Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc chiết xuất từ vang nho, trần bì và chè xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






NGUYỄN KHẮC TÙNG

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU
CHUẨN CAO ĐẶC CHIẾT XUẤT TỪ
VANG NHO, TRẦN BÌ VÀ CHÈ
XANH



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC






HÀ NỘI 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN KHẮC TÙNG


BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU
CHUẨN CAO ĐẶC CHIẾT XUẤT TỪ
VANG NHO, TRẦN BÌ VÀ CHÈ
XANH


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410


Người hướng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Đức Toàn
PGS.TS. Nguyễn Tường Vy


HÀ NỘI, NĂM 2014


Lời cảm ơn
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn
TS. Nguyễn Đức Toàn- Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế và PGS.TS Nguyễn
Tường Vy, Trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá

trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô Ban Giám
hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Hoá phân tích và các bộ môn
khác của Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này.
Luận văn này được thực hiện tại Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiểm
nghiệm- Bộ Y tế, dưới sự quan tâm hướng dẫn và giúp đỡ tận tình, vô tư
của các anh chị và các bạn trong Khoa. Tôi xin chân thành cảm ơn tới
toàn thể cán bộ Khoa Vật lý đo lường.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ương, TS. Trần Việt Hùng và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi
trong thời gian thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn
bè đã luôn động viên, chia sẻ cùng tôi trong cuộc sống và sự nghiệp.

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014.


DS. Nguy
ễ
n Kh
ắ
c Tùng

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2

1.1. Tiêu chuẩn chất lượng thuốc 2

1.1.1. Khái niệm 2

1.1.2. Các cấp tiêu chuẩn chất lượng của thuốc 2

1.1.3. Nguyên tắc, căn cứ xây dựng tiêu chuẩn 3

1.1.4. Nội dung chính một tiêu chuẩn chất lượng về thuốc 3

1.1.4.1. Yêu cầu kỹ thuật 3

1.1.4.2. Phương pháp thử 4
1.1.4.3. Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản, hạn dùng 4

1.1.5. Thẩm định phương pháp phân tích 4

1.1.5.1. Tính đặc hiệu (specificity, selectivity) 5

1.1.5.2. Tính tuyến tính (linearity) 6

1.1.5.3. Khoảng xác định 6

1.1.5.4. Độ đúng (accuracy) 7

1.1.5.5. Độ chính xác (precision) 7

1.1.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD) 8

1.1.5.7. Giới hạn định lượng (LOQ) 9

1.2. Cao thuốc và tiêu chuẩn chất lượng cao đặc 10

1.2.1. Định nghĩa 10

1.2.2. Yêu cầu chất lượng cao đặc 10

1.3. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu của đề tài 11

1.3.1. Nho và chiết xuất vang nho 11

1.3.2. Trần bì và chiết xuất trần bì 13

1.3.3. Chè xanh và chiết xuất chè xanh 19



1.4. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 22

1.4.1. Phương pháp xử lý mẫu 22

1.4.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 23

1.4.2.1. Khái niệm 23

1.4.2.2. Pha tĩnh 23

1.4.2.3. Pha động 23

1.4.2.4. Detector dùng trong HPLC 24

1.4.2.5. Các thông số đặc trưng của HPLC 25
1.4.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất trong cao 28

1.4.3.1. Phương pháp phân tích resveratrol 28

1.4.3.2. Phương pháp phân tích hesperidin 29

1.4.3.3. Phương pháp phân tích epigallocatechin gallat 31

1.4.3.4. Phương pháp phân tích đồng thời resveratrol, hesperidin,
epigallocatechin gallat 32

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1. Đối tượng nghiên cứu 34

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 34

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ 34

2.2.2. Hóa chất, thuốc thử 35

2.3. Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1. Xác định một số chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết
xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 35

2.3.2. Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời
resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat bằng HPLC 37

2.3.2.1. Xây dựng phương pháp 37

2.3.2.2. Thẩm định phương pháp
38

2.3.2.4. Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và
epigallocatechin
gallat
trong
cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè
xanh 39

2.4. Tính toán kết quả và xử lý số liệu 40



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1. Xác định các chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết
xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 42

3.1.1. Tính chất cảm quan 42

3.1.2. Tro toàn phần 42

3.1.3. Xác định giới hạn kim loại nặng trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất
vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 43

3.2. Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat
trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh
bằng HPLC 44

