Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền và bán định lượng gymnemagenin của loài dây thìa canh lá to (gymnema latifolium wall ex wight) ở việt nam









THÌA
CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM





- 2014







CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM








PGS. TS. Trần Văn Ơn
ThS. NCS. Phạm Hà Thanh Tùng


 2014





Em xin được bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn và lời cảm ơn sâu sắc nhất
tới PGS TS Trần Văn Ơn và ThS NCS Phạm Hà Thanh Tùng - Bộ môn
Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy đã tận tình hướng dẫn,
định hướng, truyền cảm hứng và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực
hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em sinh viên Đoàn Thị Phương –
K66, Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn sẵn sàng hỗ trợ em trong quá
trình thực hiện.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các chị kĩ thuật viên
và các em sinh viên nghiên cứu khoa học - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành
tốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn.
Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh
chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học
tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Học viên
Nguyễn Thị Thu Hiền

MC LC
DANH MC CÁC BNG
DANH MC CÁC HÌNH
DANH MC CÁC CH VIT TT
T V 1
 TNG QUAN 3
1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 3
1.1.1. V thc vt 3
1.1.2. V ng di truyn 4
1.1.3. V thành phn hoá hc 5
1.1.4. V tác dng sinh hc 9
1.2. TNG QUAN V U 11
1.2.1. Nghiên cm di truyn 11
1.2.2. áp vân tay sc ký 13
1.2.3. ng dc ký lp mng hi
(HPTLC) 15
 NG VÀ U 17
2.1. NGUYÊN VT LIU NGHIÊN CU 17
2.1.1. Mu nghiên cu 17
2.1.2. Dung môi, hóa cht 17
2.1.3. Máy móc, thit b 18
2.2. U 19
2.2.1. Nghiên cm hình thái 19
2.2.2. Nghiên cng di truyn 20
2.2.3. Vân tay sc ký Gymnema latifolium Wall. ex Wight 22
2.2.4. ng bc ký lp mng hi

(HPTLC) 24
 KT QU NGHIÊN CU 27
3.1. M THC VT CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL.
EX WIGHT 27


3.1.1. m a các mu 27
3.1.2. Tng hp các so sánh v m thc vt các mu nghiên cu 31
3.2. M DI TRUYN CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL.
EX WIGHT 33
3.2.1. Tách chit ADN 33
3.2.2. Kt qu khui ADN (PCR) 33
3.2.3. nh trình t ADN ribosom vùng ITS 34
3.2.4. So sánh trình t ADN ribosom vùng ITS 35
3.2.5. Xây dng cây phân loi 37
3.3. VÂN TAY SC KÝ CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX
WIGHT 39
3.3.1. Vân tay sc ký các mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight 39
3.3.2. ng Gymnemagenin trong các mu Gymnema latifolium Wall.
ex Wight b 41
 BÀN LUN 44
4.1. V M HÌNH THÁI 44
4.2. V M DI TRUYN 45
4.2.1. Trình t ADN ribosom vùng ITS 1
4.2.2. ng di truyn các mu Gymnema latifolium 
trình t ADN ribosom vùng ITS 46
4.3. VÂN TAY SC KÝ CA LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX
WIGHT 48
4.4.  NG GYMNEMAGENIN TRONG CÁC MU
GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 49

4.4.1. V thng Gymnemagenin b
pháp HPTLC 49
4.4.2. V kt qu ng 50
4.5. V TÍNH MI C TÀI 52
KT LUN 54
KIN NGH 55
TÀI LIU THAM KHO 56



DANH MC CÁC BNG

Bng 1.1
Cu to ca acid gymnemic A  D
6
Bng 2.1
V u trong nghiên cu
17
Bng 2.2
m hình thái mô t các mu G.latifolium Wall. ex
Wight
19
Bng 2.3
Các thành phn ca phn ng PCR
21
Bng 2.4
Các dãy n ca dung dch mu chun (mg/ml)
24
Bng 3.1


32
Bng 3.2

34
Bng 3.3
Cn ADN bo th t c các mu
nghiên cu
34, 35
Bng 3.4
H s ng di truyn trình t ca các mu G.
latifolium Wall. ex Wight nghiên cu và G. sylvestre
(Retz) R. Br. ex Schult. (Genbank)
36
Bng 3.5
Thành ph dài trình t n ITS1, 5.8S,
ITS2
36
Bng 3.6
G. latifolium Wall. ex Wight
nghiên cu
40
Bng 3.7
N Gymnemagenin chun và ding
42
Bng 3.8
Giá tr R
f
và din tích pic ca các vt sc ký
43
Bng 3.9

