Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi trail để đánh giá trên một số dược liệu

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CAO THỊ TUẤT
TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC
TẾ BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH
GIÁ TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



CAO THỊ TUẤT

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC TẾ
BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH GIÁ
TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 60720408
Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng
TS. Nguyễn Thị Lập



HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Thị
Nguyệt Hằng, TS. Nguyễn Thị Lập đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị thuộc khoa Dược lý –
Sinh hóa – Viện Dược Liệu đã giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình làm
thực nghiệm tại khoa.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn
Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội đã ủng hộ tôi trong quá trình học tập
và làm đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè – những người luôn sát
cánh, động viên, khích lệ tôi cố gắng học tập, phấn đấu để hoàn thành luận văn
tốt nghiệp này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2014
Học viên: Cao Thị Tuất

MỤC LỤC


Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Đại cương về bệnh ung thư
3
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào 3
1.1.3. Cơ chế sinh bệnh ung thư 3
1.1.4. Nguyên nhân bệnh sinh 5

1.1.5. Triệu chứng lâm sàng 10
1.1.6. Các thuốc điều trị ung thư hiện nay 11
1.2. Apoptosis (Tế bào chết theo chương trình)
14
1.2.1. Quá trình apoptosis 14
1.2.2. Các con đường apoptosis 15
1.3. TRAIL và các thụ thể của TRAIL
17
1.3.1. Cấu trúc và tác dụng 18
1.3.2. Cơ chế tác dụng 19

1.4. Phương pháp MTT
21
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
23
2.2. Phương pháp nghiên cứu
23
2.2.1. Nghiên cứu triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian
bởi TRAIL
23
2.2.2. Nghiên cứu khả năng ức ché tế bào bằng mô hình thử nghiệm
độc tế bào trung gian bởi TRAIL
26
2.3. Xử lý số liệu:
28
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
29
3.1. Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi

TRAIL
29
3.1.1. Khảo sát nồng độ nuôi cấy 2 dòng tế bào ung thư vú (MDA–
MB–231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa)
29
3.1.2. Khảo sát nồng độ TRAIL đối với từng dòng tế bào 30
3.1.3. Tác dụng của thuốc chữa ung thư đối chứng Adriamycin khi kết
hợp và không kết hợp với TRAIL
31
3.2. Đánh giá tác d
ụng ức chế của 27 mẫu d
ư
ợc liệu tr
ên mô hình
thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL
32
3.2.1. Đánh giá tác d
ụng ức chế của 27 mẫu d
ư
ợc liệu tr
ên 2 dòng t
ế
bào ung thư vú (MDA- MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa)
32
3.2.2. Kh
ảo sát tính giá trị IC
50
38
Chương 4. BÀN LUẬN
42

4.1. Mô hình th
ử nghiệm độc tế b
ào trung gian b
ởi TRAIL

42
4.2. V
ề tác dụng ức chế tế b
ào c
ủa các mẫu d
ư
ợc liệu tr
ên 2 dòng t
ế
bào ung thư vú (MDA-MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa)
44
KẾT LUẬN
50
KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT
51
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TRAIL: Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand
TNF: Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử khối u)
FADD: Fas-associating protein with death domain (Fas-protein liên kết có miền
chết)
DD: Death domain (Miền chết)
DISC: Death-inducing signaling complex (phức hợp tín hiệu gây chết)
Apaf-1: Apoptotic protease-activating factor-1 (yếu tố hoạt hóa các enzyme ly
giải protein liên quan đến quá trình Apoptosis)
MMP: Mitochondrial membrane permeabilization (tính thấm hoá của màng ty
thể)
AIF: Apoptosis inducing factor (yếu tố gây ra apoptosis)

Bid: Bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein ( protein có BH3 ức chế
Bcl-2)
Bcl-2: B-cell lymphoma
Bcl- XL: B-cell lymphoma- extra large
OPG: Osteoprotegerin
SMAC/DIABLO: Second mitochondria-derived activator of caspase/direct
inhibitor of apoptosis binding protein with low pI (protein hoạt hóa caspase có
nguồn gốc tư ty thể / ức chế trực tiếp của protein liên quan quá trình apoptosis
với pI thấp)
XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis (chất ức chế liên kết với X của quá trình
apoptosis)
MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium
Adr: Adriamycin

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1: Khảo sát nồng độ nuôi cấy dòng tế bào ung thư vú (MDA-
MB-231)
29
Bảng 3.2: Khảo sát nồng độ nuôi cấy dòng tế bào ung thư tử cung (Hela) 29
Bảng 3.3: Tác dụng ức chế của TRAIL trên 2 dòng tế bào ung thư 30
Bảng 3.4: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên 2 dòng tế bào ung thư 31
Bảng 3.5: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên dòng tế bào ung thư vú
(MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-)
32
Bảng 3.6: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên dòng tế bào ung thư tử
cung (Hela) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-)
32
Bảng 3.7: Danh sách các mẫu thử tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thư
[2, 13, 34, 39]
33
Bảng 3.8: Tác dụng ức chế của các mẫu thử trên dòng tế bào ung thư vú
(MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-)
35
Bảng 3.9: Tác dụng ức chế của các mẫu thử trên dòng tế bào ung thư tử
cung (HeLa) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-)
37
Bảng 3.10: Nồng độ IC
50
của các mẫu dược liệu trên dòng tế bào ung thư
vú (MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-)