3.2.1. Xây dựng phương pháp 44

3.2.1.1. Chuẩn bị mẫu 44

3.2.1.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện 45

3.2.1.3. Lựa chọn cột sắc ký 47

3.2.1.4. Lựa chọn pha động 47

3.2.2. Thẩm định phương pháp 49

3.2.2.1. Khảo sát tính tương thích của hệ thống 49

3.2.2.2. Khảo sát tính đặc hiệu 50
3.2.2.3. Tính tuyến tính 51

3.2.2.4. Độ lặp lại 54

3.2.2.5. Độ đúng 55

3.2.2.6. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
của phương pháp 56

3.2.3. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính, định lượng resveratrol,
hesperidin, epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang
nho, cao trần bì, cao chè xanh 57

3.2.3.1. Định tính 57

3.2.3.2. Định lượng 60

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 61

4.1. Về đối tượng nghiên cứu 61



4.2. Về phương pháp nghiên cứu 62

4.3. Về kết quả nghiên cứu 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

* KẾT LUẬN 65

* KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN
CĐ
Acetonitril
Cao đặc
DĐTQ Dược điển Trung Quốc
DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV
DMF Dimethylformamide
DMSO

Dimethyl sulfoxide
ĐL Định lượng
ĐT Định tính
EGCG Epigallocatechingallat
HDL High densitylipoprotein
HES Hesperidin
HPLC Sắc k
ý
lỏng hiệu năng cao
ICH International Conference on Harmonisation
KL Khối lượng
LDL Low densitylipoprotein
LOD

Limit of detection
LOQ

Limit of quantitation
MeOH Methanol
PDAD

Detector dãy diod quang

RES Resveratrol
RSD

Relative Standard Deviation
SKS số kiểm soát
TLTK
TFA
Tài liệu tham khảo
Acid trifloroacetic
UV-Vis Ultraviolet- visible
VKNTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương



DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các yếu tố cần được đánh giá đối với một phương pháp phân tích 5
Bảng 1.2.
Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC
24
Bảng 3.1. Tính chất cảm quan của cao đặc 42
Bảng 3.2.
Xác định độ tro toàn phần của cao đặc
43

Bảng 3.5.
Kết quả xác định khoảng tuyến tính
52
Bảng 3.6.
Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
54
Bảng 3.7.
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
55
Bảng 3.8.
Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với
epigallocatechin gallat 56
Bảng 3.9. Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với hesperidin 56
Bảng 3.10.
Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với resveratrol
57
Bảng 3.11.
Kết quả định lượng resveratrol, hesperidin,
epigallocatechin gallat

trong các mẫu cao nghiên cứu.
60



DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Nho (Vitis sp). 11
Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của resveratrol. 12
Hình 1.3. Quả quýt và dược liệu trần bì. 13
Hình 1.4.Cấu trúc cơ bản các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus. 15

Hình 1.5. Cấu trúc hoá học của hesperidin. 15
Hình 1.6. Sơ đồ chiết xuất citroflavonoid 18
Hình 1.7. Chè xanh (Camellia sinensis) 19
Hình 1.8. Cấu trúc các polyphenol chính trong chè xanh [37]. 20
Hình 1.9. Sắc ký đồ và các thông số đặc trưng. 26
Hình 2.1. Máy HPLC – UV 34
Hình 3.1. Phổ tử ngoại của epigallocatechin gallat trong methanol 46
Hình 3.2. Phổ tử ngoại của hesperidin trong methanol 46
Hình 3.3. Phổ tử ngoại của resveratrol trong methanol 46
Hình 3.4. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp với tỷ lệ pha động (20: 80). 48
Hình 3.5. Sắc đồ chuẩn hỗn hợp với tỷ lệ pha động (30: 70). 48
Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu. 51
(A): mẫu trắng; (B): chuẩn hỗn hợp; (C): mẫu thử cao đặc hỗn hợp. 51
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của
epigallocatechin gallat 52
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của
hesperidin 53
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của
resveratrol 54
Hình 3.10. Sắc đồ định tính mẫu thử 58
Hình 3.11. Phổ UV-Vis của resveratrol. (A) chuẩn, (B) thử. 59
Hình 3.12. Phổ UV-Vis của hesperidin. (A) chuẩn, (B) thử. 59
Hình 3.13. Phổ UV-Vis của epigallocatechin gallat. (A) chuẩn, (B) thử. 60

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xơ vữa động mạch là bệnh liên quan đến sinh mệnh nhiều người, trong hầu
hết mọi gia đình. Các số liệu thống kê cho thấysố lượng người mắc chứng bệnh
nàylà rất lớn và không ngừng gia tăng. Xơ vữa động mạch là hiện tượng xơ hoá

