Nghiên cứu nhân giống hữu tính và đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây bình vôi stephania glabra (roxb ) miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





TRẦN KIỀU DUYÊN


NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ
SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ
CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers,
THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM





LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI: 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI





TRẦN KIỀU DUYÊN



NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ
SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ
CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers,
THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 60720406




Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Nguyễn Quốc Huy

2. GS. TS. Phạm Thanh Kỳ







HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN


Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được
rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của Trường Đại học Dược Hà Nội, các Thầy Cô
giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và
gia đình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
GS. TS. Phạm Thanh Kỳ, TS. Nguyễn Quốc Huy đã trực tiếp hướng dẫn,
hết lòng chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Các cán bộ Phòng Kiểm tra chất lượng là đồng nghiệp của tôi và lãnh đạo của tôi
là Ths. Phùng Minh Dũng, DSCK II. Trần Bình Duyên - Công ty cổ phần
Dược TW Mediplantex
Các thầy cô Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược học cổ
truyền - Trường ĐH Dược Hà Nội
đã đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi khi thực hiện luận văn
này.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các Giảng viên, các Kỹ thuật viên Bộ

môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội, nơi tôi công tác đã tạo điều
kiện rất thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Cám ơn DS. Nguyễn Vũ Minh và các sinh viên nghiên cứu đã luôn sát
cánh cùng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ông Đỗ Ngọc Sâm - Xã Tản Lĩnh, Huyện Ba
Vì, Hà Nội; Anh Vũ Long Vân Công ty CP Lâm Y Dược Bắc Sơn tại xã
Nghĩa Phương, Lục Nam, Bắc Giang đã giúp tôi thu thập mẫu, chăm sóc cây và
bố trí, tiến hành nghiên cứu.




Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người bạn, người
thân trong gia đình và nhất là bố, mẹ, chồng và các con đã luôn kịp thời động
viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất.

Xin trân trọng cảm ơn !

Trần Kiều Duyên




DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
Viết đầy đủ
CP
Cổ phần
DC
Dịch chiết
DL
Dược liệu
DĐVN III
Dược điển Việt Nam III
DĐVN IV
GAP
Dược điển Việt Nam IV
Good Agricultural Practices
Thực hành tốt trồng trọt
HPLC
High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HL
hàm lượng
NN & PTNT
Nông nghiệp và phát triển nông thôn
NCKH
Nghiên cứu khoa học
S.
Stephania
SKĐ
STT
TCCS

Sắc ký đồ
Số thứ tự
Tiêu chuẩn cơ sở
TW
Trung ương
YDHCT
Y dược học cổ truyền
WHO
World Health Organization





DANH MỤC HÌNH

STT
Tên hình
Trang
1.
Hình 1.1: Vị thuốc Bình vôi dùng trong Dược học cổ truyền
4
2.
Hình 1.2: Hình ảnh loài S.glabra (Roxb.) Miers
6
3.
Hình 1.3: Cây Bình vôi S.glabra (Roxb.) Miers mọc tự nhiên
6
4.
Hình 3.4: Hạt Bình vôi đạt tiêu chuẩn

32
5.
Hình 3.5: Cây mầm sau 6 tháng gieo hạt
35
6.
Hình 3.6: Cây con vừa được vào bầu
36
7.
Hình 3.7: Nhà huấn luyện cây con
39
8.
Hình 3.8: Cây con được che bóng 75% sau 5 tháng ra bầu
39
9.
Hình 3.9: Cây con được che bóng 50% sau 5 tháng ra bầu
39
10.
Hình 3.10: Cây con được che bóng 25% sau 5 tháng ra bầu
40
11.
Hình 3.11: Cây giống đạt tiêu chuẩn trước khi đem trồng

40

DANH MỤC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1.
Bảng 1.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần của Nguyễn Tiến Vững
8
2.
Bảng 1.2: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần của Lã Đình Mỡi
9
3.
Bảng 1.3: Kết quả định lượng rotundin của Nguyễn Tiến Vững
11
4.
Bảng 1.4: Kết quả định lượng rotundin Lã Đình Mỡi
11
5.
Bảng 2.5: Thiết kế nghiên cứu mức độ che bóng

