Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 173 113

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




PHAN THỊ HUYỀN




NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG
SINH TỪ STREPTOMYCES 173.113



LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014





BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







PHAN THỊ HUYỀN



NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ
STREPTOMYCES 173.113

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ
THUỐC
MÃ SỐ: 60720402





Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Văn Thu






HÀ NỘI 2014



Lời cảm ơn
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo – PGS.TS Cao Văn
Thu người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên
đang giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học
Dược Hà nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm luận văn tại

bộ môn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn
thể các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện
nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, luận văn này không
tránh khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô
và bạn bè để luận văn này có thể được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Phan Thị Huyền







MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………………
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………………………
1.1. Đại cương về Streptomyces………………………………………………………
1.1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ………………………………
1.1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces………………………

1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn…………………
1.1.4. Những điểm lưu ý khi nghiên cứu các chất kháng sinh từ xạ khuẩn……
1.2. Bước đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113
1.3. Nghiên cứu tổng hợp Actinomycin X
2
từ Streptomyces 15.29 – Streptomyces
microflavus……………………………………………………………………………………
1.4. Công nghệ lên men Daunorubicin và Adriamycin…………………………….
1.5. Tổng hợp cirramycin B từ Streptomyces cyaneus………………………………….
1.6. Kháng sinh chống nấm non-polyen từ Streptomyces albidoflavus……………….
1.7. Tổng hợp kháng sinh antimycin A9 từ Streptomyces Sp. K01-0031 ……………
1.8. Sparsomycin kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces Sp. AZ-NIOFD1…….
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ……………………………………………………
2.1.1. Nguyên vật liệu……………………………………………………………
2.1.2. Máy móc thiết bị………………………………………………………….
2.2. Phương pháp thực nghiệm ……………………………………………………
2.2.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn………………………………………….
2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán…………
2.2.3. Sàng lọc ngẫu nhiên………………………………………………………
2.2.4. Đột biến bằng ánh sáng UV………………………………………………
2.2.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………
2.2.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ………………
2.2.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng…………….
2.2.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không…………
1
2
2
2
3

4
5
5

6
7
9
9
10
12
14
14
14
16
16
16
17
18
18
20
20
21
22


2.2.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột…………………………………
2.2.10. Xác định cấu trúc hóa học thành kháng sinh chính tinh khiết thu được……
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT……………………
3.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn………………………………………………
3.1.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………

3.1.2. Kết quả đột biến lần thứ nhất ……………………………………………
3.1.3. Kết quả đột biến lần thứ hai ……………………………………………
3.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất……………………
3.2.1. Kết quả chọn chủng lên men ……………………………………………
3.2.2. Khảo sát chọn môi trường lên men chìm………………………………….
3.2.3. Kết quả lên men, chiết và cất quay thu kháng sinh thô…………………….
3.2.4. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ nhất…………………………………
3.2.5. Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ hai……………………
3.2.6. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ hai…………………………………….
3.2.7. Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ ba……………………….
3.2.8. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ ba………………………………………
3.3. Nghiên cứu tính chất, cấu trúc kháng sinh………………………………………….
3.3.1. Kết quả đo độ nóng chảy…………………………………………………….
3.3.2. Kết quả phổ tử ngoại ……………………………………………………….
3.3.3. Kết quả phổ hồng ngoại ………………………………………………
3.3.4. Kết quả đo phổ khối ……………………………………………………….
3.3.5. Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân …………………………………
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN …………………………………………………………
4.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn ……………………………………………
4.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ………………….
4.3. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ……………………………………………….
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………………
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

22
23
24
24
24

25
27
29
29
31
32
32
35
37
39
40
43
43
43
44
46
46
49
49
50
52
54


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Giá trị MIC và MFC của kháng sinh từ Streptomyces. albidoflavus
…………
Bảng 1.2: Giá trị MIC của các antimycin trên Caenorhabditis elegans và
Artemia salina
……………….