thành động mạch, đây là nguyên nhân gây ra nhiều biến chứng tim mạch nguy hiểm
như nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não.Cho đến nay, việc điều trị vẫn
không đạt kết quả tốt, hơn nữa việc sử dụng thuốc lại gây ra nhiềutác dụng phụ [1].
Trước thực tế đó, các nhà khoa học trong nước đã tích cực nghiên cứu các loại thảo
dược với mong muốn tạo ra các sản phẩm đông dược có thể điều trị bệnh hiệu quả
mà không gây ra các tác dụng bất lợi. Các dược liệu nho, trần bì, chè xanh đã được
các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới nghiên cứu rất nhiều về tác
dụng dược lý,các nghiên cứu này đã chứng minh được tác dụng chống oxy hoá và
ngăn ngừa xơ vữa động mạch của nho, trần bì, chè xanh là rất tốt. Để tạo ra tác
dụng hiệp đồng của các dược liệu trên, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương - Bộ
Y tế đề xuất đề tài nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng chống oxy hoá, ngăn
ngừa xơ vữa động mạch của viên nang bào chế từ chiết xuất của các dược liệu trên.
Vấn đề đặt ra là muốn cho sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt, ổn định và có thể
vươn ra thế giới trong điều kiện kinh tế hội nhập thì sản phẩm phải có quy định về
các đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý dùng làm chuẩn đánh giá sản phẩm. Chính
vì vậy, yêu cầu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm là rất quan trọng.
Chúng tôi thực hiện đề tài "Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc chiết
xuất từ vang nho, trần bì và chè xanh" để góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất
lượng cho sản phẩm trong đề tài trên của Viện Kiểm nghiệmthuốc Trung ương.
Đề tài thực hiện với hai mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất
trong cao.
2. Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tiêu chuẩn chất lượng thuốc
1.1.1. Khái niệm
Tiêu chuẩn là những quy định thống nhất và hợp lý được trình bày dưới dạng
một văn bản hoặc một thể thức nhất định do một cơ quan có thẩm quyền ban hành

để bắt buộc áp dụng cho những nơi có liên quan. Nói một cách khác tiêu chuẩn là
một văn bản mang tính pháp chế trong đó đề ra những quy định thống nhất và hợp
lý bắt buộc áp dụng nhằm đảm bảo chất lượng cho một sản phẩm nào đó.
Đối với thuốc, tiêu chuẩn chất lượng là một văn bản khoa học kỹ thuật mang
tính pháp lý trong đó quy định về chỉ tiêu, yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm
nghiệm, bao gói, ghi nhãn, vận chuyển, bảo quản và các yêu cầu khác có liên quan
đến chất lượng thuốc. Đây là cơ sở để các các cơ quan kiểm nghiệm (hoặc người
kiểm nghiệm) tiến hành thực nghiệm, đánh giá kết quả, công bố kết quả (bằng phiếu
kiểm nghiệm) đánh giá chất lượng thuốc là đạt hay không đạt và có được phép lưu
hành (hoặc sử dụng) hay không [4], [7].
1.1.2. Các cấp tiêu chuẩn chất lượng của thuốc
Tiêu chuẩn chất lượng thuốc của Việt Nam bao gồm tiêu chuẩn quốc gia và
tiêu chuẩn cơ sở.
- Tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) về chất lượng thuốc và các phương pháp kiểm
nghiệm thuốc được quy định tại Dược điển Việt Nam.
- Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) do cơ sở sản xuất thuốc xây dựng và công bố.
TCCS không được thấp hơn TCVN về chất lượng thuốc.
Tiêu chuẩn chất lượng của thuốc đã được Bộ Y tế cho phép lưu hành là tài liệu
pháp lý, là căn cứ để cơ quan quản lý, cơ quan kiểm tra chất lượng thuốc xác định
và kết luận về chất lượng thuốc trong quá trình sản xuất, lưu hành và sử dụng. Các
cơ sở đăng ký, sản xuất, kinh doanh thuốc có trách nhiệm đảm bảo chất lượng thuốc
cho đúng tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký trong quá trình sản xuất, bảo quản, phân
phối thuốc đến người sử dụng.
3

Trong quá trình quản lý sản xuất, lưu hành thuốc, cơ sở kinh doanh có thể áp
dụng tiêu chuẩn chất lượng nội bộ, bao gồm tiêu chuẩn chất lượng thuốc đã được
Bộ Y tế xem xét và các chỉ tiêu chất lượng bổ sung khác [5].
1.1.3. Nguyên tắc, căn cứ xây dựng tiêu chuẩn
- Dựa trên tiến bộ khoa học và công nghệ, kinh nghiệm thực tiễn, yêu cầu về

