, nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nước chiết cám, dịch thủy
phân đậu tương và đặc biệt là rỉ đường. Nguồn cao ngô đáp ứng cả nhu cầu

vitamin và acid amin [10].
 Hô hấp: Nấm men là cơ thể sống kị khí tùy tiện, chúng có 2 kiểu hô hấp là hiếu
khí và kỵ khí tùy thuộc vào điều kiện oxy cung cấp trong quá trình nuôi cấy.
Trong điều kiện hô hấp kỵ khí, nấm men tạo ra ít năng lượng hơn nhiều so với
hiếu khí, vì vậy để đám bảo cung cấp năng lượng nấm men tiêu tốn nhiều cơ
chất hơn. Trong điều kiện hiếu khí nấm men tạo ra lượng sinh khối nhanh hơn,
nhiều hơn ở điều kiện kỵ khí. Trong khảo sát này sử dụng điều kiện hiếu khí để
nuôi cấy nấm men vì cần sử dụng sinh khối ở lượng lớn.
 Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp là 28-30
o
C nhưng nấm men có thể chịu được nhiệt
độ tới 40
o
C. Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến cường độ lên men mà còn ảnh
hưởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm. Nhiệt độ càng cao càng dễ sinh và tích
tụ các sản phẩm phụ và thứ cấp. Chọn nhiệt độ nuôi cấy là 30
o
C để ít sinh các
sản phẩm phụ có thể gây ảnh hưởng đến kết quả [10].
 pH: pH ban đầu thích hợp cho lên men là 5,5 và trong quá trình lên men thì
giảm xuống 4,4 – 4,5 rồi lại tăng lên do sự tạo thành CO
2
và các acid hữu cơ
[10].
Nấm men có 2 hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính phổ biến nhất của Saccharomyces cerevisiae là hình thức nảy chồi,
trên tế bào mẹ nảy ra một chồi con, lớn lên rồi tách khỏi tế bào mẹ thành tế bào mới
độc lập, nhưng đôi khi chồi con không tách ra mà vẫn gắn với tế bào mẹ vừa tiếp
tục nảy chồi. Còn sinh sản hữu tính là hình thức tiếp hợp, xảy ra khi 2 tế bào kết
hợp với nhau tạo thành hợp tử, hợp tử phân chia thành các tế bào trong nang, nang

chín phát tán các tế bào ra ngoài ; nếu 2 tế bào có hình dáng, kích thước giống nhau
tiếp hợp với nhau thì gọi là tiếp hợp đẳng giao, nếu 2 tế bào tiếp hợp có hình dáng,
13

kích thước khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao. Khi gặp những điều kiện không
thuận lợi, S. cerevisiae còn sinh sản bằng bào tử [4],[11].
1.2.4. Ứng dụng:
Nấm men và các sản phẩm của nó được sử sụng trong các ngành công
nghiệp, đặc biệt phổ biến trong công nghệ thực phẩm và y học. S. cerevisiae được
sử dụng phổ biến nhất vì nó có độ an toàn sinh học cao. Tế bào S. cerevisiae có hàm
lượng protein, vitamin cao, có giá trị dinh dưỡng đặc biệt nên thường được bổ sung
trực tiếp vào thức ăn cho động vật.
A. Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm, đồ uống:
Nấm men được sử dụng nhiều để sản xuất thực phẩm, đồ uống như: rượu,
bia, nước giải khát, ethanol, bánh mì,… Sinh khối nấm men được sủ dụng phổ biến
ở nhiều nước châu Âu dưới dạng men ép dùng làm men bánh mỳ, bột nở trong sản
xuất bánh. Men ép còn được sử dùng để sản xuất cao nấm men, bột nấm men để pha
môi trường cho các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm.
S. cerevisiae được dùng để sản xuất protein đơn bào với giá thành thấp làm
thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm thay thế các nguồn protein đắt tiền như: bột cá,
bột đậu tương… để cung cấp thực phẩm dinh dưỡng cao cho con người một cách
gián tiếp. Sản xuất các acid amin, vitamin, protein, đặc biệt là nấm men sản xuất
protein làm thực phẩm cho con người trong chiến tranh thế giới thứ 2 và nạn đói ở
các nước Ấn Độ, Angiery. Bã rượu chứa S. cerevisiae từ rất lâu đã được sử dụng
làm thức ăn trong chăn nuôi.
B. Trong ngành dược:
Sinh khối nấm men được sử dụng trong ngành dược để chế tạo ra dược phẩm
quí giá nhằm điều trị một số bệnh như chế phẩm đông khô Bioflor, Ultra Levure để
điều trị một số bệnh như ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa ở trẻ em. Nuôi cấy S. cerevisiae
trong điều kiện đặc biệt có thể sản xuất các hợp chất có chứa Selen hữu cơ trong y