39
Bảng 3.11: Nồng độ IC
50
của các mẫu dược liệu trên dòng tế bào ung thư
tử cung (Hela) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-)
41


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1: Ti
ến tr
ình Apoptosis



15

Hình 1.2: S
ơ đ
ồ con đ
ư
ờng apoptosis nội sinh v
à ngo
ại sinh

16

Hình 1.3:

Các th
ụ thể của TRAIL

19

Hìn
h 1.4: Cơ ch
ế tác dụng của TRAIL

20

Hình 1.5: Ph
ản ứng chuyển MTT th
ành formazan

22

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh ung thư ngày càng có xu hướng gia tăng không chỉ ở các nước phát
triển mà ngay cả các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Theo Tổ chức
Y tế thế giới, hàng năm có trên 12 triệu trường hợp mắc mới ung thư [44]. Và tỷ
lệ mắc bệnh này đang có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên thế giới.
Theo thống kê năm 2008 cho thấy trên toàn cầu có khoảng 28 triệu người đang
sống chung với bệnh ung thư. Nếu không có các biện pháp can thiệp kịp thời thì
con số này sẽ lên tới 75 triệu vào năm 2030 [44]. Chỉ riêng ở Việt Nam năm
2000, tỷ lệ mắc chung của bệnh ung thư ở nam giới là 14/100.000 dân, ở nữ giới
là 101/100.000, thì đến năm 2010 tỷ lệ này ở nam giới tăng đến 181/100.000 dân
và ở nữ giới tăng đến 134/100.000 dân [5, 6].
Ở các nước phát triển ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai
sau bệnh tim mạch. Ở các nước đang phát triển ung thư đứng hàng thứ ba sau
bệnh nhiễm trùng/ ký sinh trùng và tim mạch. Theo thống kê của tổ chức Y tế
thế giới, hàng năm có khoảng trên 7,6 triệu người chết do ung thư. Tỷ lệ chết do
ung thư chiếm tới 13% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người. Theo dự
báo đến năm 2030, số người chết vì ung thư hàng năm khoảng 17 triệu người
[27]. Ở Việt Nam, theo báo cáo của Bộ Y tế tại hội nghị khoa học quốc tế về
phòng chống ung thư tổ chức ở Bệnh viện Bạch Mai ngày 11/4/2013, số ca tử
vong do ung thư hằng năm khoảng 82.000 trường hợp.

Trước sự nguy hiểm của ung thư, con người đã, đang và tiếp tục tìm cách
phòng và chữa trị. Có nhiều phương pháp để điều trị ung thư như phẫu thuật, vật
lý trị liệu (xạ trị), hóa trị liệu (dùng thuốc điều trị ung thư), tăng cường miễn
dịch, vaccine…,tuy nhiên hiệu quả chưa thực sự cao và gây ra nhiều tác dụng
phụ.
TRAIL là một thành viên của đại gia đình hoại tử khối u TNF gây chết tế bào
theo chương trình và giết tế bào ung thư một cách đặc hiệu nhưng có rất ít hoặc
không có tác dụng phụ trên phần lớn những tế bào thường [61, 62]. TRAIL hiện
2

đang được được sử dụng trong chiến lược điều trị ung thư [58]. TRAIL liên kết
với 2 receptor có chứa miền gây chết tế bào là TRAIL-R1 và TRAIL-R2 làm
chết tế bào theo chương trình [50]. Tuy nhiên, một số dòng tế bào ung thư, đặc
biệt là khối u ác tính lại có khả năng chống lại sự chết tế bào theo chương trình
gây bởi TRAIL, dẫn đến hạn chế trong việc sử dụng TRAIL trong liệu pháp điều
trị ung thư [48]. Việc dùng kết hợp TRAIL với phương pháp hóa trị liệu ung thư
hoặc xạ trị có tác dụng kích thích gây độc tế bào khối u một cách đặc hiệu, tuy
nhiên liệu pháp điều trị này dẫn đến độc không chỉ đối với những tế bào ác tính
mà còn diệt luôn cả tế bào lành [64]. Do đó, việc nghiên cứu để tìm ra những
chất an toàn, có hiệu quả để làm cho TRAIL có tác dụng điều trị ung thư đang
được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Chất có nguồn gốc tự
nhiên hoặc các dẫn xuất của nó chính là ứng cử viên tiềm năng trong liệu pháp
điều trị này.
Xuất phát từ tình hình này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Triển khai
mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL để đánh giá trên một
số dược liệu” với các mục tiêu sau:
1. Triển khai được mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL.
2. Đánh giá được tác dụng của 26 mẫu dược liệu trên mô hình này.

