Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 166 28



TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




ĐẶNG THỊ HẰNG




NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 166.28



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014



TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







ĐẶNG THỊ HẰNG



NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 166.28



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CH 








PGS. TS Cao Văn Thu






HÀ NỘI 2014



LỜI CẢM ƠN
, tôi xin bàPGS. TS Cao Văn Thu,
 

- Sinh h
  
Nam.
,



trong 


thâ


Hà Nội, ngày 5 tháng 8 năm 2014
Học viên
Đặng Thị Hằng












Mục lục
 1
 2
 2
1.1.1.  2
 2
1.1.3 2
Streptomyces 3
 3
1.2.2.  3
 4
Streptomyces  4

 5
1. 5
 5
1.4. Chit tách và tinh ch kháng sinh t dch lên men 6
1.4.1. M 6
 6
nh cu trúc hóa hc ca cht kháng sinh 6
1.5.1. Ph t ngoi  kh kin 6
1.5.2. Ph hng ngoi (IR) 6
1.5.3. Ph khi (MS) 7
1.5.4. Ph cng t ht nhân (NMR) 8
1.6Streptomyces 166.28 9
 9
1.6 9
1.7. Streptomyces 166.28 9
1.7.1.  9
1.7.2.  9
1.7.3.  9



1.8. Streptomyces 10
Streptomyces viridifaciens
VlmI 10
1.8.2.  Streptomyces sp.
IMV-70 11
1.8.3.  
Streptomyces fradiae PTZ0025 12
1.8.4. Các pyramidacin A  D, 3-Hydroxyquinoline-2-carboxamide và các
Streptomyces sp. DGC1 13

           Streptomyces
orientalis 16
 18
 18
 18
 20
2.2.  20
 20
 21
 22
 22
 23
 24
 24
 25
 26
2.2.10.   26
 28
 28
3.1.1. Sàng  28
 29



 31
 33
 34
 37
 37
 38

 40
 41
 44
 46
 46
 46
3.5.3.  46
 47
 47
 51
 51
 52
4.3.  53
 56
 56
 56











DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid DeoxyrubiNucleic

B. cereus Bacillus cereus
CW Cell wall
ESI MS Electrospray ionization mass
S. flexneri Shighella flexneri
HTKS 
MT g
MTdt 
MIC Minimum inhibitory concentration
NMR Nuclear Magnetic Resonance
VSV 
SLNN 
 
G(+) 
G(-) Gram âm












DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
STT

Trang

1
Streptomyces 
5
2
- A
8
3
 C (2
 4)
10
4
- hy-
droxyquinoline-2-carboxamide
11
5

13
6

13
7
1
14
8

14
9
LNN
22
10


23
11

23
12

26
13


34
14


34
15


36
16

36
17

37
18

S. flexneri)
37

19
 3.11        

38
20

39




21
            
sinh L1
40
22

(: B.cereus)
41
23


42
24


43
25

(: B.cereus)

44
26
8: D kin ph NMR v khung phenoxazone ca acti-
nomycin D (1) và kháng sinh 2 (2)
48
27

52


















DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT
Tên hình
Trang

1
Hình 1 
3
2
 7
9
3

47




1


ĐẶT VẤN ĐỀ

  gió mùa 
 

 

 moxycillin và 100 
 .
, 
  kháng

 
   

            các kháng sinh có
Streptomyces[13, 16].
b 
            Streptomyces 166.28.
 Streptomyces
166.28 và th 

  Nghiên cứu nâng
cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 166.28 ba 
sau:
1. kháng sinh .
2. kháng sinh.
3. hóa .



2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. 
1.1.1. 
Kháng sinh là 
 
[3, 5, 6, 10].
1.1.2. 
       
khá  xác hay các

ên cá]. 

- .
- .
- AND.
- .
- .
- 
1.1.3. 

  [8].


- Trong : + 

          
: aureomycin, [23, 25].


3


- : 
 
 [24].
- Bacillus subtilis 
nisin (do Streptococcus lactis clortetracyclin hay CTC
do Actinomyces aureopaciens to ra),12, 13].
1.2. Streptomyces
1.2.1. 
Streptomyces 
.

-   20
 DAP và glycin).
-  , có


- 
 
[3, 5].
1.2.2. 
- Streptomyces là 
.
- Streptomyces 



  
.


4


d


hình thái 
Streptomyces
 
t 5].


Streptomyces 

nitrit.
Streptomyces là 25  300C, p 7,5
[3, 5].
1.2.4. Streptomyces 
Streptomyces 
 
       Streptomyces [22, 27  
Streptomyces  [3].
Streptomyces  
kháng sinh


Actinomycin
S. antibioticus

Adriamycin
S. peuceticus

Kanamycin
S. kanamyceticus
Gr(-)
Acid clavulanic
S. clavuligerus
Gr(+)
Amphotericin B
S. nodosus

Cloramphenicol

S. venezuelae
Gr(+)
Nystatin
S. noursei




5


1.3. 