Bảng 2.1: Các vi sinh vật kiểm định
………………
Bảng 2.2.: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định……………………………………
Bảng 2.3.: Các dung môi sử dụng………………………………………………………
Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên
………………
Bảng 3.2.: Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ nhất…………………………
Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1
………………
Bảng 3.4.: Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ hai…………………………
Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2
………………
Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men
…… …………
Bảng 3.7.: Kết quả chọn môi trường lên men……………………………………
Bảng 3.8: Kết quả sắc ký cột lần thứ nhất
……… ………… ……………
Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn chạy cột lần 1
……………….
Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn khảo sát dung môi tinh chế KS lần 2 …
Bảng 3.11: Tỷ lệ các thành phần hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n-hexan
…………
Bảng 3.12: Kết quả SKLM với các hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n-hexan ……
Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau tinh chế lần 2
………………
Bảng 3.14: Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ hai
………………
Bảng 3.15: Thành phần các hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần 3
……………….
Bảng 3.16.: Kết quả SKLM với các hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ 3……….

Bảng 3.17.: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau tinh chế lần 3……………………
Bảng 3.18.: Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ 3……………………
Bảng 3.19.: Biện giải các nhóm chức của KS1 từ phổ IR………………………………
Bảng 3.20.: Biện giải các nhóm chức của KS2 từ phổ IR………………………………
Bảng 3.21.: So sánh phổ NMR của KS2 với khung phenoxazone của actinomycin D
10

11
14
15
15
24
25
26
28
28
30
31
33
34
36
36
37
38
38
40
40
41
42
44

45
48



DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 : Một số kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces …………………3

Hình 1.2 : Sơ đồ lên men tổng hợp kháng sinh …………………4

Hình P1 : Phổ UV của chất kháng sinh KS1
Hình P2 : Phổ UV của chất kháng sinh KS2
Hình P3 : Phổ IR kháng sinh KS1
Hình P4 : Phổ IR kháng sinh KS2
Hình P5 : Phổ khối MS kháng sinh KS1
Hình P6 : Phổ khối MS kháng sinh KS2
Hình P7 : Phổ
1
H NMR của kháng sinh KS2
Hình P7a, b, c: Phổ
1
H NMR giãn của kháng sinh KS2
Hình P8 : Phổ
13
C NMR của kháng sinh KS2
Hình P8a, b, c : Phổ
13
C NMR giãn của kháng sinh KS2
Hình P9 : Phổ COSY của kháng sinh KS2
Hình P9a, b, c : Phổ COSY giãn của kháng sinh KS2

Hình P10 : Phổ DEPT của kháng sinh KS2
Hình P10a, b : Phổ DEPT giãn của kháng sinh KS2
Hình P11 : Phổ HSQC của kháng sinh KS2
Hình P11a, b : Phổ HSQC giãn của kháng sinh KS2
Hình P12 : Phổ HMBC của kháng sinh KS2
Hình P12a, b, c, d : Phổ HMBC giãn của kháng sinh KS2





1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Với tính chất là một nước có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, Việt Nam nằm trong
số các nước có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất cao. Tuy nhiên, trên thị trường dược
phẩm nước ta hiện nay, hầu hết các thuốc kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành
phẩm hoặc bán thành phẩm, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình
thành. Vì vậy, đề án “Quy hoạch chi tiết phát triển công nghiệp Dược Việt Nam giai
đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” đã xác định đẩy mạnh việc sản xuất
nguyên liệu kháng sinh thế hệ mới đáp ứng nhu cầu về nguyên liệu để sản xuất kháng
sinh trong nước [4].
Tổng hợp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp là ba hướng phát hiện và
tổng hợp kháng sinh. Trong đó sinh tổng hợp kháng sinh với nhiều ưu điểm được sử
dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới.
Trong tất cả kháng sinh được biết đến hiện nay, có tới 55% kháng sinh được
phân lập từ xạ khuẩn, 75% trong số đó từ chi Streptomyces [8, 23]. Bộ môn Vi sinh –
Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng
xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có
chủng xạ khuẩn Streptomyces 173.113. Bước đầu nghiên cứu cho thấy Streptomyces

173.113 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tuy nhiên hiệu suất tổng hợp
cũng như hiệu suất tinh chế chưa cao, chưa biện giải được cấu trúc hóa học của kháng
sinh thu được [7]. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng
sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 173.113” làm luận văn thạc sĩ với các mục
tiêu cụ thể như sau:
1. Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng hợp kháng
sinh.
2. Nâng cao khả năng lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh.
3. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh chính thu được.
2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về Streptomyces
1.1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh
có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn
tổng hợp thì có tới 75% là từ Streptomyces [8, 23].
- Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và
khuẩn ty khí sinh:
+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt
trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi
trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung
môi hữu cơ.
+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí.
Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi
bào từ.
+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng,
móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân chia tạo thành các bào tử trần, là cơ quan
sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù
xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp).

- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao.
Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và
năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, khử nitrat
thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của
chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.
3

- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4
loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc
tố melanoid [1, 3, 5, 27].
1.1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces
Trong số các kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp được biết đến hiện nay thì
phần lớn được tổng hợp từ Streptomyces. Các chất kháng sinh được tổng hợp từ
xạ khuẩn bao gồm các chất chống nâm, các chất kháng sinh, và hóa chất trị liệu
hóa học trong ung thư. Hình 1 dưới đây giới thiệu một số kháng sinh, trong đó
phần lớn là do Streptomyces tổng hợp [2, 8, 23].

Hình 1.1: Một số kháng sinh đƣợc tổng hợp từ Streptomyces
4

1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn
Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được
thể hiện trong hình 1.2 dưới đây.

Hình 1.2: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh
Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm
Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm
Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống
Bình lên men tạo kháng sinh
Dịch lên men

Dịch lọc
Sinh khối
Sinh khối thô
Dịch chiết sinh khối
Sản phẩm tinh chế
Dịch chiết kháng sinh
Dịch chiết đậm đặc
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm đã kiểm nghiệm
Sản phẩm được đóng gói
5

1.1.4. Những điểm lƣu ý khi nghiên cứu các chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Xạ khuẩn là vi khuẩn thật thuộc nhóm cơ thể nhân sơ, nhưng phát triển
thành hệ sợi và thường sinh sản bằng bào tử. Giống như nấm sợi, xạ khuẩn có
khả năng phát triển tốt trên môi trường xốp. Hiện nay, do điều kiện kỹ thuật đảm
bảo môi trường nuôi vô trùng, người ta rất quan tâm đến việc nghiên cứu phát
triển phương pháp lên men trên môi trường xốp để sinh tổng hợp enzyme, các
chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học khác.
Xạ khuẩn có cấu tạo giống vi khuẩn, nhưng thời gian sinh trưởng phát
triển chậm hơn vi khuẩn. Do đó, thời gian sinh trưởng, phát triển và sinh tổng
hợp các chất kháng sinh thường kéo dài đến 96 -120 giờ lên men.
Hầu hết các chủng xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường trung tính và
nhiệt độ tối ưu là 28-30
0
C. Hơn nữa, sau giai đoạn sinh trưởng, phát triển, xạ
khuẩn thường chuyển sang giai đoạn tự phân, do đó trong quá trình sản xuất phải
lưu ý đến thời gian thu nhận sản phẩm. [8]

1.2. Bƣớc đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ

Streptomyces 173.113
Streptomyces 173.113 được bộ môn Vi sinh – Sinh học – trường ĐH Dược
Hà Nội phân lập từ đất Tây Nguyên. Đây là môt chủng xạ khuẩn ổn định, có khả
năng tổng hợp kháng sinh phổ rộng trên cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm,
có tiềm năng trong việc ứng dụng trong lĩnh vực phòng và chữa bệnh. Tuy nhiên,
hoạt tính kháng sinh chưa cao, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn thấp, do
đó cần phải tiến hành cải tạo giống lựa chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh cao và nghiên cứu phương pháp tinh chế kháng sinh thu được hiệu
suất cao nhất.
Qua sàng lọc ngẫu nhiên, và đột biến bằng UV và tác nhân hóa học thu
được biến chủng ĐB3.04 là biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Tỷ lệ
6

sống sót sau 3 lần đột biến của VSV là 0,15%. Sau đó lên men chìm biến chủng
ĐB3.04 để tạo kháng sinh. Môi trường lên men thích hợp nhất là MT1dt. Lượng
kháng sinh thô thu được từ dịch lên men là 0,1033 g/l.
 Tách chiết kháng sinh:
Sau khi lên men, dịch lọc lên men được chiết bằng ethylacetat ở pH 5. Dịch
chiết dung môi hữu cơ được đem cất quay chân không thu kháng sinh thô.
Quá trình tách các thành phần trong hỗn hợp kháng sinh thô cho thấy hỗn
hợp kháng sinh có ít nhất 3 thành phần. Các thành phần chính được tinh chế
bằng sắc ký cột Silicagel, với hiệu suất tinh chế cuối cùng khoảng 33,48%
 Một số tính chất lý hóa kháng sinh chính thu được:
Nhiệt độ nóng chảy : 217,4
0
C.
Phổ tử ngoại: cho các đỉnh hấp thụ ở: 204 nm, 333 nm và 443 nm. Từ đó,
dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, hoặc kết hợp các đặc
điểm trên.
Phổ khối lượng phân tử: dự đoán phân tử lượng là 1268, 49 đvC [7].