học để chữa trị hàng loạt các bệnh kể cả ung thư [21]. Sinh khối nấm men có hàm
lượng cao vitamin nhóm B, β-caroten, acid ribonucleic, các aminosid như lysine,
14

cysteine… được dùng làm thuốc bổ [5]. Nhờ những thành tựu trong di truyền, các
nhà khoa học đã tạo ra những chủng nấm men siêu tổng hợp có thể sinh enzym
ngoại bào vượt xa nhu cầu sử dùng trong trao đổi chất của chúng, lượng enzym thừa
được thu nhận để làm thuốc như amylase, glucoamylase, lipase… dùng làm thuốc
hỗ trợ tiêu hóa.
Trong công nghệ sinh học tế bào, S. cerevisiae được sử dụng như một vector
để tách dòng nhận các gen chuyên biệt sản xuất như các chế phẩm sinh học có hoạt
tính cao để điều trị các bệnh hiểm nghèo như: insulin, interferon, albumin huyết
tương người, cytocrom P450…[1]. Công trình nghiên cứu phá vỡ tế bào S.
cerevisiae để thu nhận enzym superoxide dismustase- một enzym oxy hóa khử có
tác dụng dọn các gốc tự do, chống stress và chống lão hóa đang được thực hiện.
Men bia dùng để trị tiêu chảy, mụn trứng cá kinh niên, giúp ăn ngon miệng và
là nguồn cung cấp vitamin B. Men bia có tác dụng chống lại C. dificile và E. Coli
độc hại nơi ruột do làm giảm lưu lượng nước và chất điện giải nơi ruột kích ứng bởi
độc tố của E.Coli. Men bia có thể giúp tăng hoạt tính của một số enzym trong ruột
như disaccharidase, saccharidase, maltase, lactase giúp điều trị chứng tiêu chảy.
Men bia có chứa nhiều chromium giúp tăng hoạt động của isulin, tốt cho bệnh nhân
tiểu đường.

15

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị:
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất:
Bảng 2.1: Nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất
Hóa chất

Nguồn gốc
Hóa chất
Nguồn gốc
Glucose
Việt Nam
Natri alginat
Ấn Độ
Cao nấm men
Merk – Đức
Natri citrat
Trung Quốc
(NH
4
)
2
SO
4
Trung Quốc
CaCl
2
Trung Quốc
KH
2
PO
4
Trung Quốc
NaCl
Trung Quốc
MgSO
4

.7H
2
O
Trung Quốc
Thạch bột

Việt Nam

2.1.2. Vi sinh vật sử dụng:
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (giữ giống tại phòng Vi Sinh – Bộ môn
Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội).
2.1.3. Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy nấm men:
 Công thức môi trường lỏng:
- Glucose 8,0g
- Cao nấm men 0,5g
- (NH
4
)
2
SO
4
0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O 0,1g
- KH
2
PO

4
0,2g
- Nước máy vừa đủ 100ml
- pH 6,5-7
 Công thức môi trường thạch:
- Glucose 5,0g
- Cao nấm men 0,5g
16

- (NH
4
)
2
SO
4
0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O 0,1g
- KH
2
PO
4
0,2g
- Thạch bột 2,3g
- Nước máy vừa đủ 100ml
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ:
i. Dụng cụ:

- Ống nghiệm
- Bình nón 100 ml, 250ml, 500ml
- Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml
- Que cấy, đèn cồn
- Cốc có mỏ 100 ml, 200ml, 500ml
- Pipet 5ml (đường kính đầu nhỏ giọt là 1,3mm)
- Kim tiêm với các đầu kim 16G và 26G (đầu kim vát)
- Thìa, vợt hạt…

ii. Thiết bị:
 Nồi hấp tiệt khuẩn (ALP – Nhật)
 Tủ cấy vô trùng (UV Bioair – Italia)
 Tủ ấm (Memmert – Đức)
 Lò vi sóng (Daewoo – Hàn Quốc)
 Máy lắc (Bioshaker – Đức)
 Máy ly tâm (Rotofix – Đức)
 Cân kỹ thuật (Satorius – Đức)
 Máy khuấy từ (Wisd – Hàn Quốc)
 Máy đo đường kính vòng vô khuẩn (Haloes Caliper – Tây Ban Nha)
 Tủ lạnh (Toshiba – Nhật)