quản lý chất lượng và đảm bảo chất lượng thuốc và xu hướng phát triển kinh tế- xã
hội.
- Sử dụng tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài làm
cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật, trừ trường hợp các tiêu chuẩn
đó không phù hợp với đặc điểm về địa lý, khí hậu, kỹ thuật, công nghệ của Việt
Nam.
- Bảo đảm tính thống nhất của hệ thống tiêu chuẩn và hệ thống quy chuẩn kỹ
thuật của Việt Nam [11].
- Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn
+ Tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài,
+ Kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật,
+ Kinh nghiệm thực tiễn,
+ Kết quả đánh giá, khảo nghiệm, thử nghiệm, kiểm tra, giám định [11].
1.1.4. Nội dung chính một tiêu chuẩn chất lượng về thuốc
Tiêu chuẩn chất lượng thuốc gồm 3 phần chính: yêu cầu kỹ thuật; phương
pháp thử; đóng gói, ghi nhãn- bảo quản- hạn dùng [7].
1.1.4.1. Yêu cầu kỹ thuật
Yêu cầu kỹ thuật là các quy định cụ thể về công thức bào chế, tiêu chuẩn chất
lượng của các nguyên phụ liệu và yêu cầu chất lượng của thuốc. Yêu cầu chất lượng
quy định cụ thể các chỉ tiêu chất lượng và giới hạn / yêu cầu đối với từng chỉ tiêu.
Mỗi dạng bào chế có các chỉ tiêu chất lượng được quy định chung trong các dược
điển, giới hạn / yêu cầu đối với mỗi chỉ tiêu tuỳ thuộc vào từng sản phẩm cụ thể tuy
nhiên phải đáp ứng quy định chung.

4

1.1.4.2. Phương pháp thử
Phương pháp thử là phần không thể thiếu của tiêu chuẩn chất lượng quy định
cụ thể các điều kiện tiến hành (các hoá chất, thuốc thử, trang thiết bị, dụng cụ),
phương pháp chuẩn bị mẫu, cách thức tiến hành, xử lý và đánh giá kết quả. Mỗi chỉ

tiêu phải ghi rõ phương pháp thử riêng, nếu sử dụng các phương pháp thử chung
phải ghi rõ cụ thể tên dược điển, ấn bản và chuyên luận áp dụng.
1.1.4.3. Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản, hạn dùng
Nội dung này quy định các dạng đóng gói của thuốc (ví dụ vỉ mấy viên, hộp
mấy vỉ, chai bao nhiêu ml ) cách thức ghi nhãn thuốc, điều kiện bảo quản và hạn
dùng của thuốc.
1.1.5. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích là yêu cầu trong quá trình xây dựng tiêu
chuẩn chất lượng nhằm đánh giá mức độ phù hợp của phương pháp phân tích đối
với sản phẩm thuốc có đảm bảo đưa ra kết quả đúng và chính xác hay không. Tuỳ
thuộc các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử, việc thẩm định phương pháp có
các chỉ tiêu và yêu cầu khác nhau.
Các yếu tố cần được thẩm định đối với một phương pháp phân tích được minh
hoạ ở bảng 1.1:

5

Bảng 1.1: Các yếu tố cần được đánh giá đối với một phương pháp phân tích
Loại quy trình phân tích Định tính
Xác định tạp chất
Phân tích
định lượng
- Hàm lượng
- Độ hòa tan
Định
lượng
Giới hạn
tạp chất
Tính đặc hiệu + + + +
Tính tuyến tính - + - +

Độ lặp lại - + - +
Độ chính xác trung gian - - + +
Độ đúng - + - +
Giới hạn phát hiện - + + -
Giới hạn định lượng - + - -
Dấu (-) nhằm chỉ các đặc trưng này không cần phải đánh giá.
Dấu (+) nhằm chỉ các đặc trưng này cần phải đánh giá.
1.1.5.1. Tính đặc hiệu (specificity, selectivity)
- Khái niệm:
Tính đặc hiệu là khả năng xác định chắc chắn một chất phân tích khi có mặt
các thành phần khác trong mẫu thử. Phép thử được gọi là đặc hiệu khi đảm bảo
đồng thời 2 điều kiện: (1) khẳng định chắc chắn sự có mặt của chất phân tích và (2)
phân biệt được chất phân tích với hợp chất khác có mặt trong mẫu thử.
- Nguyên tắc xác định: chuẩn bị các mẫu sau:
+ Mẫu đối chiếu: mẫu có chứa chất cần phân tích;
+ Mẫu thử: chuẩn bị mẫu theo phương pháp thử quy định;
+ Mẫu placebo: thành phần giống mẫu thử nhưng không có chất cần phân tích,
chuẩn bị mẫu đúng như chuẩn bị mẫu thử;
+ Mẫu trắng: chuẩn bị như chuẩn bị mẫu thử, nhưng không sử dụng mẫu.
+ Tiến hành phân tích các mẫu theo điều kiện phân tích quy định.
- Yêu cầu:
+ Đáp ứng của chất phân tích trong mẫu thử phải giống với trong mẫu đối
chiếu (ví dụ với sắc ký lớp mỏng phải có vết cùng màu và cùng R
f
, với sắc ký lỏng
phải có píc có cùng thời gian lưu và cùng phổ đồ).
6

+ Mẫu placebo, mẫu trắng phải không có đáp ứng ảnh hưởng đến đáp ứng của
chất phân tích.