Như vậy, nghiên cứu bước đầu đã tiến hành sàng lọc, đột biến để thu được
biến chủng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn, và đã tách chiết được
thành phần kháng sinh chính trong quá trình lên men. Tuy nhiên, hiệu suất sinh
tổng hợp kháng sinh chưa cao, quá trình tinh chế kháng sinh chưa xác định được
kháng sinh đã tinh khiết hay chưa, do đó cần tiếp tục nghiên cứu để nâng cao khả
năng sinh tổng hợp, hiệu suất quá trình tinh chế, và độ tinh khiết của kháng sinh
chính thu được.
1.3. Nghiên cứu tổng hợp Actinomycin X
2
từ Streptomyces 15.29 –
Streptomyces microflavus
Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở Việt Nam,
tại phòng thí nghiệm vi sinh, bộ môn Vi sinh sinh học trường ĐH Dược Hà Nội.
7

Tiến hành phân loại Streptomyces 15.29 theo ISP thì thấy 92,68% các đặc điểm
trùng khớp với Streptomyces sinensis. Tuy nhiên, khi giải trình tự gen 16s rADN
bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR thấy hệ gen của Streptomyces 15.29 hoàn
toàn trùng với gen của Streptomyces microflavus. Do đó kết luận tên khoa học
của Streptomyces 15.29 là Streptomyces microflavus.
Tiến hành lên men Streptomyces microflavus thu dịch lên men sau đó chiết
bằng ethylacetat. Dịch chiết ethylacetat được cất chân không thu được cắn (5g),
sau đó tiến hành các phương pháp tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột
silica gel thu được chất kháng sinh chính 1(1g).
Kháng sinh chính 1 được xác định các thông số về đặc tính lý hóa và công
thức phân tử, công thức cấu tạo.
Kháng sinh chính 1 : Chất rắn có màu hồng sẫm, Phổ khối lượng ESI-MS
m/z 1292 đvC [M+Na]
+
C

62
H
84
N
12
O
17
.
Nhiệt độ nóng chảy: 249 - 250
o
C.
Độ quay cực: []
22
D
-360
o
(c, 0,5 trong MeOH).
Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ, tác giả xác
định được hợp chất 1 là actinomycin X
2
, một hợp chất cũng được phân lập từ
chủng Streptomyces spp. và có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng
sinh rất mạnh [16, 17, 20].
1.4. Công nghệ lên men Daunorubicin và Adriamycin.
Daunorubicin và Adriamycin là các kháng sinh có hoạt tính chống ung thư
từ các xạ khuẩn chi Streptomyces. Daunorubicin được sinh tổng hợp từ chủng S.
peucetius và S.coeruleorubidus có độ độc cao nên ngày nay không được sử dụng
điều trị ung thư, thay vào đó người ta nghiên cứu ra Adriamycin là chất kháng
sinh tổng hợp từ biến chủng của S. peucetius có hoạt tính cao hơn và phổ điều trị
ung thư rộng hơn, ít độc tính hơn. Ngoài ra, một nhóm nghiên cứu ở Liên Xô