17

2.2. Nội dung nghiên cứu:
2.2.1. Khảo sát một số thông số ảnh hƣởng đến quá trình tạo hạt:
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ calci clorid đến kích thước hạt.
 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm trong calci clorid lên sự hình
thành hạt.
 Khảo sát lượng sinh khối tối đa cố định được bằng gel alginat.
2.2.2. Khảo sát lƣợng một số yếu tố ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào trong hạt

cố định:
 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt trong dung dịch calci clorid đến
khả năng giữ tế bào nấm men của hạt cố định trong nuôi cấy hiếu khí.
 Khảo sát mối liên quan giữa kích thước hạt đến số lượng tế bào cố định được
trong quá trình tạo hạt.
 Khảo sát mối liên quan giữa kích thước hạt đến số lượng tế bào cố định được
trong quá trình nuôi cấy hiếu khí.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3.1. Phƣơng pháp giữ giống trên thạch nghiêng:
Cân, đong các thành phần môi trường thạch như ở mục 2.1.3, đun trong lò vi
sóng cho thạch tan hết. Chia vào mỗi ống nghiệm 10ml môi trường, nút kín và hấp
tiệt khuẩn ở 115
o
C/20 phút trong nồi hấp. Sau đó đặt nghiêng các ống nghiệm sao
cho chiều cao trong môi trường đến khoảng 2/3 ống, để nguội cho thạch đông lại
thu được ống môi trường thạch nghiêng. Dùng que cấy vô khuẩn lấy một vòng vi
sinh vật từ ống giống khác rồi lướt que cấy trên bề mặt thạch theo hình zizac của
ống giống mới (thực hiện trong tủ cấy vô trùng). Đặt ống giống mới trong tủ ấm ở
30
o
C. Sau 24h, các ống giống đạt yêu cầu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 – 5
o
C.
2.3.2. Phƣơng pháp cấy nhân giống từ môi trƣờng thạch nghiêng:
Cân, đong các thành phần môi trường theo công thức môi trường lỏng ở mục
2.1.3. Chia vào mỗi bình nón 250ml lượng 150ml môi trường, đậy kín bằng nút
bông (bông không thấm), hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 115
o
C/20 phút trong nồi hấp
18

sau đó để nguội. Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy từ giống gốc cho vào
bình nhân giống (thực hiện trong tủ cấy vô trùng). Đặt bình vào máy lắc, nuôi trong
điều kiện hiếu khí ở tủ lắc 100 vòng/phút, 30
o
C/24h.
2.3.3. Phƣơng pháp xác định lƣợng sinh khối trong mẫu nuôi cấy:
Đổ dịch nuôi cấy hoặc dịch phá hạt vào các ống ly tâm, đậy nắp. Đặt các ống
ly tâm vào máy ly tâm cho cân bằng, ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian
15 phút. Gạn bỏ lớp dịch, cân lượng sinh khối trong ống ly tâm.
Với dịch nuôi cấy môi trường cần ly tâm thu sinh khối trước khi tạo hạt thì
ống ly tâm phải được lau cồn, để khô. Bình nuôi cấy được lắc đều trước khi đổ vào
ống ly tâm và thao tác đổ dịch từ bình vào ống ly tâm thực hiện trong tủ cấy vô
trùng.
2.3.4. Phƣơng pháp đồng nhất alginat với sinh khối:
Cân lượng thích hợp sinh khối nấm men sau khi ly tâm dịch tế bào vào trong
cốc có mỏ sạch. Thêm natri alginat 2% với lượng tùy theo từng thí nghiệm vào cốc
chứa nấm men. Cho cốc có mỏ đó lên máy khuấy từ, bật khuấy từ ở điều kiện nhiệt
độ thường, để trong khoảng 15 phút cho tới khi hỗn dịch trong cốc đồng nhất, tức là
không phân biệt các mảnh sinh khối trong dịch.
Các thao tác trên thực hiện trong tủ cấy vô trùng với natri alginat 2% đã được
hấp tiệt khuẩn ở 115
o
C/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn.
2.3.5. Phƣơng pháp tạo hạt bất động tế bào:
Dùng pipet hoặc kim tiêm (đầu kim số 16G hoặc 26G) lấy 5ml dung dịch
natri alginat 2% hoặc hỗn hợp natri alginat đã đồng nhất với sinh khối, nhỏ từ từ
dịch vào trong cốc có mỏ chứa 30ml – 40ml dung dịch calci clorid (2%, 4%, 6% tùy
từng thí nghiệm), ngâm hạt trong thời gian thích hợp.
Với hạt tạo bởi dịch alginat – sinh khối thì các thao tác trên được tiến hành

trong tủ cấy vô trùng, dung dịch calci clorid được hấp tiệt khuẩn ở 115
o
C/20 phút
trong nồi hấp tiệt khuẩn.