1.1.5.2. Tính tuyến tính (linearity)
- Khái niệm:
+ Tính tuyến tính đề cập đến mối liên quan toán học giữa 2 đại lượng tỷ lệ với
nhau được biểu diễn dưới dạng đồ thị là một đường thẳng. Tính tuyến tính của một
phương pháp định lượng đánh giá mối liên quan giữa nồng độ chất phân tích và đáp
ứng của nó.
+ Đáp ứng của chất phân tích có thể là thể tích/ số mol chất phản ứng trong
phương pháp chuẩn độ, độ hấp thụ trong phương pháp đo phổ UV-Vis, diện tích/
chiều cao của píc trong phương pháp sắc ký )
- Nguyên tắc xác định:
+ Tiến hành pha và phân tích một dãy dung dịch chuẩn gồm ít nhất ba mức
nồng độ xung quanh nồng độ định lượng của chất cần phân tích theo phương pháp
thử.
+ Tính tuyến tính được đánh giá bằng hệ số tương quan tuyến tính r
 =
∑
(


−

)
(

−

)

∑
(



−

)

∑
(

−

)

Trong đó: x
i
là giá trị về nồng độ (khối lượng) chất phân tích, y
i
làđáp ứng
tương ứng.
+ Yêu cầu: hệ số tương quan r ≥ 0,998.
1.1.5.3. Khoảng xác định
- Khoảng xác định của một quy trình phân tích là khoảng nồng độ cao nhất và
thấp nhất của chất phân tích trong mẫu thử mà trong khoảng đó quy trình phân tích
đáp ứng các yêu cầu về độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính;
- Khoảng xác định được lấy từ kết quả nghiên cứu tính tuyến tính, kết hợp với
kết quả độ đúng, độ chính xác.



7

1.1.5.4. Độ đúng (accuracy)
- Khái niệm
+ Độ đúng của một phương pháp phân tích đánh giá mức độ gần nhau giữa các
giá trị trung bình tìm thấy của một dãy các kết quả thử nghiệm với giá trị thực của
chất phân tích có trong mẫu thử.
- Nguyên tắc xác định
+ Chuẩn bị mẫu tự tạo (mẫu placebo, giống mẫu thử nhưng không có chất cần
phân tích), thêm một lượng (đã biết) chất phân tích vào mẫu tự tạo tại ít nhất 3 nồng
độ tương ứng với 3 mức độ chất phân tích có trong mẫu thử (thường 80%, 100% và
120% nồng độ định lượng chất phân tích).
+ Trong một số trường hợp không thể tạo được mẫu placebo (mẫu nguyên liệu
dược liệu, mẫu sinh học cần phân tích chất chuyển hoá ) thì sử dụng mẫu thử đã
biết nồng độ chất phân tích, thêm chuẩn.
+ Tiến hành định lượng và xác định tỷ lệ % thu hồi lượng chất phân tích thêm
vào;
- Yêu cầu: tỷ lệ % thu hồi phải nằm trong khoảngtừ 98,0% đến 102,0%, độ
đúng = (100% - % thu hồi) ≤ 2%.
Yêu cầu về độ đúng có thể thay đổi tuỳ đối tượng phân tích, phương pháp thử
và mục đích sử dụng.
1.1.5.5. Độ chính xác (precision)
- Khái niệm
Độ chính xác hay độ lặp lại của một phương pháp phân tích diễn tả mức độ
phân tán kết quả của một loạt phép đo thu được khi tiến hành thử nghiệm lặp lại
theo những điều kiện nhất định trên cùng một mẫu đồng nhất.
Độ lặp lại được đánh giá và biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch
chuẩn tương đối (RSD %).
- Nguyên tắc xác định
+ Độ lặp lại được đánh giá dựa trên kết quả của nhiều lần định lượng lặp lại
(thường tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ 100% nồng độ thử, hoặc 3 lần định