8

cũng đã thu được một dẫn xuất tương tự khác là carmynomycin sinh tổng hợp từ
xạ khuẩn Actinomadura carminata.
Quá trình lên men sản xuất Adriamycin như sau: Chủng S. peucetius được
đột biến bằng hóa chất thu biến chủng. Biến chủng được nuôi cấy trong ống
thạch nghiêng ở 26-27
0
C, trong khoảng 10 ngày, sau đó loại bỏ hệ sợi nấm có
màu đỏ đậm cấy chuyền sang môi trường bình tam giác 2 lít và nuôi trên máy lắc
ở tốc độ 120 v/phút, 28
0
C trong 2 ngày. Sau đó cấy sang thiết bị nhân giống thể
tích 170 lít ( chứa 120 lít môi trường), nhân giống ở 26-27
0
C trong 27 giờ, rồi
cấy truyền tiếp sang thùng lên men 800 lít ( chứa 500 lít MT). Quá trình lên men
kéo dài khoảng 145 giờ.
Sản phẩm adriamycin tồn tại trong cả môi trường lẫn hệ sợi, vì vậy người
ta phải xử lý cả phẩn sinh khối và phần dịch trong để thu sản phẩm. Đầu tiên,
dịch lên men được lọc để tách riêng dịch trong và bã lọc. Phần bã lọc được ngâm
xử lý trong hỗn hợp dung môi aceton: acid sulfuric 0,1N tỷ lệ 4:1, sau đó lọc
tách bã. Phần dịch được trung hòa về pH 7, và cô đặc chân không xuống nồng độ
Adriamycin khoảng 250mg/l. Dịch cô đặc được loại lipid bằng trích ly với dung
môi chloroform ở pH 3. Pha nước được kiềm hóa bằng NaOH về pH 8,6 rồi trích
ly bằng hệ dung môi Chloroform – Methanol. Dung môi trích ly loại nước được
làm khô bằng natri sulfate khan, lọc, cô đặc, cuối cùng bổ sung ether vào để kết
tủa thu adriamycin thô. Phần dịch trong thu được sau khi lọc dịch lên men cũng
được xử lý qua các công đoạn tương tự thu bột adriamycin thô. Bột thô được hòa
tan lại trong nước để tách qua cột cellulose, rửa cột bằng đệm phosphate pH 4,5

và n-butanol. Dịch thu gom các phân đoạn sản phẩm được cô đặc chân không rồi
trích ly sang chloroform ( tỷ lệ dung môi 4:1). Bước tiếp theo là phân tly thu pha
dung môi, làm khô bằng Natri sulphat khan, cô đặc chân không rồi bổ sung dung
dịch HCl trong methanol và làm lạnh để kết tinh thu kết tủa. Cuối cùng, hòa tan
9

và kết tinh lại kết tủa trong ethanol để thu sản phẩm Adriamycin hydrochlorid
tinh sạch.[2, 8].
1.5. Tổng hợp cirramycin B từ Streptomyces cyaneus
Atta và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu lên men sinh tổng hợp và tinh chế
cirramycin B từ S. Cyaneus
Sau khi lên men, dịch lọc lên men được chiết xuất bằng Ethylacetat tỷ lệ
1:1. Loại dung môi bằng cất chân không dưới áp suất giảm thu được cắn, cắn
được hòa tan trong lượng tối thiểu DMSO, sau đó được lọc. Các thành phần
kháng sinh được tách bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi chạy sắc ký là
Chloroform: Methanol ( 24:1). Có ít nhất 3 thành phần trong hỗn hợp kháng
sinh, trong đó thành phần có R
f
= 0,4 là thành phần chính.
Tinh chế kháng sinh chính bằng sắc ký cột silicagel với dung môi chạy cột
là Chloroform: methanol (9:1).
Kháng sinh chính thu được có nhiệt độ nóng chảy là 228
0
C, hòa tan không
giới hạn trong CHCl
3
, ethylacetat, n butanol, aceton, ethanol, methanol, iso-
propanol, không tan trong dầu mỏ, hexan, benzene. Đo phổ UV, bước sóng hấp
thu cực đại là ở 240nm, phổ IR có 11 đỉnh hấp thụ. Đo phổ khối xác định khối
lượng phân tử là 679,4 đvC, công thức phân tử là C

36
H
59
NO
12.
Tiến hành phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ đã xác
định được kháng sinh chính là cirramycin một kháng sinh thế hệ II nhóm
macrolide, có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gr + và Gr-[20].
1.6. Kháng sinh chống nấm non-polyen từ Streptomyces albidoflavus
Kháng sinh chống nấm chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong các nhóm thuốc
hiện nay , tuy nhiên lại đóng vai trò rất quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh
về nấm.
10

S K. Augustine và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp một kháng
sinh chống nấm non – polyen từ Streptomyces albidoflavus PU23.
Lượng kháng sinh thu được từ Streptomyces albidoflavus PU23 cao nhất
là vào ngày thứ 8 của quá trình nuôi cấy. Dịch lên men được chiết bằng n-hexan,
sau đó bốc hơi thu hổi dung môi thu được kháng sinh thô. Các thành phần trong
kháng sinh thô này được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là
ethanol: nước: chloroform (2:2:1). Dùng sắc ký cột với hệ dung môi là ethanol:
nước ( 50:50) để tinh chế thu kháng sinh tinh khiết chính.
Dựa vào phân tích phổ FTIR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân dự đoán công
thức phân tử của kháng sinh chính là C
16
H
32
O
19
, có một nhóm hydroxymethyl,

một nối đôi, còn lại là các liên kết –CHOH Như vậy kháng sinh chính có công
thức cấu tạo kiểu chuỗi polyhydroxy polyether mạch thẳng, có một liên kết đôi,
do đó thuộc nhóm chống nấm non-polyen [18].
Về hoạt tính sinh học của kháng sinh chính đổi với các chủng nấm được
thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 1.1 : Giá trị MIC và MFC của kháng sinh từ S.albidoflavus.