Kt qu ng Gymnemagenin b
pháp HPTLC
43








DANH MC CÁC HÌNH

Hình 1.1
Cu to acid gymnemic A
1
, A
2
, A
3
và A
4

6
Hình 1.2
Cu trúc ca các acid gymnemic phân l c t
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h
ng huyng
7, 8
Hình 1.3

n ethyl acetat
trong mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight
8
Hình 1.4
Cu trúc hoá hc ca hp cht GLHE9 (a), GLHE7(b)
9
Hình 1.5
Cu trúc ca vùng ADN ribosom ITS
13
Hình 1.6
 thy phân acid gymnemic to Gymnemagenin
15
Hình 3.1
11
o
- 106
o

27
Hình 3.2
Gia Lai; 13
o
- 108
o

28
Hình 3.3
(Hòa Bình; 20
o
N - 105

o

29
Hình 3.4
Mu GL4 (Thái Nguyên; 21
o
- 105
o

30
Hình 3.5
Tuyên Quang; 22
o
- 105
o

31
Hình 3.6
n di sn phm tách chit ADN
33
Hình 3.7
n di sn phm ADN khui
33
Hình 3.8
     t 2 loài trong chi
Gymnema R. Br
37
Hình 3.9
    c xây dng t các mu Gymnema
latifolium Wall. ex Wight và Gymnema sylvestre (Retz) R.

Br. ex Schult
38
Hình 3.10
S   ca các mu nghiên cu so sánh vi chun
Gymnemagenin
39
Hình 3.11
Kt qu chng pic ca mu th, mu chun và mu trng
41
Hình 3.12
Mi liên h gia n và din tích pic
42
Hình 4.1
c xây dng t các mu
trong chi Gymnema R. Br.
48



DANH MC CH VIT TT

Chữ
viết tắt
Tên đầy đủ
Diễn giải
ADN
Acid Deoxyribo Nucleic
Acid Deoxyribo Nucleic
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool

Công cụ tìm kiếm đồng bộ trình tự
bp
Base pair
Cặp base nitơ
C
Cystein
Cystein
CMC
Chemistry, Manufacture and Control
Hóa học, sản xuất và kiểm soát
FDA
Food and Drug Administration
Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Hoa Kỳ
G
Guanin
Guanin
GAP
Good Agricultural Practice
Thực hành trồng trọt tốt
GC
Gas Chromatography
Sắc ký khí
GMG
Gymnemagenin
Gymnemagenin
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC
High Performance Thin Layer
Chromatography
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
IND
Investigation New Drug
Trung tâm nghiên cứu thuốc mới
IR
Infrared
Tia hồng ngoại
ITS
Internal Transcribed Spacer
Vùng phiên mã nội
matK
Maturase K
Maturase K
MS
Mass Spectrometry
Khối phổ
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
RAPD
Random Amplified polymorphic
DNA
Phân tích đa hình AND khuếch đại
ngẫu nhiên
rbcL
Ribulose-1,5-biphosphate
Ribulose-1,5-biphosphate

R
f
Retention factor
Hệ số lưu giữ
RNase A
Ribonuclease A
Ribonuclease A
rps16
Ribosomal protein S16
Ribosomal protein S16
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SFDA
State Food and Drug Administration
Cục quản lý thực phẩm và dược
phẩm Trung Quốc
TAE
Tris- acetat - EDTA
Tris- acetat - EDTA
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
UPGMA
Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean
Phương pháp xây dựng cây phát
sinh loài dạng có gốc
UV
Ultraviolet Radiation

Tia cực tím
WHO
World Health Organization
Tổ chức Y tế thế giới

1


T V
Trong nn y hc c truyn  Ayurveda, cây dây thìa canh (Gymnema
sylvestre c s dng t  u tr
ng [59], [61]. T n nay, các nhà khoa hc vm và
sàng lc tác du tr  cây dây thìa canh t các loài khác
nhau trong cùng chi Gymnema a trên nguyên lý là các
loài trong cùng mt bc taxon thc vng có các thành phn hóa h
ng tác dng sinh hc ging nhau. Mt s nghiên cu trên th
gic tác dng h ng huy trên các loài Gymnema
montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema yunnanense
Tsiang,  Vit Nam, nghiên cu v c thc hin bi
        u v  m thc vt và tác dng h
ng huyt ca cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.)
[13] ng nghiên cu v c
m thc vt, thành phn hóa hc và tác dng sinh hc ca cây dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Hòa Bình [6] là cây dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium 
và có tác dng h ng huy       Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult.) trên mô hình   ng huyt chut bng
Streptozocin (STZ) [9], [11]. Bên c        Gymnema
latifolium Wall. ex Wight) có kh ng tng thi sinh khi ln
i cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre y