, 


1.3.2.1. Sàng lc ngu nhiên
Các vi sinh vt có s bin d t nhiên theo tn s khác nhau trong ng ging
thun khi có hot tính kháng sinh mnh gp 1,2 - 1,3 ln
nhng cá th n phi chn ly cá th có hot tính cao nh nghiên
cu tip [3, 5, 6, 14].
t bin nhân to
t bin nhân to:
- Tác nhân hóa hc: acid nitro, dimethylsulphat, nitrosoguanidin
- Tác nhân v
c s dng nht.
- Tác nhân sinh hc: tác nhân sinh hc gen nhy.
Các tác nhân vt lý và hóa hc vi ling và thi gian thích hp s git
cht hu ht các vi sinh vt. Các cá th sng sót s có s bii  nhim sc th,

  i các tính trng d n hoc là mt (hay gim) kh  ng hp
kháng sinh (gt bin âm tính), ho ng hp kháng sinh
(gt bi
Nhm to ra các chng có kh ng hp kháng sinh cao, cn phi
tin hành ci to ging bc thang, kt hn phân t (ví d:
k thut to và dung hp t bào trc ng
dng rng rãi [3, 5, 6, 14].


6


1.4. Chit tách và tinh ch kháng sinh t dch lên men
1.4.1. M
Kháng sinh là sn phi cht th cp, kt thúc quá trình lên men kháng sinh
có th nm trong sinh khi hay nm trong dch lm ca loài. Do
n phi tách và tinh ch kháng sinh b thu
c kháng sinh tinh khit.

c s dng:
- Lc.
- Ly tâm.
- Chit bng dung môi h
- Sc ký sau:
+ Sc ký lp mng.
+ Sc ký ct.
nh cu trúc hóa hc ca cht kháng sinh
Trong nghiên cu cng s d
ph, quan trng nht là ph hng ngoi, ph khi và ph cng t ht nhân.
1.5.1. Ph t ngoi  kh kin

Da trên s hp th ng các bc x ánh sáng vùng UV-VIS bi các
phân t ca cht nghiên ci mn t (E
0


E1, E2).
Gia cu trúc hóa hc và quang ph hp th có mi quan h cht ch, ch có nhng
phân t n t d b kích thích mi hp th  chuyn
t trn lên trng thái b 
d t N, S, O [1, 18, 26].
1.5.2. Ph hng ngoi (IR)
Quang ph hng ngo hp th phân t. Phân
t hp th ng ca bc x hng ngoi b    
hng ngoi còn gi là ph ng bc x hng ngo ln


7


 i trn t hay gây nên s ion hóa hay s 
 m gây nên s phân hy quang hóa.
Vùng bc x hng ngoi s dng trong các máy quang ph ng là t
400  4000 cm
-1
.
Trong ph hng ngong dùng s sóng ng
phân t, khi nhóm nguyên t p th i trng thái dao
ng thì to nên mt di hp th trên ph y, có s a nhóm
nguyên t và di hp th. Da vào s có mt ca di hp th, có th nhn bit v
mt nhóm chu nhóm chc có di hp th 

ca vic phân tích cu trúc bng ph IR.
Bi vy, mt trong các ng dng ca ph  nghiên cu
nhóm chc ca kháng sinh [1, 18, 26].
1.5.3. Ph khi (MS)
  kh  háp nghiên cu các cht b 
chính xác khng phân t cht nghiên cc chuyn thành trng
  dng khí này va chm vi mt
n t ng trung bình s b mn t và tr thành
n tích +1 (chim t l li là ion gc hay ion phân t.
Nu các ion gc tip tc va chm vn t ng ln
 b phá v thành nhiu mnh ion, các gc hay các phân t trung hòa
n ra s ion hóa và s phân mnh. Các ion có khng
n tích e. T l c gi là s khi.
Khi tách ion có s khc xác sut có mt, v 
th biu din mi liên quan xác sut có m I) và s khi z, ta thu
c ph khng. Giá tr R (g phân ging ca
ph khi k. Máy có R = 10.000 tr  phân gii cao. Máy hii có
R = 100.000 [1, 18, 26].


8


1.5.4. Ph cng t ht nhân (NMR)
     ng trong hóa hc h   t trong t
ng nhng nhân t tính thì xy ra s hp th chn ln t, phát sinh
hing cng t ht nhân. Các phân t hp cht ht trong t
i thì các mc phân chia, chúng  trng thái cân
bng. S khác nhau  các mng gn nhau ph thuc vào tính cht
c t ng H. Khi cung cp mng t ngoài vào thì

trng thái cân bng b phá v, các ht nhân nm  mng thp s hp
th ng chuyn lên mng thi gian ngn,
mt s ht nhân  m  ng cao li bc x ng xung m 
ng thp to ra mt cân bng mi. Khong cách thi gian trên gi là thi
gian phc hi spin  spin.
S phát sinh các tín hiu NMR xy ra do s ph thu tín hiu theo
t ng H hay tn s       


                




tác spin  spin.
 dch chuyn hóa hc  cho bit v trí ca tín hiu c dch
chuyn hóa hc ca ph cng ht nhân (
1
HNMR) t n 12ppm.
 spin cho bit s ng H  nguyên t C bên cnh và mi 
quan lp th ca các nguyên t H vi ta quan tâm t bi
ca tín hiu cng, t l  ca các vch tín hiu và hng s 
spin-spin.