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.2. Đại cương về bệnh ung thư
1.1.1. Định nghĩa
Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách
vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách
phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa hơn của cơ thể
bằng cách đi vào máu hoặc hệ bạch huyết [5].
1.1.2. Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào:
Hiện nay các loại ung thư được các nhà khoa học phân chia theo nguồn gốc
phát sinh tế bào của chúng, gồm [1, 8, 30]:
● Carcinoma (nguồn gốc biểu bì): là dạng ung thư phổ biến nhất, xuất phát
từ những tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong và lá phôi ngoài. Đó là các loại
ung thư phổi, ung thư vú, ung thư trực tràng…
● Sarcoma: là dạng ung thư ít gặp hơn, xuất phát từ những tế bào có nguồn
gốc từ lá phôi giữa và là những tế bào thuộc vào hệ thống cơ, xương, sụn, mỡ,
mô liên kết.
● Lymphoma: là dạng ung thư tương đối hiếm gặp, xuất phát từ các hạch
bạch huyết và các mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể như ung thư
lymphoma Burkitt.
● Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm do biểu hiện bệnh rất sớm, ở cả trẻ
em và người lớn, xuất phát từ các tế bào máu non thuộc tủy xương và có xu
hướng tích tụ thành số lượng lớn trong hệ máu như ung thư bạch cầu cấp tính.
1.1. 3. Cơ chế sinh bệnh ung thư
1.1.3.1. Cơ chế gen
Các gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển ung thư bao gồm
sự phân chia tế bào, biệt hoá, tạo mạch máu, xâm lấn và chết tế bào. Quá trình
này liên quan chặt chẽ đến tổn thương hai nhóm gen: gen sinh ung thư oncogene

và gen kháng ung thư, cả hai loại gen này luôn tồn tại trong mọi tế bào bình
4

thường và đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản tế bào, sự
biệt hoá tế bào và quá trình chết theo chương trình của tế bào, đồng thời cả hai
gen này liên kết chặt chẽ trong quá trình sinh ung thư giúp cho sự ổn định sinh
học của cơ thể [5].
Gen sinh ung thư: hiện nay đã tìm ra được trên 50 loại oncogen có vai trò
tổng hợp ra protein đóng góp vào sinh ung thư. Các gen sinh ung thư có thể
thuộc nhóm các yếu tố tăng trưởng bị hoạt hoá bất thường (c-sis); các thụ thể
yếu tố tăng trưởng (HER2/neu và FMS); các phân tử dẫn truyền tín hiệu tế bào
(c-SRC, Ras và cFMS) hoặc là các yếu tố sao chép của nhân tế bào (c-myc). Bất
cứ đột biến hoạt hoá nào trong các gen trên đều có thể làm gia tăng dẫn truyền
tín hiệu làm cho tế bào đi vào chu kỳ không hợp lý và có liên quan đến sự sinh
ung thư [8].
Trái với các gen sinh ung thư, các gen kháng ung thư mã hoá cho những
protein kiểm soát phân bào theo hướng ức chế, làm chu kỳ phân bào bị dừng ở
một pha nào đó, thường ở pha G
1
, các gen kháng ung thư còn có chức năng làm
biệt hoá tế bào, hoặc mã hoá tế bào chết theo chương trình, khi các gen kháng
ung thư bị bất hoạt do đột biến sẽ làm biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính.
Cho đến nay người ta đã biết đến các gen ức chế u gồm APC, BRCA1, BRCA2,
NF1, NF2, WT1 và VHL, đặc biệt gen RB và p53 có ảnh hưởng đến chu kỳ tế
bào. Gen RB ức chế chu kỳ tế bào bằng cách gắn kết với E2F1 và ngăn cản các
gen này (gen cần cho tế bào vào pha S). Gen RB bị đột biến trong nhiều loại ung
thư, các gen khác có thể có đột biến ở các nơi khác nhau trong chu kỳ tế bào có
RB tham gia. Khi mất chức năng dẫn truyền tín hiệu tế bào của RB có thể làm
mất sự kiểm soát ngăn cản chu kỳ tế bào. Khi kết hợp với các đột biến khác gây
ra mất các tín hiệu gây chế tế bào, do đó làm gia tăng chuyển dạng tế bào ác

tính. Gen p53 ngăn cản chu kỳ tế bào bằng cách hoạt hoá sao chép ra CK1, P21
để ngăn cản sự hoạt hoá của CdK để nó không thể phospho hoá RB. Gen này
cũng làm cho tế bào dừng lại ở pha G1 và làm tế bào chết theo chương trình
5