có th  nhnh cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)
ng và thm chí là tii cây dây thìa canh (Gymnema
sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.). Góp phn vào vic nghiên c cây
dây thìa canh lá to  Vit Nam (Gymnema latifolium     tài
m hình thái, di truyng Gymnemagenin

2

ca loài dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Vi
c thc hin vi các mc tiêu :
 Nghiên cm hình thái ca các mu dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight) thu hái ti Vit Nam.
 Nghiên c  m di truyn phân t ca các mu dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight).
   ng Gymnemagenin có trong các mu dây thìa canh lá to
(Gymnema latifolium Wall. ex Wight) nghiên cu.

3

 TNG QUAN
1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT
1.1.1. V thc vt
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Theo h thng phân loi ca Takhtajan công b  [16], dây thìa canh
lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có v trí phân lo
+ Ngành Ngc Lan (Magnoliophyta)
+ Lp Ngc Lan (Magnoliopsida)
+ Phân Lp Hoa Môi (Lamiidae)
+ B m (Gentianales)
+ H  (Apocynaceae)
+ Phân H Thiên lý (Asclepiadoideae)
+ Chi Gymnema R.Br.
+ Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) c bin  n
 vkhác là Gymnema khandalense Santapau và Gymnema
kollimalayanum A. Ramachandran & M. B. Viswan [56].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của loài
Thân leo ti 6 m. Thân có l v, các nhánh có nhing lá 1,5-4
c; phin lá 8-13×5-c, càng xa trc càng dày
c, gc tròn, ngn nhn, gân bên 6-7 cp. Cm hoa xim du thành t

mc. Mt cm mang rt nhing cm hoa 1-
1,5 cm, cung hoa 3-ng, ph 
chuông, nhn  mt ngoài. ng hoa có 5 cp g mang lông  hng tràng, các thùy
hình trng, khong 1,2 ×1,2 mm, ph ng trc, ngi ng
tràng [11].
Tr nh nhy dng hình tr, phn ph nh dng màng ngu núm
nhy. Khi phu núm nh i hình
mác nh-5,5×1,5-2 cm, có lôc. Ht hình trng thuôn, dài
khong 1,1 cm×5 mm, mép dng màng; mào lông dài 3 cm [11].

4

Phân bo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quc (Qu
Qung Tây, Vân Nam),  (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra,
Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [56], Vi      
Nguyên) [11].
1.1.2. V ng di truyn
m Hà Thanh Tùng  nghiên cnh s khác
bit di truyn s dng ch th phân t RAPD ca 26 mu thuc 5 loài trong chi
Gymnema u Gymnema latifolium Wall. ex Wight. Kt qu
cho thy, 3 mu  min Bc Vit Nam (Hoà Bình, Thái Nguyên và Tuyên Quang)
cùng nm trong cùng mt nhóm di truyu  gn khu vc min
Trung Vit Nam không cùng nhóm này. Kt qu cho thy s khác bit ca các mu
theo s phân b a lý [11].
 Thanh Thuý i trình t n gen ITS ca
8 mu trong chi Gymnema R.Br Kt qu nh s ng di truyn ca 2
mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight. là 0,     n trình t
CGGCCCAAA  v trí nucleotid 56 trên vùng kho sát ITS1+5.8S+ITS2 hoàn toàn
khác biGymnema latifolium Wall. ex Wight so vi trình
t  trên ngân hàng gen th gii (Genbank). Kt qu chng minh kh

u s ng di truyn ca các mu s dn trình t gen ITS và
 ca vic công b trình t gen ca các mu nghiên cu trên ngân hàng gen
th gii [10].
   d liu ca ngân hàng gen th gii (Genbank), loài Gymnema
latifolium      c công b trình t ca 3 vùng gen: rbcL,
rps16, trnL-FSurveswaran S., Kamble M., Yadav S.R., Corke H. và Sun
 trình t vùng gen rbcL dài 1266 bp vi mã s truy cp trình
t là EU232692. M  Surveswaran S., Sun M., Grimm G.W. và Liede-
Schumann S. (2014) trong nghiên cu c trình t vùng gen intron
rsp16 dài 763 bp (HG530601) và trình t vùng trnL-F dài 837 bp (HG530575) [53],
[64].