9


Dii tín hiu cho bit s i ca proton cho tín hiu.
Nu ht nhân cho tín hiu cng là

13
C thì ta có ph cng t
13
C NMR.
 dch chuyn hóa hc  ca ph cng t ht nhân
13
C NMR t n 230
ppm [1, 18, 19, 20, 26].
1.6.  Streptomyces 166.28
1.6.1. M
 (MT) lên
  
S. flexneri và B. cereus 
theo [11].
1.6.2.  lên men chìm
  lên men chìm
 
p [11].
1.7. Streptomyces 166.28
1.7.1. 


ánh 
1.7.2. C

Ngoài ra 
.
1.7.3. 
              
       


1
H-NMR,
13
C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC).


10


1.8. Streptomyces
1.8.1.        Streptomyces viridifaciens  
lmI
 
  VlmI - 
kháng sinh        Streptomyces viridifaciens.

Streptomyces



bày trong nghiên cVlmI 
   Streptomyces viridifaciens       
SARP.  các gen sinh
            
vlmJKVlmI i-
mycin, quVlmI . Phân
VlmR và VlmA  VlmI 
 VlmK   
vlmI. Các

vùng VlmA-VlmH và VlmI-VlmJ 
  VlmI 
loài Escherichia coli      c-     
vùng 
heptamer [28].


11


1.8.2. NghStreptomyces sp.
IMV-70
  
 
Streptomyces sp. IMV-70.


Streptomyces sp. IMV-70 
 
 RSA và MRCNS        khác nhau.
MIC) 
0,025 .
 
. T
  kháng sinh 70-
A.
- A


UV (EtOH), λ

max,
nm (E
1%
1 cm)
300 (84)
UV (H
2
O), λ
max,
nm (E
1%
1 cm)
340 (80)
 
-100 C-18, 5 

17,85

95%
-TOF m/z
879 (M+H)
+
,
901 (M+Na)
+
,
917 (M+K)
+

T

0,64


12


-benzene-methanol (30 : 20: 7)

 
kháng sinh 70-             
 



[29].
1.8.3. Các kháng  
Streptomyces fradiae PTZ0025

MK844  
         
fradic A (6) và B (7). 

ao (HRESIMS), 


13



Hình  7

 in
vitro Staphylococcus aureus  6,0


(IC
50
) là 0,13 - Fradimycin B (4), 
 v
 trình (apoptosis)           còn  


    3- có
  [31].
1.8.4. Các pyramidacin A  D, 3-Hydroxyquinoline-2-carboxamide và các ben-
Streptomyces sp. DGC1

      


14


-D (2
-hydroxyquinoline-2-Streptomyces sp.
DGC1. Ngoài ra,   là 2-
aminobenzamide (anthranilamide) (1); 4',7-dihydroxyisoflavanone (7); 2'-deoxy-
thymidine; 2'-deoxy-uridine và adenosine.

  
  y, c 1-

bên amide.
 C (2  4)

hóa lý
Pyramidamycin A (2)
Pyramidamycin B (3)
Pyramidamycin C (4)






(365 nm)




Rf
0.32
(CH2Cl2/5%MeOH)
0.22
(CH2Cl2/5%MeOH)
0.57
(CH2Cl2/2%MeOH),
0.30 (CH2Cl2)


C8H9NO3
C8H9NO4

C8H10N2O3
-ESI MS:
m/z



(+)-ESI MS:
m/z
168 [M+H]+,190
[M+Na]+
184 [M+H]+, 206
[M+Na]+
183 [M+H]+, 205
[M+Na]+
(+)-HRESI MS (m/z)


15




168.0654 [M+H]+ và
190.0489 [M+Na]+
184.0609 [M+H]+,
206.0435 [M+Na]+
và 389.0963
[2M+Na]+
183.0774 [M+H]+,
205.0600 [M+Na]+

và 387.1292
[2M+Na]+
Tính toán

168.0655 cho
C8H10NO3 và
190.0475 cho
C8H9NO3Na
184.0604 cho
C8H10NO4,
206.0424 cho
C8H9NO4Na và
389.0955 cho
C16H18N2O8Na
183.0770 cho
C8H11N2O3,
205.0589 cho
C8H10N2O3Na,
387.1275 cho
C16H20N4O6Na
UV/VIS
(MeOH):


212 (4.45), 255
(4.17), 295 (3.90) nm.
214 (4.20), 260
(3.94), 295 (3.62) nm.
235 (4.42), 271
(4.02), 314 (3.63) nm.

        D và 3 - hydroxyquinoline-2-
carboxamide

Pyramidamycin D (5)
3-Hydroxyquinoline-2-
carboxamide (6)


UV


quang màu xanh lá cây

(365 nm)
Rf
0.31 (CH2Cl2/7%MeOH)
0.30 (CH2Cl2)

C10H12N2O4
C10H8N2O2
-ESI MS: m/z


(+)-ESI MS: m/z
225 [M+H]+
189 [M+H]+