lượng tại 3 khoảng nồng độ khác nhau).
8

+ Độ lặp lại được chia thành 3 cấp: độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ tái
lặp.
+ Độ lặp lại (repeatability): tiến hành phân tích trong cùng điều kiện thử
nghiệm (cùng phòng thử nghiệm, cùng người thử nghiệm, cùng ngày, cùng thiết bị);
+ Độ chính xác trung gian (intermediate precision): tiến hành phân tích trong
cùng một phòng thử nghiệm nhưng khác người thử nghiệm, khác ngày, khác thiết
bị;
+ Độ tái lặp (reproducibility): tiến hành phân tích trên nhiều phòng thử nghiệm
khác nhau.
- Yêu cầu: với phép định lượng RSD ≤ 2,0%. Yêu cầu độ lặp lại có thể thay
đổi tuỳ đối tượng phân tích, phương pháp thử và mục đích sử dụng.
1.1.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD),
- Khái niệm
+ Giới hạn phát hiện của thiết bị: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà
thiết bị có thể phát hiện được.
+ Giới hạn phát hiện của một phương pháp phân tích là nồng độ thấp nhất của
chất phân tích trong mẫu thử mà phương pháp phát hiện được. Như vậy LOD của
phương pháp phụ thuộc vào thiết bị phân tích và cả phương pháp chuẩn bị mẫu.
- Nguyên tắc xác định
+ Xác định nồng độ chất phân tích thấp nhất mà tại đó phương pháp phát hiện
được.
+ Cách 1: tiến hành phân tích mẫu thử có chứa chất phân tích với nồng độ
giảm dần, xác định nồng độ chất phân tích thấp nhất mà tại đó đáp ứng của chất
phân tích so với nhiễu đường nền khoảng 3:1.
+ Cách 2: tiến hành xây dựng đường chuẩn của chất phân tích ở nồng độ gần
bằng LOD để tính độ dốc (slope), và phân tích lặp lại mẫu có nồng độ chất phân
tích gần LOD để tính độ lệch chuẩn (SD). Giới hạn phát hiện LOD được tính theo

công thức:
 =
3,3


9

Trong đó  là độ lệch chuẩn của đáp ứng của chất phân tích có nồng độ gần
LOD;
S là độ dốc của đường chuẩn của chất phân tích ở khoảng nồng độ gần LOD.
1.1.5.7. Giới hạn định lượng (LOQ)
- Khái niệm
+ Giới hạn định lượng của một phương pháp phân tích là nồng độ thấp nhất
của chất phân tích trong mẫu thử mà phương pháp định lượng được với độ đúng và
độ chính xác thích hợp;
+ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thường được áp dụng đối với
phương pháp phân tích các mẫu có nồng độ chất phân tích nhỏ (xác định kim loại
nặng, dung môi tồn dư, dư lượng thuốc trừ sâu, tạp chất, sản phẩm phân huỷ )
- Nguyên tắc xác định
Xác định nồng độ chất phân tích thấp nhất mà tại đó độ đúng và độ chính xác
đáp ứng yêu cầu.
LOQ thường được tính theo công thức:
=
10


Trong đó  là độ lệch chuẩn của đáp ứng của chất phân tích có nồng độ gần
LOD;
S là độ dốc của đường chuẩn của chất phân tích ở khoảng nồng độ gần LOD.

10

1.2. Cao thuốc và tiêu chuẩn chất lượng cao đặc
1.2.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định
các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích
hợp. Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến
kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy
hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi,
hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác. Cao thuốc được chia làm 3
loại là cao lỏng, cao đặc và cao khô.
Cao đặc là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao
không quá 20% [2].
1.2.2. Yêu cầu chất lượng cao đặc
Theo quy định của DĐVN IV cao đặc phải đạt các yêu cầu chung sau đây:
- Cảm quan: thể chất, màu sắc mùi, vị, cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả
trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng.
- Mất khối lượng do làm khô: cao đặc không quá 20%.
- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng.
- Định tính: phải có phản ứng định tính của các dược liệu dùng để bào chế cao
thuốc.
- Dung môi tồn dư: khi cao được điều chế sử dụng các dung môi ngoài nước
và cồn.
- Dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật.

- Định lượng: tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt
chất trong cao.
- Đạt yêu cầu quy định về độ nhiễm khuẩn [2].
Ngoài ra còn có thể bổ sung các chỉ tiêu như: cắn sau khi nung (tro toàn phần,
tro không tan trong acid ); cắn không tan trong nước; chất chiết được trong cao


11

1.3. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu của đề tài
1.3.1. Nho và chiết xuất vang nho
- Nho (Vitis sp.)