(apoptosis). Khi đột biến gây bất hoạt gen p53 là nguyên nhân của hơn 50%
trường hợp ung thư [5, 7].
1.1.3.2. Cơ chế tế bào
Người trưởng thành bình thường trung bình có khoảng 1 triệu tỷ tế bào xuất
phát từ một trứng được thụ tinh. Số lượng tế bào mới trong cơ thể được tạo ra
bằng số lượng tế bào chết đi và luôn giữ ở mức hằng định. Khi ung thư, tế bào
sinh sản vô hạn độ ngoài sự kiểm soát của cơ thể đã phá vỡ mức hằng định (tế
bào sinh nhiều hơn tế bào chết).
Cơ chế của tăng sinh số lượng của các quần thế tế bào có thể do chu trình tế
bào được rút ngắn dẫn đến tăng số lượng tế bào được tạo ra trong một đơn vị
thời gian, hoặc do giảm vận tốc tế bào chết đi cũng đưa đến kết quả có nhiều tế
bào được tạo ra hơn. Một cơ chế khác là tế bào Go trở lại chu trình làm tăng
thêm số lượng tế bào trong một đơn vị thời gian [5].
Sự tăng sinh vô hạn độ của tế bào ung thư còn liên quan đến cơ chế mất sự
ức chế tiếp xúc: tế bào bình thường khi đang ở quá trình phân chia, nếu tiếp xúc
với tế bào bình thường khác cũng đang phân bào thì quá trình phân bào chấm
dứt. Trong ung thư cơ chế này không còn [5].
1.1.3.2. Cơ chế khác
Các yếu tố vi môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sống còn của tế bào ung
thư. Các biến đổi đường dẫn truyền tín hiệu gây chết tế bào, đột biến các tín hiệu
duy trì sự sống thay đổi các yếu tố tăng trưởng hay tác động của cytokin làm
thuận lợi cho khối u phát triển [5].
Sinh ung thư còn liên quan tới cơ chế suy giảm miễn dịch: ung thư hay gặp
ở bệnh nhân nhiễm HIV hoặc những người dùng thuốc ức chế miễn dịch.
1.1.4. Nguyên nhân bệnh sinh

1.1.4.1. Tác nhân vật lý
● Bức xạ ion hoá
6

Bức xạ ion hoá chính là nguồn tia phóng xạ phát ra từ các chất phóng xạ tự
nhiên hoặc từ nguồn phóng xạ nhân tạo dược dùng trong khoa học và y học có
khả năng ion hoá vật chất khi bị chiếu xạ. Người ta biết rằng có nhiều cơ quan
xuất hiện ung thư sau khi bị chiếu xạ nhưng loại nguyên nhân này chỉ chiếm 2
đến 3% trong số các trường hợp ung thư, chủ yếu là ung thư tuyến giáp, ung thư
phổi và ung thư bạch cầu [6, 44].
● Bức xạ cực tím
Tia cực tím có trong ánh sáng mặt trời. Càng gần xích đạo tia cực tím càng
mạnh. Tác nhân này chủ yếu gây ra ung thư ở da. Những người làm việc ngoài
trời như nông dân và thợ xây dựng, công nhân làm đường có tỷ lệ ung thư tế bào
dày và tế bào vảy ở vùng da hở (đầu, cổ, gáy) cao hơn người làm việc trong nhà.
Đối với những người da trắng sống ở vùng nhiệt đới, tỷ lệ ung thư hắc tố cao
hơn hẳn người da màu do ảnh hưởng của tia cực tím khi tắm nắng.
1.1.4.2. Thuốc lá
Thuốc lá là nguyên nhân của khoảng 90% ung thư phế quản phổi [6]. Tính
chung thuốc lá gây ra khoảng 30% trong số các trường hợp ung thư chủ yếu là
ung thư phế quản phổi và một số ung thư vùng mũi họng, ung thư tụy, ung thư
đường tiết niệu. Trong khói thuốc lá chứa rất nhiều chất hydrocarbon thơm.
Trong đó, phải kể đến chất 3-4 Benzopyren là chất gây ung thư trên thực
nghiệm.
Qua thống kê cho thấy người hút thuốc lá có nguy cơ mắc ung thư phế
quản gấp 10 lần người không hút. Hút thuốc ở tuổi càng trẻ càng có nguy cơ
cao.
Những người không hút thuốc mà sống trong một khoảng không gian hẹp
với người hút thuốc, khói thuốc cũng có nguy cơ gây ung thư. Đây được gọi là
hút thuốc thụ động. Điều lưu ý đặc biệt là trẻ em nhiễm khói thuốc lá rất nguy