1.7. Tổng hợp kháng sinh antimycin A9 từ Streptomyces Sp. K01-0031
11

Chủng K01-0031 được phân lập từ mẫu đất trên núi tại Chuxiong,
Yunnan, Trung Quốc. Qua phân loại ISP, xác định được là thuộc nhóm xạ khuẩn
Streptomyces.
Tiến hành lên men chủng xạ khuẩn trên, dịch lên men được chiết bằng
ethylacetat, sau đó cất thu hồi dung môi thu được cắn. Tiến hành sắc ký cột hỗn
hợp kháng sinh thô, thu được hỗn hợp kháng sinh nhóm antimycin. Hỗn hợp này
được chạy qua sắc ký lỏng hiệu nâng cao HPLC, dung môi rửa giải là CH
3
CN
70% thu được kháng sinh tinh khiết chính là antimycin A
9
(1). Bên cạnh đó còn
thu được antimycin A
3a
(2), A
3b
(3), A
4
(4)
,

A
7
(5).
Antimycin A
9
là kháng sinh chính, nó tan được trong MeOH, aceton,
acetonitril, ethyl acetat và chloroform, không tan trong nước và n-hexan. Công
thức của antimycin A
9
được xác định là C
29
H
34
N
2
O
9
. Phổ IR của antimycin A
9

tương tự như phổ của một số antimycin đã biết. Phân tích phổ
1
H,
13
C NMR
thấy công thức cấu tạo của (1) có một vòng dilactone, một nhóm bán 3-
formamidosalicyl, một chuỗi n-butyl. Những đặc điểm này giống với công thức
cấu tạo của các antimycin khác. Tuy nhiên, (1) là chất duy nhất có nhóm
phenylacetyl gắn với C
8

[25].
Về khả năng kháng khuẩn, nghiên cứu đánh giá trên hai chủng vi khuẩn
Caenorhabditis elegans, và Artemia salina. Kết quả được thể hiện trên bảng sau:
Bảng 1.2: Giá trị MIC của các antimycin trên Caenorhabditis elegans, và
Artemia salina
Hợp chất
Caenorhabditis elegans
Artemia salina
Antimycin A
9

0.2
0.05
Antimycin A
3a

1
0.2
Antimycin A
3b

1
0.2
12

Antimycin A
4

1
0.2

Antimycin A
7

>1
0.2

1.8. Sparsomycin kháng sinh đƣợc tổng hợp từ Streptomyces Sp. AZ-
NIOFD1
Atta và cộng sự đã tiến hành phân lập một chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp. AZ-NIOFD1 từ nước sông Nin-Ai Cập, sau đó tiến hành lên men, chiết xuất
và tinh chế để thu được một hợp chất có hoạt tính kháng sinh.
Tiến hành giải trình tự gen 16s rADN ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen
PCR nhận thấy Streptomyces sp. AZ-NIOFD1 tương tự Streptomyces
violaceusniger , AZ-NIOFD1.
Dịch lên men được chiết bằng n-butanol ở pH 7, cất chân không loại dung
môi. Sử dụng sắc ký lớp mỏng để tách các thành phần trong hỗn hợp kháng sinh
thô, dung môi là chloroform : methanol (24:1), chỉ chất có R
f
= 0.75 là có hoạt
tính kháng sinh. Tiến hành tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi
chạy cột là chloroform : methanol (8:2), phân đoạn từ 23 đến 30 là có hoạt tính
kháng sinh mạnh nhất.
Kháng sinh chính tinh khiết được xác định các thông số hóa lý và cấu
trúc. Kháng sinh chính tan được trong chloroform, n-buthanol, acetone,CCl
4
,
methanol, ethanol, DMSO, không tan trong dầu hỏa, hexan, và benzen. Nhiệt độ
nóng chảy là 205
0
C. Công thức phân tử là C