5

1.1.3. V thành phn hoá hc
 n nay các nghiên cu hóa h c tp trung vào loài Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. ex Schulta Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex
Schult có cha triterpene saponin thuc nhóm oleanan (thành phn chính là các acid
gymnemic và gymnemasaponin) và nhóm dammaran (thành phn chính là các
gymnemaside) [14]. Các thành phn khác bao gm anthraquinon, flavon,
hentriacontan, pentatriacontan, phytin, resin, acid tartaric, acid formic, acid butyric,
 -amyrin, stigmasterol, và calcium oxalat [52]. Ngoài ra trong thân ca
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult còn có cha alkaloid [14].
Thành phn tác dnh là acid gymnemic, là tên chung
ca các acid hc nhóm saponin triterpenoid khung olean [14] và v bn
cht acid gymnemic không phi là mt cht tinh khit mà là mt hn hp các cht.
Theo thi gian nghiên cng công b khoa hc v 
sau:
Theo Warren và Pfaffmann (1959), acid gymnemic là hn hp ca acid

gymnemic A
1
(chim 70%) và acid gymnemic A
2
(chim 30%). Walter Stocklin
(1969) thì cho rng acid gymnemic là hn hp ca 4 acid gymnemic A
1
, A
2
, A
3
và
A
4
. Khi thc hin phn 
t cu thành ca gymnemic acid gm có ph ng (tri-O-acetyl--D-
glucofururono lacton, tera-O-acetyl-D-glucuronic acid cùng m   
c cu trúc) và hn hp aglycon (gm genin G, genin J, genin K), tin hành
phn ng kic Gymnemagenin và hn hp các acid (hình
1.2) [52].

6


Hình 1.1. Cu to acid gymnemic A
1
, A
2
, A
3

và A
4
[52].
Tin hành phân lp trên sc ký c       acid
gymnemic là hn hp ca 4 acid gymnemic A u
to ca các genin G, J, K và N [51], [52]. Khác vi vic acid gymnemic A
1
có th
chuyn dng sang gymnemic A
2
[14], cu trúc ca 4 acid gymnemic A, B, C và D là
hoàn toàn khác nhau.
Bng 1.1. Cu to ca acid gymnemic A  D [50].
Acid
gymne
-mic
ng
Agly-
con
Genin
Phn aglycon
Acid
formic
Acid
acetic
Acid
Iso-
valeric
Acid
tiglic

A
Acid
glucuronic
G
Gymnemagenin
+
+
+
+
J
Gymnemagenin

+
+
+
B
Acid
glucuronic
K
Gymnemagenin
+

+
+
C
Acid
glucuronic
N
Gymnestrogenin

+
D
Acid
glucuronic
-
Gymnestrogenin




Gt, t dch chit nóng lá cây Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex
Schult, Yoshikawa và cng s  t I
n XVIII) có cu trúc và kh  ng huy[60],
[61], [62]:

7


OH
OR
2
CH
2
OR
4
H
H
OR

3
CH
2
OH
R
1
O


O
OH
H
H
OH
OH
H
OH
H
CH
2
OH

-glucopyranosyl
O
COOH
OH
H
H
OH
H

OH
OH
H

-gluA
O
O
OH
H
H
OH
H
H
OH
CH
2
OH

-arabino-2-hexulopyranosyl(-OG)
C
C
C CH
3
O CH
3
H

Tga = Tigloyl
C
C

C
CH
3
CH
3
O

Mba = 2-methylbutyroyl
CH
3
O

Ac
O

Bz
STT
Acid gymnemic
R
1
R
2
R
3
R
4
TD*
1
Acid gymnemic I
-gluA

tga
H
Ac
1
2
Acid gymnemic II
-gluA
mba
H
Ac
1
3
Acid gymnemic III
-gluA
mba
H
H
0,5
4
Acid gymnemic IV
-gluA
tga
H
H
0,25
5
Acid gymnemic V
-gluA
tga
tga

H
0,5
6
Acid gymnemic VI
-gluA
3
- -glc
tga
H
H
0,5
7
Acid gymnemic VII
H
H
H
H
(-)**
8
Acid gymnemic VIII
-gluA
3
- -OG
mba
H
H
(-)
9
Acid gymnemic IX
-gluA