hại.
1.1.4.3. Dinh dưỡng
7

Dinh dưỡng đóng vai trò khoảng 35% trong các nguyên nhân gây bệnh ung
thư [3]. Nhiều bệnh ưng thư có liên quan đến dinh dưỡng như ung thư thực
quản, ung thư dạ dày, ung thư gan, ưng thư đại trực tràng, ưng thư vòm mũi
họng, ưng thư vú, ưng thư nội tiết
- Các chất gây ung thư chứa trong thực phẩm, thức ăn:
+ Nitrosamin và các hợp chất N- Nitroso khác, là những chất gây ung thư
thực nghiệm trên động vật. Các chất này thường liên quan đến ung thư dạ dày và
ung thư vòm họng.
+ Anatoxin sinh ra từ nấm mốc Aspergillus flavus. Đây là một chất gây ra
bệnh ung thư gan, bệnh phổ biến ở các nước nhiệt đới. Loại nấm mốc này
thường có trong ngũ cốc bị mốc nhất là lạc mốc.
+ Các thực phẩm có chứa các dư lượng, tàn tích của các thuốc trừ sâu,
không chỉ có thể gây ra ngộ độc cấp tính mà còn có khả năng gây ung thư.
+ Một số cách nấu thức ăn và bảo quản thực phẩm có thể sẽ tạo ra chất gây
ung thư như benzopyren và một số sản phẩm gây đột biến gen…
1.1.4.4. Những yếu tố nghề nghiệp
Khi làm việc trong môi trường nghề nghiệp con người tiếp xúc với cả bức
xạ ion hoá và virus, nhưng những tác nhân sinh ung thư quan trọng nhất trong
nghề nghiệp chính là các hoá chất dược sử dụng. Ước tính nhóm nguyên nhân
này gây ra khoảng từ 2 đến 8% số ung thư tùy theo mỗi khu vực công nghiệp
[6]. Ngày nay do công nghiệp hoá phát triển mạnh mẽ, ưng thư nghề nghiệp
không chỉ có ở các nước đã phát triển mà còn ở các nước đang phát triển.
1.1.4.5. Một số thuốc và nội tiết
Người ta thấy các kiểu hoá trị ung thư khác nhau, rõ ràng đã làm tăng nguy
cơ bệnh bạch cầu ở những bệnh nhân còn sống hơn một năm sau khi được chẩn
đoán.

8

Các hóa chất có hoạt tính sinh ung thư theo trung tâm nghiên cứu ung thư
quốc tế bao gồm: Busulphan, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan,
Treosulphan…
Sự ức chế miễn dịch sau khi cấy ghép cơ quan, cũng làm bệnh nhân có
nguy cơ cao mắc bệnh ung thư. Tuy nhiên, vai trò sinh ung thư của các thuốc
dùng để ức chế miễn dịch vẫn còn đang bàn cãi.
Một số loại nội tiết tố được dùng trong các lĩnh vực thực hành y khoa khác
nhau. Người ta thấy một số nhóm nội tiết tố làm tăng nguy cơ ung thư sau khi
dùng chúng. Dùng các thuốc ngừa thai có nguy cơ bị ung thư vú, ung thư buồng
trứng. Tuy nhiên điều này cần phải nghiên cứu thêm.
1.1.4.6. Các tác nhân sinh học
● Virus sinh ung thư
Có bốn loại virus liên quan đến cơ chế sinh bệnh ung thư [1, 8],
Virus Epstein – Barr người ta thấy xuất hiện ở trong các khối ung thư vòm
mũi họng. Ở nhiều bệnh nhân ung thư vòm còn thấy kháng thể chống lại kháng
nguyên của virus Epstein - Barr. Tuy nhiên. người ta chưa khẳng định vai trò
gây bệnh trực tiếp của virus Epstein - Barr đối với ung thư vòm mũi họng.
Virus Viêm gan B gây ung thư gan nguyên phát hay gặp ở châu Phi và
châu Á trong đó có Việt Nam. Virus này khi thâm nhập cơ thể gây viêm gan
cấp, kể cả nhiều trường hợp thoáng qua. Tiếp theo là một thời kỳ dài viêm gan
mạn tiến triển không có triệu chứng. Tổn thương này qua một thời gian dài sẽ
dẫn đến hai biến chứng quan trọng đó là xơ gan toàn bộ và ung thư tế bào gan.
Virus gây u nhú thường truyền qua đường sinh dục. Loại này được coi là có
liên quan đến các ung thư vùng âm hộ, âm đạo và cổ tử cung, các nghiên cứu
đang tiếp tục.
Virus HTLV 1 là loại virus (retro virus) liên quan đến bệnh bạch cầu tế bào
T gặp ở Nhật Bản và vùng Caribe.
● Ký sinh trùng và vi khuẩn có liên quan đến ung thư