Hình 1.1: Nho (Vitis sp).
Người Pháp và một số nước Châu Âu khác rất nổi tiếng vì thích ăn những thức
ăn có nhiều mỡ và hàm lượng cholesterol cao. Song “nghịch lý của nước Pháp” mà
mọi người đều biết, tỷ lệ mắc bệnh tim mạch và ung thư ở Pháp lại thuộc hàng thấp
nhất phương tây. Nguyên nhân vì người Pháp uống rất nhiều rượu nho, các chuyên
gia phát hiện trong rượu nho có chứa một chất có hoạt tính rất tốt với tên gọi
resveratrol.
Resveratrol là polyphenol có cấu trúc hóa học đã được xác định là trans -3,5,4'
trihydroxystilbene (hình 1.2). Từ 10 năm nay, resveratrol đã được nghiên cứu rất
nhiều về hoạt tính sinh học. Kết quả khảo sát trên súc vật thí nghiệm cho thấy nó có
tác dụng trên nhiều loại bệnh tật nguy hiểm, bảo vệ hệ tim mạch, phòng bệnh thần
kinh (Alzheimer, Parkinson), phòng và điều trị được nhiều dạng ung thư, kể cả một
số ung thư đã di căn, chống virus, chống nấm, chống viêm, chống oxy hóa, chống
béo phì, tăng lực, kéo dài tuổi thọ. Nhiều nhà khoa học cho rằng resveratrol là hy
vọng sống của người bệnh tiểu đường, ung thư tiền liệt tuyến v.v.Đã có hơn 18.000
bài báo nghiên cứu toàn diện về resveratrol. Những nghiên cứu này còn tiếp tục.
Resveratrol đã được dùng ở các nước tiên tiến dưới dạng thực phẩm chức năng [12].

12

Cấu trúc hoá học của resveratrol
OH
OH
HO
C
14
H
12
O
3
ptl: 228,24 g/mol

Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của resveratrol.
Resveratrol đã được sản xuất từ thực vật thiên nhiên như: Nho, lạc, thông, vỏ
bạch dương, cốt khí củ… Mỗi nguyên liệu có ưu thế riêng, trong đó, cốt khí củ
(polygonum cuspidatum) được ưa chuộng vì là loại thực vật dễ trồng, hàm lượng
hoạt chất cao, đã dùng từ lâu trong đông y không có độc tính. Hàm lượng
resveratrol trong cốt khí củ cao nhất, sau đó là vỏ và hạt nho. Resveratrol cũng đã
được tổng hợp hóa học, sản phẩm tổng hợp dùng chủ yếu để sản xuất mỹ phẩm.
Tổng hợp cần đến các hóa chất đắt tiền nên ít dùng. Vì vậy, từ nguyên liệu thiên
nhiên, resveratrol được sản xuất bằng cách chiết xuất bằng dung môi [12].
Hoạt tính sinh học:
Tác dụng phòng chống xơ vữa động mạch [20], phòng chống bệnh tim mạch
[19], đặc biệt là chứng nhồi máu cơ tim của resveratrol đã được chứng minh. Tác
động của resveratrol lên các yếu tố liên quan cơ chế hình thành xơ vữa động mạch

và các yếu tố nguy cơ xơ vữa động mạch do làm giảm sự biểu hiện của phân tử kết
dính tế bào, kích thích yêu tố bạch cầu đơn nhân, enzym metalloproteinase, các yếu
tố tăng trưởng và ức chế kết tập tiểu cầu, làm tăng sinh tế bào cơ trơn. Đồng thời
resveratrol làm giảm cholesterol toàn phần, triglycerides, làm tăng HDL-
cholesterol, ức chế sự biểu hiện hoạt động của protein-C và làm giảm mức độ tiến
triển sản phẩm cuối cùng glucation và thụ thể của nó trong các mô mạch máu.
Resveratol làm giảm các yếu tố nguy cơ cho mảng xơ vữa vỡ. LDL-cholesterol có
vai trò quan trọng hình thành nên mảng xơ vữa và viêm nội mô động mạch.
Resveratol làm tăng biểu hiện và hoạt động của receptor LDL tại gan, receptor giữ
vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipoprotein, làm giảm nồng độ LDL-cholesterol
13

trong huyết thanh [54]. Resveratrol có tác dụng chống oxy hóa và có khả năng tạo
phức kim loại nên có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa LDL [19], [21]. Đồng
thời, resveratrol làm tăng HDL đến 12%, hạ đường huyết, cải thiện tuần hoàn, ngăn
ngừa sự ngưng kết tiểu cầu, giảm hình thành huyết khối, do đó làm giảm nguy cơ
nhồi máu cơ tim.
Ngoài ra resveratrol còn được biết đến là một hoạt chất có tác dụng phòng
chống ung thư, ức chế sự phát triển của các tổn thương trước khi phát triển thành u,
chống lại cả 3 giai đoạn hình thành và phát triển khối u là giai đoạn khởi đầu, phát
triển và di căn.
Resveratrol có tác dụng hiệu quả trong chống lão hóa bao gồm các dấu hiệu
tuổi già, bệnh thoái hóa thần kinh, Alzheimer và Parkinson…
- Trong nước, đã có một số nghiên cứu chiết xuất resveratrol:
Năm 2006, nhóm nghiên cứu Bộ môn Hóa dược, ĐH Dược Hà nội đã công bố
nghiên cứu tổng hợp resveratrol [16].
PGS. TS. Vũ Đình Hoàng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu công nghệ chiết
tách resveratrol từ nguồn thực vật Việt Nam [13].
1.3.2. Trần bì và chiết xuất trần bì
- Trần bì là vỏ quả chín phơi hay sấy khô của quả Quýt, có tên khoa học là

Citrus reticulate Blanco, họ cam (Rutaceae).