3
- -OG
tga
H
H
(-)
10
Acid gymnemic X
-gluA
H
H
Ac
0,5
11
Acid gymnemic XI
-gluA
tga
H
tga
1
12
Acid gymnemic XII
-gluA
3
- -glc
tga
H
Ac
1
13

Acid gymnemic XIII
-gluA
H
H
mba
0,5
14
Acid gymnemic XIV
-gluA
H
H
tga
0,5
15
Acid gymnemic XV
H
mba
tga
H
1
Hình 1.2a. Cu trúc ca các acid gymnemic phân lc t Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h ng huyng [14].

8

STT
Acid gymnemic
R
1
R

2
R
3
R
4
TD*
16
Acid gymnemic XVI
tga
H
H
H
1
17
Acid gymnemic XVII
H
Bz
H
H
1
18
Acid gymnemic XVIII
H
H
H
Bz
1
Ghi chú: TD*: tác dng h ng huyt × tác dng h ng huyt cu acid
gymnemic I; (-) **: không phát hic.
Hình 1.2b. Cu trúc ca các acid gymnemic phân lc t Gymnema

sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h ng huyng [14].
Ti Vit Nam, th nghinh các nhóm cht có trong dây
thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ti Hòa Bình có thành
phn chính gm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, chng kh và
coumarin [6].
Trong nghiên cn phm thu n ethyl acetat
ca dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) n có pic sc
ng vi Gymnemagenin trên s (hình 1.3).

Hình 1.3. nh tính Gymnemagenin trong các n ethyl acetat
trong mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight.
a. Gymnemagenin chun.
b. n ethyl acetat ca Gymnema latifolium Wall. ex
Wight sau khi thy phân [11].

9

Mt, phân lp t n ethyl acetat ca bc liu dây thìa
canh lá to (Gymnema latifolium c hp chc
 nh là -acetoxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-on) và hp cht
GLHE7 (lupeol acetat) (hình 1.4) [4].
c tài liu nào trên th gii công b v các hp
chc phân lp t dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight).
12
8
7
6
9
10
5

1
2
3
11
AcO
13
4

14
18
30
16
15
20
21
O
17
19
29
28

26
22
17
12
8
27
7
6
9

10
5
1
2
3
23
24
29
20
30
19
21
18
11
28
15
16
AcO
13
14
4
Ac =
C
CH
3
O

a) b)
Hình 1.4. Cu trúc hoá hc ca hp cht GLHE9 (a), GLHE7(b) [4].
1.1.4. V tác dng sinh hc

1.1.4.1. Tác dụng hạ đường huyết
Theo Trn    ng s (2011), dch chit lá
Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Vit Nam có tác dng
h ng huyt trên c chung (24,07%) tác dng cao nht th hin sau
4 gi   n 5 gi và trên chu   ng huyt bi Streptozotocin
(36,31%) sau 10 ngày cho ung dch chit. Liu dùng thích hp lá dây thìa canh là
cn toàn ph c pha thành hn d  c ct vi t l 1:1, vi liu
ng vi 10g lá khô/kg th trng [9].
Kt qu th nghim Dây
thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) m    
(Gymnema sylvestre (Retz) R.Br. ex Schult.)
- 

 -            -
 

10

Ngoài các công b trên, hin nay trên th gi Vi
mt công b chính thc nào v tác dng sinh hc ca Dây thìa canh lá to (Gymnema
latifolium Wall. ex Wight).
1.1.4.2. Tác dụng kháng khuẩn
Các nhà khoa hc nhn thy Gymnema sylvestre (Retz) R.Br. ex Schult. và
Gymnema montanum Hook. có tác dng kháng khun trên c chng vi khun gram
 [45]. Phù hp vm các loài trong cùng mt bc taxon
thc vng có các thành phn hóa h ng tác
dng sinh hc ging nhau, các nhà khoa h   n thy Gymnema
kollimalayanum A. Ramachandran & M. B. Wiswan (tên a Gymnema
latifolium Wall. ex Wight [20]) có tác dng kháng khu.
n hành th tác dng kháng