13
H
21
N
3
O
6
S
2
, phân tử lượng là 361.3
đvC, phổ IR có 23 đỉnh hấp thụ. Phổ UV hấp thụ cực đại ở 270 và 302 nm. Phân
tích phổ cộng hưởng từ kết hợp với các thông số trên có thể kết luận kháng sinh
chính sinh tổng hợp từ Streptomyces Sp. AZ-NIOFD1 là sparsomycin.
13

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của kháng sinh này thấy nó có khả năng ức
chế Gram dương ( MIC dao động từ 11,7 đến 31,25 µg/ml), Gram âm ( MIC dao
động từ 11,7 đến 15,6 µg/ml) [19].

14

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh
học trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ mẫu đất tại Tây Nguyên.
 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được
trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gram(+)
Vi khuẩn Gram(-)
Staphylococcus aureus ATCC 1228
Proteus mirabilis BV 108

 Môi trƣờng
 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: Theo nghiên cứu trước [7], chúng tôi
lựa chọn MT1 làm môi trường nuôi cấy xạ khuẩn với thành phần trong 100 ml
môi trường như sau: Tinh bột 2g, KNO
3

0,1 g, K
2
HPO
4

0,05g, MgSO
4
.7H
2
O 0,5
g, NaCl 0,5 g, thạch 1,8 g, pH 7.
 Các MT lên men (MTdt): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn
nhưng loại bỏ thạch.
 Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần các MT được trình bày ở
bảng 2.2.
Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định
đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút

15

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần
NaCl
Cao thịt
Pepton
Thạch
pH
%
%
%
%
MT canh thang
0,5
0,3
0,5
0
7,0-7,4
MT thạch thường
0,5
0,3
0,5
1,8

 Dung môi
Bảng 2.4 giới thiệu các dung môi được sử dụng trong nghiên cứu cùng các
đặc trưng cơ bản của chúng.

Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng

Dung môi
Khối lượng riêng (g/ml)
Nhiệt độ sôi (°C)
Aceton
0,79
56
Ethanol
0,789-0,791
78,3
Ethylacetat
0,889-0,901
70,4
Methanol
0,791-0,793
88,6-88,8
Triethylamin
0,726-0,728
90
n-hexan
0,655
68,7
n-propanol
0,803
97-98
 Vật liệu chạy sắc ký
- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 5 ở trên
- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,04-0,063

mm
16

2.1.2. Máy móc thiết bị
- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba
60W, điện thế 220V.
- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf
- Tủ ấm Memmert, Binder
- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48
- Tủ sấy SL shellab
- Tủ lạnh Sanyo
- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030
- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210
- Cân phân tích Sartorius BP 121 S
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt
- Máy cất quay Buchi Waterbath B480
- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm
- Hộp Petri đường kính 9cm
- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống
đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH,
đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…
2.2. Phƣơng pháp thực nghiệm
2.2.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích
hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C.
- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh
bảo quản ở 2-3°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền.
17

2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khuếch tán

- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV
kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát
triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
- Tiến hành:
+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5
ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn
dịch VSV có nồng độ 10
6
-10
8
tế bào/ml.
+ Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để
nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (10
5
tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa
Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:
 Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã
được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới
50
0
C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định.
 Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV
sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định.
 Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên
MT đã cấy VSV kiểm định. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng.
+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối
với vi khuẩn). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm
định.
+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer

có độ chính xác 0,02mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô
khuẩn xử lý theo công thức:
18

2
11
()
1
nn
ii
ii
D D D
Ds
nn






Trong đó:
D
(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
i
D
(mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (Thông thường n=3)
2.2.3. Sàng lọc ngẫu nhiên
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces

173.113, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân
tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10
-1
(định ước). Sau đó, pha
loãng tương tự đến nồng độ 10
-6
bằng nước vô trùng.
- Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở
các độ pha loãng 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
, nhỏ lên bề mặt thạch của MT2 trong đĩa Petri.
Dùng que trang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử lên bề mặt thạch. Tiến hành
trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng. Cho các đĩa vào tủ ấm 28°C trong 6
ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
- Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đặc
thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS. Các khuẩn lạc này, sau khi
nuôi cấy 6 ngày được thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.
2.2.4. Đột biến bằng ánh sáng UV
- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces
173.113, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân
tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10
-1
(định ước). Sau đó dung