27
6.
Bảng 2.6: Số lượng củ Bình vôi lấy mẫu theo số năm tuổi
28
7.
Bảng 2.7: Ngày lấy mẫu theo mùa trong năm
28
8.
Bảng 2.8: Giá trị tham khảo theo Test Dixon
30
9.
Bảng 3.9: Kết quả thực nghiệm theo dõi cách bảo quản hạt
33
10.
Bảng 3.10: Bảng quy trình xử lý hạt
34
11.
Bảng 3.11: Theo dõi hạt nảy mầm ở 3 phương pháp xử lý hạt
34
12.
Bảng 3.12. Số lượng cây sống sau khi ra bầu
36
13.
Bảng 3.13. Sự phát triển của cây con sau khi ra bầu
37
14.
Bảng 3.14: Tỷ lệ cây con sống sau khi ra bầu 5 tháng
38
15.
Bảng 3.15: Sự sinh trưởng và phát triển của cây con

38
16.
Bảng 3.16. Khối lượng củ theo tuổi khảo sát lần 1
41
17.
Bảng 3.17. Khối lượng củ theo tuổi khảo sát lần 2
42
18.
Bảng 3.18: So sánh khối lượng củ theo tuổi của 2 lần khảo sát
43
19.
Bảng 3.19: Hàm lượng alcaloid toàn phần củ cây 1 tuổi, 2 tuổi, 3 tuổi
43
20.
Bảng 3.20. Hàm lượng alcaloid toàn phần ở củ cây 2 tuổi, 3 tuổi, 4 tuổi
44
21.
Bảng 3.21: So sánh hàm lượng alcaloid toàn phần tính theo năm tuổi
44
22.
Bảng 3.22. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần đánh giá theo mùa
45
23.
Bảng 3.23: So sánh hàm lượng alcaloid tích lũy trong củ giữa các mùa
45
24.
Bảng 3.24: Kết quả đánh giá độ phù hợp cột C18 (250 x 4,6 mm; 5µm)
46
25.
Bảng 3.25: Đánh giá độ phù hợp của cột C18 (150 x 2,1 mm; 3µm)

46
26.
Bảng 3.26: Đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống
47
27.
Bảng 3.27: Đánh giá mức độ ảnh hưởng các thành phần alcaloid tới




rotundin
48
28.
Bảng 3.28: Hàm lượng rotundin ở củ cây 1 tuổi, 2 tuổi, 3 tuổi
48
29.
Bảng 3.29. Hàm lượng rotundin ở củ cây 2 tuổi, 3 tuổi, 4 tuổi
49
30.
Bảng 3.30: So sánh hàm lượng rotundin trong củ theo tuổi
49
31.
Bảng 3.31: Số lượng pic và % diện tích rotundin so với tổng diện tích
của alcaloid toàn phần
50
32.
Bảng 3.32 Kết quả định lượng rotundin theo mùa trong năm
50
33.
Bảng 3.33: Dữ liệu so sánh hàm lượng rotundin giữa các mùa

51





















MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG

Tên mục
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ

1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Tình hình khai thác và nhu cầu sử dụng Bình vôi
1.1.1. Tình hình khai thác
1.1.2. Nhu cầu sử dụng
1.2. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học loài Stephania glabra (Roxb.) Miers
1.2.1. Đặc điểm thực vật
1.2.2. Thành phần hóa học
1.3. Phƣơng pháp định lƣợng, hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin ở củ một
số loài Việt Nam
1.3.1. Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần
1.3.2. Hàm lượng alcaloid toàn phần có trong củ một số loài Bình vôi
1.3.3. Phương pháp định lượng rotundin
1.3.4. Hàm lượng rotundin có trong củ một số loài Bình vôi
1.4. Sinh lý nẩy mầm của hạt và ƣu điểm nhƣợc điểm, một số yếu tố ảnh hƣởng
tới nhân giống hữu tính
1.4.1. Sinh lý học nẩy mầm củ hạt
1. 4.2. Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống hữu tính
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính
1.5. Hƣớng dẫn của tổ chức y tế thế giới (WHO) thực hiện thực hành tốt trồng cây
thuốc
1.5.1. Nhận dạng/ xác định cây thuốc được trồng
3
3
3
4
4
7

7
7
8
9
11
11

11
11
13


17



1.5.2. Hạt giống và các vật liệu nhân giống khác
1.5.3. Trồng trọt
1.5.4. Thu hái
1.5.5. Nhân sự
17
18
21
23

Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
24
2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu
2.1.3. Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn
24
24
24
25
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
25
2.2.1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S.glabra
25
2.2.2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ Bình
vôi theo năm tuổi và theo các mùa trong năm
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
28