khun ca dch chic và dch chit dung môi h
petroleum ether, ethanol) ca bt lá Gymnema kollimalayanum A. Ramachandran &
M. B. Wiswan thu hái ti Peninsular   trên 8 chng vi khun gram âm
(Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella paratyphi, Shigella boydi, S.
brunci, S. dysentriae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica) và 2 chng
vi khu   Cornybacterium diptheriae và Enterococus faecalis). Kt
qu c cho thy dch chic không có tác dng kháng khun. Ngoi tr
dch chit methanol không có tác dng trên Cornybacterium diptheriae và Proteus
vulgaris, các dch chit dung môi ha bt lá Gymnema kollimalayanum A.
Ramachandran & M. B. Wiswan còn lu cho tác dng. Dch chit hexan cho tác
dng kháng khun mnh nh ng kính vòng tròn kháng khun ca các dch
chiu trong khong 10  21 mm [44].
n hành
th tác dng kháng khun ca dch chit các dung môi h
methanol) ca lá Gymnema kollimalayanum A. Ramachandran & M. B. Wiswan
   i   trên 5 chng vi khun gram âm (Escherichia coli,
Psuedomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebseilla pneumoniae, Salmonella
typhi) và 3 chng vi khu   Staphylococcus aureus, Streptococci

11

pneumoniae, Bacillus subtilis). Ngoi tr dch chit acetone không có tác dng trên
chng vi khun Bacillus subtilis, các dch chit còn l u cho tác dng kháng
khung kính vòng tròn kháng khun ca các dch chiu trong
khong 7 - 11 mm [40].
1.2. TNG QUAN V U
1.2.1. Nghiên cm di truyn
1.2.1.1. Phương pháp mã hóa ADN (“ADN barcoding”) trong phân loại học
Phân loi hc ngày nay gây ra nhiu tr ngi cho các nhà khoa hc khi cn
n d lp lc chp

nhn rng rãi. Nhng v v phân loi hn ti s phát trin c
pháp mi có th nhn dng nhanh bt kì mt loài nào da trên trình t ADN thu
c c thuyt, các nhà khoa hon ADN
At trình t ADN có chiu dài t n
800 bp có th c phân lp t tt c các loài thc vt hong vt
[24], [48]. Cùng vi s phát trin ca sinh hc phân t, công ngh gii trình t và
phân tích d liu sinh hn Ac mã hóa cho phép nhn bit hoc khôi
phc các thông tin t t và khám phá ra hàng nghìn loài mn
Ac mã hóa tr thành công c thit yu cho các nhà phân loi hc giúp
nhn bit và quc toàn b h sinh thái rng ln và nhiu bii [31].
Mn ADN n nht, là mt hoc
nhin trình t gen ngc tách ra t h gen ca mc s d
nhn di [31]n trình t gen này phi tha mãn ba tiêu chun: (1) tính
c hiu cha nhng thông tin di truyn quan trng ca loài, (2) cha nhng v trí
thích hp giúp vic gn các cp mi PCR d dàng và ( dài thích h thun
tin cho vic tách chit và gii trình t ADN. Tiêu chun th c mt s nhà
khoa h   n trình t phi có ch ng tt [26], [32]. Paul
  ng nghip (2003) là nh    ngh ng dng nhng
n trình t ADN ng nhn din di truyn vi m
nhn din nhanh, tin cy  m loài trong h sinh vt. ng dc thc
hiu ting vt [24], [25]t các nghiên cu sàng lc

12

trên h gen thc vt, ba vùng gen trong plastid (rbcL, matK và trnH-psbA) và mt
vùng gen trong nhân (ITS) là nhn ADN tiêu chu la chn trong hu
ht các nhn din các loài thc vt và nm [19], [32], [41], [49].
n din các loài dn trình t Ac mã hóa
gn: (1) xây dn gn Ac mã hóa
ct và (2) nhn dii chiu, so sánh