9

Có một loại ký sinh trùng được coi là nguyên nhân gây ung thư, đó là sán
Schistosoma. Loại sán này thường có mặt trong ung thư bàng quang và một số ít
ung thư niệu quản. Tuy nhiên cơ chế sinh ung thư của loại sán này chưa được
giải thích rõ.
Vi khuẩn Helicobacter – Pylori là một trong các nguyên nhân gây viêm dạ
dày mạn tính và ung thư dạ dày.
1.1.4.7. Yếu tố di truyền và suy giảm miễn dịch
● Yếu tố di truyền
Nguyên nhân của khoảng 33% ung thư trên người ngày nay đã được biết và
các yếu tố môi trường được cho là giữ vai trò quan trọng ở phần lớn bệnh ung
thư [44]. Tuy nhiên di truyền cũng là một yếu tố quan trọng liên quan đến ung
thư.
Một số ung thư liên quan đến di truyền như: ung thư phổi (ung thư sinh ra
từ môi trường quan trọng nhất cho tới thời điểm hiện tại), có một vài nghiên cứu
về men hydrocarbon-hydroxylase, một enzym cần cho sự chuyển hoá
hydrocarbon từ khói thuốc, gợi ý rằng sự hiện hữu của loại men này trong phổi
con người, về mặt di truyền có thể kiểm soát bởi một gen đơn với cặp allen cao
(H) và thấp (L). So với những người mang LL, những người HH có nguy cơ bị
ung thư phổi gấp 36 lần. Hay u Wills, u nguyên bào võng mạc hai mắt và những
bệnh nhân mang chứng đa polyp có tính chất gia đình là thí dụ về các loại ung
thư truyền theo tính trội theo mô hình của Mendel…
Người ta có thể định vị gen trong bệnh đa polyp mang tính gia đình ở
nhiễm sắc thể số 5, trong bệnh Von Reclmghausen ở nhiễm sắc thể số 17…
● Suy giảm miễn dịch và AIDS
Trên động vật thực nghiệm sự gia tăng về mối nguy cơ bị ung thư đi đôi
với sự suy giảm miễn dịch. Người bị suy giảm miễn dịch mang tính di truyền
hay mắc phải thường dễ bị ung thư và thời gian ủ bệnh ngắn hơn, chủ yếu là
bệnh lymphoma hệ võng.

10

Ở những bệnh nhân ghép cơ quan cho thấy sự suy giảm miễn dịch do thuốc
là rõ nhất. Và những người này có nguy cơ mắc bệnh lympho không Hodgkin
tăng 32 lần, ung thư gan và đường mật trong gan tăng 30 lần, ung thư phổi tăng
hai lần, ung thư bàng quang hơn năm lần, ung thư cổ tử cung gần năm lần…
Người có HIV dương tính có nguy cơ cao bị sarcoma Kaposi và lympho
không Hodgkin, ung thư hậu môn, ung thư gan và ung thư cổ tử cung… Điều
này cần được làm rõ thêm.
1.1.5. Triệu chứng lâm sàng
Thông thường ung thư có thời gian ủ bệnh khá dài, ban đầu không có triệu
chứng lâm sàng rõ ràng và khi xuất hiện triệu chứng rõ rệt thường là khi bệnh đã
tiến triển trầm trọng.
Ung thư là tập hợp của nhiều dạng bệnh ung thư khác nhau nên triệu chứng
của ung thư rất đa dạng và khác nhau ở tùy thể bệnh ung thư [4].
Triệu chứng của ung thư được phân làm ba nhóm chính:
- Triệu chứng tại chỗ
- Triệu chứng của di căn
- Triệu chứng toàn thân
Triệu chứng tại chỗ: các khối u bất thường hay phù nề, chảy máu, đau
hoặc loét. Chèn ép vào mô xung quanh có thể gây ra các triệu chứng như vàng
da.
Triệu chứng của di căn (lan tràn): hạch bạch huyết lớn lên, ho, ho ra máu,
gan to, đau xương, gãy xương ở những xương bị tổn thương và các triệu chứng
thần kinh. Đau có thể gặp ở ung thư giai đoạn tiến triển, nhưng thông thường đó
không phải là triệu
Triệu chứng toàn thân: sụt cân, chán ăn và suy mòn, tiết nhiều mồ hôi (đổ
mồ hôi trộm), thiếu máu và các hội chứng cận u đặc hiệu, đó là tình trạng đặc
biệt được gây ra bởi ung thư đang hoạt động, chẳng hạn như huyết khối hay thay
đổi nội tiết tố.

11

1.1.6. Các thuốc điều trị ung thư hiện nay
Có 7 nhóm thuốc chính được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư [57]: các
thuốc alkyl hóa, các kháng sinh chống ung thư, các thuốc kháng chuyển hóa, các
alkaloid và các chất có nguồn gốc tự nhiên, các phức hợp platin hữu cơ, các
hormone, và nhóm thuốc sinh học.
- Nhóm thuốc alkyl hóa: Melphalan, chlorambucil, Isophosphamid,
Busulphan, Carmustin…
- Nhóm kháng sinh chống ung thư: Doxorubicin, Daunorubicin,
Dactinomycin, Bleomycin…
- Nhóm thuốc kháng chuyển hóa: Methotrexat, 6-Mercaptopurin,
Gemcitabin, 5-Fluorouracil…
- Các alkaloid và các chất có nguồn gốc tự nhiên: Vinblastin sulfat,
Vincristin sulphat, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan…
- Các phức hợp platin hữu cơ: Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin…
- Các hormone và kháng hormone: estrogen, androgen, các progesterone…
- Nhóm thuốc sinh học: Các Interferon alpha (INF-), Interferon gama,
Interleukin-2 (IL-2), Yếu tố hoại tử u (TNF) (TNF- và TNF-, TRAIL…),
Erythropoietin, các kháng thể đơn dòng như: Bevacizumab, Trastuzumab,
Rituximab…
Ở đây chúng tôi trình bày về một số thuốc điển hình.
● Melphalan:
Đây là một thuốc tác nhân alkyl hóa kiểu azotiperid. Thuốc gây độc tế bào
ung thư bằng cách tác dụng trên DNA với phản ứng thay thế một nguyên tử H
của acid nucleic bằng nhóm alkyl dẫn đến các thông tin mã hoá trên DNA bị
thay đổi dẫn đến ức chế sự sao mã hoặc sao mã không chính xác gây đột biến
hoặc làm chết tế bào. Melphalan được sử dụng trong điều trị u đa tủy, u tinh
hoàn, u buồng trứng, ung thư vú….Hạn chế của thuốc là độc tính cao trên hệ
máu, là thuốc độc bảng A.