31
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
32
3.1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S. glabra
3.1.1. Xác định thời điểm thu hái, hạt đạt tiêu chuẩn
3.1.2. Lựa chọn cách bảo quản hạt
3.1.3. Lựa chọn phương pháp xử lý hạt và thời hạn bảo quản hạt
3.1.4. Lựa chọn công thức dinh dưỡng bầu
3.1.5. Xác định mức độ che bóng cây con
3.1.6. Tiêu chuẩn cây con trước khi đem trồng
3.2. Sự thay đổi hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin trong của Bình vôi
(S. glabra) theo tuổi và theo các mùa trong năm
3.2.1. Khảo sát sự thay đổi khối lượng củ theo tuổi
3.2.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong củ S. glabra theo tuổi
3.2.3. Định lượng alcaloid toàn phần trong củ theo các mùa trong năm ở cây trưởng

thành
32
32
33
34
35
37
40
41
41
41
43

44



3.2.4. Định lượng rotundin trong củ theo năm tuổi
3.2.5. Định lượng rotundin trong củ theo các mùa trong năm ở mẫu củ trưởng thành
45
50


Chƣơng 4. BÀN LUẬN
4.1. Về xây dựng quy trình nhân giống hữu tính
4.2. Về sự thay đổi hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin theo tuổi và theo
mùa trong năm


52

52
54

KẾT LUẬN
ĐỀ XUẤT
57
59

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC





1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bình vôi (Stephania Lour.) là một chi lớn trên thế giới, được phân bố
chủ yếu ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan…Việt Nam có
khoảng 20 loài Bình vôi, Bình vôi là dược liệu được sử dụng nhiều trong Y Dược
học cổ truyền và trong công nghiệp chiết xuất rotundin để làm nguyên liệu bào
chế thuốc tân dược với tác dụng an thần, gây ngủ. Tại công ty CP dược TW
Mediplantex hàng năm có nhu cầu khoảng 3 tấn vị thuốc Bình vôi khô (tương
đương khoảng 40 tấn Bình vôi tươi) và khoảng 1000 tấn Bình vôi tươi để chiết
xuất lấy 3000 kg rotundin.
Qua các tài liệu nghiên cứu về hàm lượng rotundin trong các loài Stephania
ở Việt Nam có nhiều loài có hàm lượng cao như S. brachyandra, S.
kuinanensis, S. kwangsiensis, S. glabra [21], [29]. Một số loài có hàm lượng

rotundin thấp như S. dielsiana, S. venosa [14]. Thậm chí một số loài hầu như
không có rotundin như S. pierrei [14].
Qua khảo sát thấy rằng loài S. brachyandra mọc ở Sa Pa, Lào Cai là loài có
hàm lượng rotundin cao nhất nhưng loài này không thích hợp để trồng lớn do đặc
điểm của loài này khối lượng củ tăng chậm theo năm tuổi và khó lựa chọn được
vùng trồng có khí hậu như Sapa. Trong các loài có hàm lượng rotundin cao còn lại
thì loài S. glabra qua khảo sát có nhiều đặc điểm thích hợp để phát triển hơn cả.
Loài này được đưa vào DĐVN IV, có hàm lượng rotundin khá cao và đặc điểm
sinh học phù hợp với các điều kiện để phát triển vùng trồng lớn tại vùng đồi núi
thấp phía Bắc.
Chính vì vậy Công ty CP dược trung ương Mediplantex đã chọn loài
S. glabra trong đề xuất và được giao thực hiện đề tài cấp nhà nước: “Khai thác
phát triển nguồn gen một số loài Bình vôi (Stephania spp.) tạo nguyên liệu
làm thuốc” để chủ động cho nguồn nguyên liệu Bình vôi và chất lượng nguyên
liệu đạt tiêu chuẩn, tránh sự nhầm lẫm giữa các loài Bình vôi làm ảnh hưởng tới
chất lượng sản phẩm của công ty và góp phần bảo tồn bền vững nguồn gen.

2


Vì các lý do trên Luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu nhân giống hữu tính và
đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid trong củ cây Bình vôi Stephania
glabra (Roxb.) Miers, theo năm tuổi và theo mùa trong năm” đã được thực
hiện với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính và tiêu chuẩn cây giống Bình vôi
Stephania glabra (Roxb.) Miers
2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ
cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb.) Miers, theo năm tuổi và các mùa trong
năm.