n Ac mã hóa ct vn trình t t trong
n. Thung b trình t c s d ng b mn trình t
At vi mn trình t Ac mã hóa ct thông
qua tìm kim d liu trình t ging nht vi trình t t [47]. Ngân hàng gen
(Genbank) cung cp công c  tìm
kim s ng b gia mt trình t t và mt trình t n
[31].
1.2.1.2. Vùng phiên mã nội của ADN Ribosom (ITS – rADN)
Nghiên cu v ADN thc vt, có 3 lo   c chn làm i
ng nghiên c     p th và ADN ty th. Trong s 
ADN nhân t ra có nhiu  trong nghiên cu phân loi thc vt bi ADN nhân
có m tic s khác bit v di truyn
ngay c gia các loài trong cùng 1 chi hay gia các cá th ca cùng mt loài. Trong
c chui ADN nhân ca t bào thc vt, khu vc nghiên cu nhiu nht là
vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã ni (internal transcribed spacer 
ITS) vi nhin lp v trình t nucleotid [10]. Riêng vùng phiên mã ni (ITS),
 gin 2900 trình t này ca
các loài thc vt ht kín [27]. Mt kho sát ca Álvarez và Wendel (2003) thy rng
khong 1/3 (34%) các nghiên cu công b v phát sinh loài (phylogenetic analyses)
 da trên duy nht trình t ITS [15].
Cu trúc ca ITS  nh nm trong vùng 18S  26S ADN
ribosome nhân, gm 3 phn: ti 5.8S  trình t có tính bo tn cao trong
tin hóa và 2 vùng phiên mã ni ITS 1 và ITS 2 [17].  dài trình t phn ti
v 5.8S g dài vùng phiên

13

mã ni ITS có s n 252
bp). Toàn b vùng ITS  thc v i 700 bp [17].

Hình 1.5. Cu trúc ca vùng ADN ribosom ITS [17].
1.2.2. c ký
1.2.2.1. Vài nét về phương pháp vân tay sắc ký trong nghiên cứu
Sc ký là mt k thuc ng dng trong nhiu ngành khoa hc. Tt c các
loi hình su có nguyên tc tách ging nhau: mc hòa tan
trong mt pha động. Pha này có th là mt cht khí, cht lng hoc cht lng siêu
ti hc cho qua pha tĩnh mt cách liên tc và không hòa ln v
c c nh trong ct hay trên b mt cht rn. Các cht tan là thành phn ca mu
s di chuyn qua ct theo ng vi t khác nhau tùy thu
ging và cht tan. Nh t di chuyn khác nhau các thành phn
ca mu s tách riêng bit thành di, nh  thut này rt có giá tr trong vic
tách, phân lp, tinh ch và nhn dng các thành phn trong hn hp [21].
Theo Liang Y.Z và cng s (2004), du vân tay sc ký ca sn phm t c
liu là mt h sc ký ca hot cht và các thành phn hóa hc khác có trong c
liu, có th là t c liu thô, bán thành phm hay thành phm bng k thut phân
tích thích hp. Các k thuc s d 
du vân tay sc ký lp mng (TLC), sc ký lp mng hi 
(HPTLC), sc ký lng hic ký khí (GC) [34], [36], [63].
c chp nhn trên toàn c t
ng c c liu làm thuc. Cc qun lý thc phm v c phm Hoa K

14

(FDA) chp nh c s d kim soát chng
ca các sn phm và nguyên liu có ngun gc liu trong ng dng v hóa hc,
sn xut và kim soát (CMC) ca trung tâm nghiên cu thuc mi (IND). Bên cnh
 c, Anh,   và T chc Y T th gi   p thun
 ng ca thuc t c liu. Cc qun lý
thc phc phm Trung Qu  u các nhà sn xut tiêu
chun hóa thuc tiêm và ngun nguyên liu thô ngun g c liu s dng

c ký [63].
1.2.2.2. Phương pháp vân tay sắc ký dựa vào kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao (HPTLC)
Sc ký lp m       c s
d c lin, nhanh gn và kinh t
pháp phân tích dt s hn ch  phân gii th nhy
thp và khó phát hic mt hn hp ch [63].
Halpaap (1973) u tiên nhn thy rng tin ích ca các ht silica gel
c nh (5-6 µm) v thi gian khai trin, giá tr h s  R
f
và chiu
cao bn mng khi chun b các bu
tiên công b chính thc v HPTLC. Cùng vi s h tr ca h thng máy móc,
  lp li c
c s dng rt
hình thc tân tin nht ca công c TLC [21], [36].
c ký lp mng (TLC) mà c th c la
chn  phân tích du vân tay sc ký vì tính linh hot, nhanh và kinh t. HPTLC có
th nhn dic nhiu mu khác nhau ti cùng thm và có th tách t dch
chit thô cc liu vi h dung môi thích hp mà không cn quá trình tinh ch
  c s d  xác
nh vân tay sc ký cc liu.