12

● Doxorubicin:
Là một thuốc thuộc nhóm kháng sinh chống ung thư, cơ chế tác dụng của
thuốc: ức chế enzyme topoisomerase, tăng tạo các gốc tự do, gắn vào màng tế
bào ức chế hoạt hóa phosphatidyl inositol. Thuốc được dùng trong điều trị bệnh
bạch cầu cấp tính, bạch cầu tủy mạn, bệnh Hodgkin, sarcom lưới, sarcom
lympho…
● Methotrexat:
Đây là thuốc kháng chuyển hóa, Methotrexat ức chế cạnh tranh với enzyme
dihydrofolat reductase làm giảm acid tetrahydrofolic, làm giảm tổng hợp
thymidilat, methionin, serin, purin dẫn đến giảm sinh tổng hợp DNA và protein
làm cho tế bào không nhân lên được. Thuốc được dùng điều trị bệnh bạch cầu
lympho cấp, ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư tinh hoàn, carcinoma
biểu mô đường hô hấp…Tuy nhiên thuốc gây độc mạnh, gây suy tủy, độc thân,
dễ kháng thuốc.
● Vinblastin sulphat:
Là alkaloid được chiết xuất từ cây dừa cạn. Thuốc có tác dụng kìm tế bào,
ức chế đặc hiệu pha M của chu kỳ tế bào. Vinblastin gắn đặc hiệu vào tubulin
nên ngăn cản tạo vi cấu trúc hình ống, ức chế sự tách đôi của nhiễm sắc thể. Ở
liều thấp thuốc làm ngừng phân chia tế bào, liều cao diệt tế bào. Vinblastin điều
trị bệnh Hodgkin, bệnh sarcom lympho, sarcom lưới, u tủy mạn tính…Hạn chế
của thuốc là tác dụng phụ gây độc thần kinh như co giật, giảm hoặc mất trương
lực cơ, mất phản xạ sâu…
● Cisplatin:
Thuốc gây độc tế bào ung thư theo cơ chế giống thuốc nhóm alkyl hóa.
Cisplatin ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA dẫn đến tế bào không nhân lên
được hoặc làm chết tế bào. Thuốc được dùng trong điều trị u tinh hoàn, buồng
trứng, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư dạ dày….Tuy nhiên thuốc
gây độc tính thận, thính giác, ức chế tủy xương…

13

● Interferon alpha (INF-):
Tác dụng điều biến miễn dịch của INF- bao gồm hoạt hoá tế bào diệt tự
nhiên, điều biến sự sản xuất kháng thể của lympho B và tạo trên bề mặt tế bào
các kháng nguyên phù hợp tổ chức (MHC) làm cho khối u nhạy cảm hơn với
việc tiêu diệt qua miễn dịch trung gian. Tuy vậy, các tác dụng chống u chính của
INF- có thể liên quan tới tác dụng trực tiếp chống tăng sinh.
INF- có tác dụng tốt trong bệnh bạch cầu tế bào tóc và trong giai đoạn
sớm của bệnh bạch cầu tuỷ mạn. Thuốc cũng có hoạt tính cao ở u lympho ác
tính không Hodgkin độ ác tính thấp, đa u tuỷ xương và u lympho tế bào T ở da.
Ngoài ung thư hắc tố và ung thư biểu mô tế bào thận, một số ung thư biểu mô tế
bào vẩy và tế bào đáy của da cũng đáp ứng với INF-. Các chỉ định khác của INF-
bao gồm nhiễm trùng mãn với viêm gan C, Condylom mào gà và carcinomatosis
thanh quản ở tuổi thiếu niên.
Tuy hiện nay có nhiều thuốc điều trị ung thư nhưng hầu như các thuốc này
có tác dụng gây độc tế bào không đặc hiệu, thuốc có nhiều tác dụng phụ không
mong muốn và vẫn chưa đạt được hiệu quả cao. Do đó việc nghiên cứu tìm ra
các chất mới có khả năng điều trị căn bệnh ung thư, cũng như ngăn cản sự phát
triển của các tế bào ung thư, đặc biệt các hoạt chất có nguồn gốc dược liệu luôn
được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm. Đến nay, đã có nhiều
hoạt chất chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên đã được khám phá ra và đem vào
sử dụng trên lâm sàng. Các hoạt chất điển hình là paclitaxel (taxol), vinblastin
và vincristin, camptothecin, adriamycin…Ngoài ra đã có nhiều hoạt chất được
tách chiết từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư cũng như ngăn
chặn sự phát triển của khối u được tìm thấy như: đu đủ (Carica papaya L.) thuộc
họ đu đủ (Papayaceae) [43], gấc (Momordica cochinchinensis Streng) thuộc họ
bầu bí (Cucurbitaceae) [5], trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ
thủy tiên (Amaryllidaceae) [10].
14