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ NHU CẦU SỬ DỤNG BÌNH VÔI
1.1.1. Tình hình khai thác
Trữ lượng Bình vôi ở Việt Nam trước đây rất phong phú, gần 10 năm trở
lại đây, do bị khai thác ồ ạt bán qua biên giới và sử dụng trong nước, nên nguồn
nguyên liệu này bị cạn kiệt nhanh chóng. Hiện nay, giá của rotundin đã tăng lên
khoảng 10.000.000đ/kg, 1000 kg Bình vôi chiết được khoảng 2-3 kg rotundin. Giá
thu mua cao cũng là một trong những nguyên nhân làm cho củ Bình vôi ngày
càng bị khai thác cạn kiện. Bên cạnh đó phần lớn Bình vôi được các tiểu thương
thu mua và bán sang Trung Quốc qua đường tiểu ngạch. Bình vôi tự nhiên bị thu

mua và khai thác tự do không có quản lý và bảo tồn đã làm cho cạn kiện nguồn tài
nguyên. Cũng chính vì bị khai thác quá mức dẫn tới nguy cơ tuyệt chủng mà 3
loài Bình vôi (loài S. brachyandra Diels, S. cepharantha và S. dielsiana Y. C.
Wu) đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam ở mức EN (Endangered) [23], được xếp
trong nhóm IIA Nghị định 32/2006CP. Bộ NN&PTNT và lãnh đạo các tỉnh đã chỉ
đạo cấm không được khai thác Bình vôi. Như vậy vấn đề bảo vệ và khai thác hợp
lý có quy hoạch từng loài Bình vôi cụ thể ở Việt Nam đang là vấn đề cấp thiết
hiện nay.
1.1.2. Nhu cầu sử dụng
Bình vôi là loại dược liệu quý được sử dụng trong Y dược học cổ truyền và
trong chiết xuất nguyên liệu rotundin. Trong Y dược học cổ truyền Bình vôi được
thái nhỏ, phơi khô dùng dưới dạng thuốc sắc, ngâm rượu chữa hen, ho lao, lỵ, sốt,
đau bụng, đau dạ dày, an thần kinh [19], nhu cầu sử dụng vị thuốc Bình vôi trong
Y Dược học cổ truyền hàng năm ước tính đến hàng trăm tấn Bình vôi khô.


4


Hình 1.1: Vị thuốc Bình vôi dùng trong Y Dược học cổ truyền
Ở trong nước hằng năm ước tính nhu cầu về Bình vôi để chiết xuất rotundin
đến hàng ngàn tấn (theo số liệu của các doanh nghiệp Dược sản xuất thuốc có hoạt
chất rotundin). Trong khi đó Bình vôi thu hái từ tự nhiên trên cả nước chỉ đáp ứng
được khoảng vài trăm tấn/năm. Các doanh nghiệp trong nước hiện nay phải mua
rotundin của Trung Quốc. Đây là nguyên nhân khiến cho các doanh nghiệp sản
xuất trong nước không chủ động được nguồn nguyên liệu ảnh hưởng tới giá thành
sản xuất và chất lượng sản phẩm không ổn định.
1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC LOÀI
Stephania glabra (Roxb.) Miers
1.2.1. Đặc điểm thực vật

Loài Bình vôi S. glabra là cây dây leo, cây lâu năm có thể dài tới 5-15m,
hoặc hơn. Toàn thân nhẵn, nhựa từ thân và lá không mang màu. Thân rễ phình to
thành củ, có dạng hình cầu hay bất định, kích thước lớn, đường kính thân có thể
lên tới 60 cm, khối lượng củ có thể lên đến 30-170 kg. Lá đơn, mọc so le, mép lá
nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá. Toàn thân và lá không có lông. Cuống
lá dài 5-10cm, gốc cuống lá hơi phình lên và cong. Phiến lá to, hình tim với gốc lá
phẳng hoặc hơi lõm, ngọn lá thuôn nhọn, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh lợt.
Gân lá có khoảng 11, xếp tỏa tròn do cuống lá đính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc lá
[1], [10].
5