15

1.2.3. ng dc ký lp mng hi
(HPTLC)
     u chun hóa thành phn tác d  c

thc hi i vi dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight. Tuy
nhiên các nghiên c ra trong thành phn hóa hc ca Gymnema latifolium
Wall. ex Wight có Gymnemagenin [11] th nghim dây
thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight có tác dng h ng huyt cao
dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. [9]. Có th thy rng
trong dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight n
acid gymnemic  là thành phn chính gây h ng huyy chun hóa theo
t tác dc phân lp và tinh khiGymnemagenin có th c
s dng nhm chun hóa thành phn tác dng ca Gymnema latifolium Wall. ex
Wight.
Chun hóa theo Gt chuc s
dng ph bin nh  c to ra do quá trình thy phân acid
gymnemic toàn phu kin kim và acid [43], [54].
OR
1
OR
2
OH
H
H
OH
HO
H
GlcA-O

OH
OH
OH
H
H

OH
HO
H
HO


R
1

R
2

Acid gymnemic I
tigloyl
Ac
Acid gymnemic II
2-methyl butyroyl
Ac
Acid gymnemic III
2-methyl butyroyl
H
Acid gymnemic IV
tigloyl
H


Công thc phân t: C
30
H
50

O
Khng phân t: 506,71.


Hình 1.6 thy phân acid gymnemic to Gymnemagenin [29].
Da trên din tích hoc da trên  màu (khi phun thuc th hoc khi
soi UV) ca các vt xut hin trên bn mc bit là bn mng hi
Gymnemagenin
Acid gymnemic
Thy phân vi
kim và acid

16

nu có mu chung, có th ng mt cht (hay mt nhóm cht)
có trong mu thc ng dnh ng b
so sánh. Mt s dung dch chui chiu có n c pha sn.
Da vào mi liên h gia n cht chut và ding ca
ch  t ng chu
ng din tích pic ca cht cn phân tích trong mu th và ni suy n t ng
chung  trên [8].
u chun hóa Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. da vào chun Gymnemagenin b
ch chic lic chun b bm kit trong
c (1:1) trong khong 48h, cht chun Gymnemagenin (n 1
mg/ml), h chy sc ký chloroform : methanol (9:1). Kt qu c giá tr h s
 ca gymnemagenin R
f
= 0,ng chuc xây dng vng cht
chun gymnemagenin trong khong 4-10 µg, h s 99 cho thy

my gia n và din tích pic. Kt qu ng
   ng Gymnemagenin trong lá dây thìa canh Gymnema sylvestre
(Retz) R. Br. ex Schult chim 1,61% trng khô ca lá [42].
 6, Valivarthi S. R. và cng s cho r   a V.
Puratchimani và S. Jha cc ci thin thông qua vic thy phân bng acid và
base dch chit methanol ca Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. Kt qu
ca Valivarthi S. R. và cng s cho thy khi dch chic thy phân, pic sc ký
ca Gymnemagenin trong mu th nha khi kim tra li
bc ci thin này cho thy du
vt ca Gn thy Gymnemagenin trong
dch chic chun b c tin hành ca V. Puratchimani
[43].





17

 HIÊN CU
2.1. NGUYÊN VT LIU NGHIÊN CU
2.1.1. Mu nghiên cu
Các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) c thu
hái ti 5 tnh: Tây Ninh, Gia Lai, Hòa Bình, Thái Nguyên, Tuyên Quang c
nh tên khoa h    mu ti b môn Thc vt  Ti hc
c Hà Ni (Mã hiu tiêu bn HNIP/18068, 18090  18093/14).
Bng 2.1. V u trong nghiên cu.
STT
Mã
mu

u
Nghiên
cu
hình
thái
Mu
nghiên
cu
ADN
Nghiên
cu
hóa hc
1.
GL1

(11
o
106
o
)
X
X
X
2.
GL2
Quc l 
(13
o

o


X
X
X
3.
GL3
Thung Nai, Cao Phong, Hòa Bình
(20
o

o

X
X
X
4.
GL4

(21
o

o
)
X
X
X
5.
GL5
Yên Nguyên, Chiêm Hóa, Tuyên Quang
(22

o

o
)
X
X
X
2.1.2. Dung môi, hóa cht
2.1.2.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền
- ng.
- B kít chit tách ADN thc vt GeneJET  s lô 00209197 (Thermo
Scientific).
- B kít tinh sch ADN GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).
- B kít gii trình t ADN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits
(Applied Biosystems).
- Dung dm TAE 1X: ly t dung dch gc TAE 50X có thành ph
sau: tris base (Sigma): 121 g, acid acetic glacial (Sigma): 28,6 ml, EDTA (Sigma)
c kh ion v: 500 ml.