Hình 1.3: Quả quýt và dược liệu trần bì.
Những nghiên cứu khoa học cho thấy dược liệu trần bì có các nhóm thành
phần hoạt chất:
14

Carotenoid: Các chất sắc tố từ vàng đến đỏ cam và tan trong tinh dầu vỏ. Các
chất thường gặp là carotene, cryptoxanthin, auroxanthin [33]
Tinh dầu: Vỏ quả ngoài của tất cả các loài chứa một lượng lớn tinh dầu nằm
trong túi tiết [43],[47]. Thành phần trong tinh dầu rất đa dạng, bao gồm các
monoterpen, các alcol, các aldehyd, các ester, ether, và các ceton. Một số thành
phần chính trong tinh dầu citrus có thể kể đến là cymen, geraniol, geranial,
limonene (chiếm hơn 80%), pinen, sabinen, terpinen, terpinolen… Vỏ quả của các
loài citrus thu hái tại nhiều nơi ở Việt Nam cũng được xác định có chứa hàm lượng
lớn về tinh dầu. Tinh dầu citrus có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, kháng
khuẩn, kháng virus, kháng nấm [19],[52]. Tinh dầu được sử dụng trong công nghiệp
làm mỹ phẩm và làm gia vị [37].
Coumarin: Các coumarin có nhiều trong các cây thuộc họ rutaceae nói chung.
Một số coumarin hay gặp trong các loài citrus là bergamottin, bergapten,
imperatorin, isoimperatorin, osthol, psoralen Coumarin có các tác dụng sinh học
chống ung thư [47],[52] chống oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, [37].
Alkaloid: Các alkaloid có nhiều trong họ rutaceae. Thông thường các loài
citrus có chứa alkaloid có cấu trúc protoalkaloid là dẫn xuất của tyramin. Các
alkaloid này có tác dụng diệt côn trùng [52].
Flavonoid: flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài citrus,
phân bố ở tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lượng cao trong vỏ quả [33]. Hiện
nay số lượng flavonoid đã được phân lập và xác định từ vỏ quả các loài citrus là
khoảng hơn 60 chất, thuộc các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin
(hình 1.4). Thông thường, các flavonoid tồn tại trong citrus ở cả dạng aglycon tự do

và dạng glycosid [44].

15

Hình 1.4: Cấu trúc cơ bản các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus.
Thành phần flavonoid chính có trong tất cả vỏ quả của các loài Citrus là các
citroflavonoid: naringenin, hesperitin và các glycosid của chúng là naringin,
hesperidin là các thành phần chính của vỏ quả các loài Citrus. Các chất này chiếm
hàm lượng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô. Điều đặc biệt là
narigenin, naringin, hesperitin và hesperidin có hàm lượng lớn trong các loài thuộc
chi Citrus nhưng lại rất hiếm gặp ở các chi và họ khác.
Cấu trúc hoá học của hesperidin

Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của hesperidin.
Hoạt tính sinh học:
Tác dụng chống oxy hóa: các flavonoid có nhóm hydroxy (OH) gắn với vòng
thơm có tác dụng chống oxy hóa [40]. Nếu flavonoid có nhóm catechin (nhóm o-
dihydroxy), hay có một nhóm OH ở vị trí số 3 và số 5 sẽ cho tác dụng chống oxy
hóa mạnh [40], [52]. Các nhóm này có tác dụng loại bỏ các gốc tự do trong của cơ
thể, như các gốc tự do superoxid (O
2
-●
), hydroxy (OH
●
), lipid peroxyl (LOO
●
), lipid
alkoxyl (LO
●
), oxyd nitric (NO

●
). Các gốc tự do là nguyên nhân gây ra quá trình
oxy hóa trong cơ thể, chúng có thể gây ra sự oxy hóa lipid, protein và kể cả DNA
[23]. Khi các quá trình oxy hóa xảy ra nhiều trong cở thể, chúng sẽ gây ra sự phá
hủy các tế bào và do đó dẫn đến bệnh tật.
Các citrus flavonoid, vì vậy, có tác dụng chống oxy hóa mạnh [43], [19].
Thông thường thì các aglycon flavonoid có tác dụng mạnh hơn các glycosid của
chúng [52]. Chúng giúp cơ thể chống lại sự oxy hóa lipid, protein và DNA gây ra
bởi các gốc tự do.
Tác dụng trên hệ mạch