Cụm hoa đực dạng xim tán kép, cụm hoa càng về gốc cuống lá càng dài (3-
12cm). Mỗi cuống cụm hoa mang từ 5-8 tán, mỗi tán mang 8 tán cấp 2, mỗi cuống
tán cấp 2 lại mang 4 tán cấp 3, kết thúc gồm 3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn
(1-2 mm). hoa đực: đài 6, rời, hình trứng hẹp (phía móng hơi thu hẹp lại), xếp
thành 2 vòng (mỗi vòng 3) gần như bằng nhau, chiều dài 1,5mm. Hoa 3 cánh,
hình trứng, màu xanh lá khi còn trong nụ và màu vàng khi hoa nở, dài 0,8 – 1 mm,
rộng 1,2 mm. Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ, bao phấn 6, màu vàng nhạt xếp thành
vòng tròn đường kính 0,6 - 1mm trên 1 trụ do chỉ nhị hàn liền biến thành cột ngắn
0,5-1 mm. Khi hoa nở các bao phấn mở nắp ngang quay ra xung quanh. Hạt phấn
nhỏ màu vàng. Khi hoa già các bao phấn tạo thành 1 viên tròn như vành khăn màu
nâu sẫm hoặc thâm đen [14], [29]
Cụm hoa cái dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa
xếp xít vào nhau thành dạng đầu. Mỗi đầu gồm 20-70 bông hoa. Cuống cụm hoa
dài 2-5 cm. Hoa cái không đều, đài 1, hình elip, dài khoảng 1mm; cánh hoa 2,
hình gần tròn, đường kính 1-1,2 mm; đài và cánh hoa xếp lệch về 1 phía của hoa.
Bầu hình trứng, núm nhụy chia 4-5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như không có vòi
nhụy. Quả hạch, hình trứng ngược dài 5 - 6 mm, rộng 4-5mm. Vỏ quả ngoài nhẵn,
lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng đến đỏ sẫm khi chín. Hạt hình trứng
ngược, cụt một đầu, vỏ hạch cứng chia nhiều vạch (17- 20 vạch). Giá noãn có lỗ

thủng ở giữa [10], [14], [19].
Loài Bình vôi S. glabra thường được phân bố: Hà Tây, Hòa Bình, Hà
Giang, Tuyên Quang, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn,
Thanh Hóa, Côn Đảo [2], [19], [21], [27], [29].



6









1. Củ 2. Hạt

3. Cành mang hoa đực 4. Hoa cái và quả
Hình 1.2. Hình loài S. glabra (Roxb.) Miers [30]


Hình 1.3: Cây Bình vôi Stephania glabra (Roxb.) Miers mọc tự nhiên


7

1.2.2. Thành phần hóa học
1.2.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới

- Thành phần hóa học trong củ Bình vôi gồm có alcaloid, flavonoid tinh bột,
đường khử, acid malic, men oxydase [31], [34], [35]. Trong đó alcaloid là thành
phần chính và được quan tâm nhiều nhất.
- Cho đến nay đã có trên 300 alcaloid được phân lập và xác định cấu trúc hóa học
từ các loài thuộc chi Stephania Lour. Từ loài S. glabra đã phân lập được một số
alcaloid như: rotundin, promeferin, grindarin, grindaricin, gindarinin, hyndarin,
magnoflorin, roemerin, stephararin, cycleanin, stepholidin, stepharin, palmatin,
dehydrocorydalmin, stephranin [31], [32], [33], [34].
1.2.2.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài S. glabra tại Việt Nam
Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững đã phân lập được 2 alcaloid từ loài S. glabra là
rotundin và roemerin [30].
1.3. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG, HÀM LƯỢNG ALCALOID TOÀN
PHẦN VÀ ROTUNDIN CỦA MỘT SỐ LOÀI BÌNH VÔI Ở VIỆT NAM
1.3.1. Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần
- Phương pháp cân [16], [17]: Phải chiết được alcaloid tinh khiết bằng dung môi
thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cặn tới khối lượng không đổi đem cân
- Phương pháp trung hòa [6], [16], [17]: Chiết alcaloid ở dạng base, dung dịch
phải trong, không lẫn các chất kiềm, amin, chất béo, chất màu vì sẽ gây sai số
thừa. Phương pháp này được DĐVN III công bố trong chuyên luân dược liệu Bình
vôi chỉ tiêu định lượng “Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu. Thấm ẩm bằng
amoinac 6N trong 2 giờ. Sau cho vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform cho đến
hết alcaloid cất thu hồi cloroform, hòa tan cắn trong acid clohydric 5%, (5-7 lần
mỗi lần 5ml). Rửa dịch chiết bằng ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml, kiềm hóa
bằng amoniac 6N đến pH 10-11. Chiết bằng cloroform 5 lần, mỗi lần 10 ml để lấy
hết alcaloid. Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính. Bốc hơi
dịch chiết tới khô. Hòa tan cắn với 1 lượng chính xác 20,0 ml dung dịch acid
sulfuric 0,1 N. Định lượng acid dư bằng dung dịch kali hydroxyd 0,1N với chỉ thị
8