Với mong muốn tìm kiếm thêm các ứng viên tiềm năng có triển vọng phát
triển thành thuốc điều trị ung thư từ dược liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để
triển khai mô hình sàng lọc này.
1.2. Apoptosis (Tế bào chết theo chương trình)
1.2.1. Quá trình apoptosis
Bên cạnh sự hoại tử và sự tự thực, apoptosis là quá trình thứ ba quyết định
cái chết của tế bào. Apoptosis xảy ra ở tất cả các động vật đa bào. Đây là quá
trình quan trọng đối với cuộc sống con người.
Apoptosis là không chỉ là một quá trình hoạt động theo thứ tự, mà nó còn là
một quá trình yên lặng bằng cách tháo dỡ các tế bào nhưng không lan truyền bừa
bãi đến các tế bào xung quanh. Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một
sự khởi phát làm thủng các tế bào và sau đó phá vỡ những mối liên hệ tế bào-tế
bào. Các tế bào co tròn lại vào màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều
hơn trong tế bào chất, sau đó chúng sẽ tối hơn [53].
Đáng chú ý là ở thời kì muộn của quá trình, các bào quan vẫn còn nguyên
vẹn và bình thường cho thấy hoạt động chuyển hóa vẫn còn quan trọng đối với
tế bào trong thời gian đầu. Các thành phần tế bào chất không bị rò rỉ khỏi tế bào,
vì vậy, đáp ứng viêm không được tạo ra. Trong nhân, chất nhiễm sắc cô đặc tối
đa và thường tạo ra các phần hình lưỡi liềm bao quanh màng nhân hoặc
pycnosis. Các endonuclease tách một cách chính xác DNA giữa các nucleosome,
cho ra những mảnh vỡ của 180 (hay nhiều hơn) đôi base. Những mạng lưới nội
bào khác như Golgi, lưới nội chất và ty thể cũng bị phân mảnh đáng kể. Trong
khi quá trình phân cắt DNA tiếp tục, nhân bắt đầu vỡ thành từng mảnh và tế bào
tương tự cũng chia tách thành một số mảnh nhỏ còn nguyên vẹn hoặc các thể
apoptosis không bắt màu thuốc nhuộm. Sau đó xảy ra sự thực bào, một quá trình
trong đó các đại thực bào di cư hay các tế bào biểu mô khoẻ mạnh xung quanh
nuốt các mảnh vỡ của tế bào. Kết quả là, các thể apoptosis gắn vào một túi được
bao bọc bởi màng trong một tế bào gọi là thể thực bào. Cuối cùng, tế bào chủ
15

hay thể thực bào và chất chứa của nó dần dần bị suy thoái, và trong nhiều trường
hợp, một tế bào mới thay thế tế bào cũ trong một vài giờ [53, 55].

Hình 1.1: Tiến trình Apoptosis
1.2.2. Các con đường apoptosis
1.2.2.1. Con đường ngoại sinh
Con đường ngoại sinh được khởi động bởi các kích thích ngoại bào, chẳng
hạn như phóng thích các yếu tố tăng trưởng kích động sự gắn của các thụ thể
chết xuyên màng (một tập hợp con họ thụ thể TNF, bao gồm cả TNFR1,
Fas/CD95, thụ thể TRAIL-R1 và TRAIL-R2) với các ligand cùng nguồn gốc
với chúng. Điều này làm hoạt hoá trực tiếp các thụ thể này thông qua quá trình
trimer hóa và một phức hợp tín hiệu gây chết (DISC) lớn ở mặt tế bào chất của
màng bào tương. Quá trình apoptosis được bắt đầu bằng việc lắp phức hợp tín
hiệu gây chết với Fas-protein liên kết có miền chết (FADD). Miền chết (DD)
Apoptosis
Tế bào chết theo chương trình

Tế bào bình
thường
Tế bào co lại, chất nhiễm sắc cô
đặc

Màng tế bào phồng xẹp
b
ất th
ư
ờng

Nhân xẹp lại,

màng tế bào tiếp
tục phồng xẹp

Hình thành các thể
apoptosis

Ly giải các
thể
apoptosis