đỏ methyl. Hàm lượng alcaloid toàn phần được tính theo rotundin, 1ml dung dịch

acid sulfuric 0,1 N tương ứng với 0,071 g rotundin (C
21
H
25
O
4
N). Tỷ lệ phần trăm
alcaloid toàn phần (X %) trong mẫu được tính theo công thức sau:

 

  





V: số ml NaOH 0,1N dùng để trung hòa H
2
SO
4
0,1N dư.
M: số gam dược liệu khô tuyệt đối (đã trừ độ ẩm )
- Phương pháp so màu [16], [17]: Hầu hết các alcaloid không có màu nhưng có
màu nhưng có thể tiến hành theo nguyên tắc: (i) Dựa vào phản ứng tạo màu của
alcaloid, dung dịch có màu để định lượng; (ii) Cho alcaloid tác dụng với thuốc thử
tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan tủa trong dung môi thích hợp sẽ
được dung dịch có màu để định lượng; (iii) Biến đổi alcaloid thành một dẫn chất
có màu để tiến hành so màu
1.3.2. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong một số loài Bình vôi

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã công bố hàm lượng alcaloid toàn phần từ 3
loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần
(nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững)
Stt
Tên loài
Nơi thu hái
HL alcaloid toàn phần (%)
1
S. glabra (Roxb.) Miers
Ninh Bình
2,96
2
S. kuinanensis H.S.Lo
Lạng Sơn
4,41
3
Stephania sp3.
Quảng Ninh
2,32

Năm 2002, Lã Đình Mỡi [21], đã khảo sát hàm lượng alcaloid toàn phần trong 5
loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1.2)



9

Bảng 1.2. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần
(nghiên cứu của Lã Đình Mỡi)

Stt
Tên loài
Nơi thu hái
HL alcaloid
toàn phần (%)
1
S. brachyandra Diels.
Sapa - Lào Cai
6,9
2
S. glabra (Roxb.) Miers
Mai Châu - Hòa Bình
3,4
3
S. sinica Diels.
Tam Điệp - Ninh Bình
3,6
4
S. kwangsiensis H.S.Lo
Cẩm Phả - Quảng Ninh
3,5
5
S. hainanensis H.S.Lo
Hà Nam - Ninh Bình
2,6

1.3.3. Phương pháp định lượng rotundin
Trước đây, một số tác giả đã định lượng rotundin bằng nhiều phương pháp khác nhau
như: chuẩn độ thể tích bằng AgNO
3

, dựa vào mật độ quang, dựa vào diện tích vết sắc
ký qua phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao [23], sắc ký lỏng hiệu năng cao
[8].
- Phương pháp chuẩn độ thể tích bằng AgNO
3
[8] Chuyên luận nguyên liệu rotundin
DĐVN IV (phương pháp này chỉ áp dụng được cho mẫu tinh khiết )
- Phương pháp đo mật độ quang gồm các bước: Xử lý mẫu. Tiến hành sắc ký lớp
mỏng hệ Cloroform – Methanol (9:1) đối với mẫu thử, chuẩn rotundin. Xác định vết
có hệ số R
f
tương ứng với rotundin chuẩn ở bước sóng 366nm, cạo vết và phản hấp
phụ bằng Ethanol. Xác định mật độ quang của mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng tại
bước sóng 289 nm.Tính % rotundin có trong dược liệu.
- Phương pháp định lượng rotundin trong viên Sen vông- R bằng phương pháp đo
diện tích vết HPTCL[23]. Tóm tắt các bước như sau:
Xử lý mẫu.Tiến hành sắc lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform: Aceton:
Diethylamin (10:10:2) song song với chuẩn rotundin ở nồng độ phù hợp. Phun thuốc
thử hiện màu Dragendoff lên bản mỏng. Bản mỏng sau khi hiện màu được đưa lên
máy quét ảnh để thu được hình ảnh các vết, đo diện tích (độ rộng và độ đậm) vết
bằng phần mềm photoshop. Lập tương quan giữa diện tích vết và logarit nồng độ
mẫu bằng phần mềm excel. Nồng độ mẫu thử được tính theo công thức:

10


(Với C
x
, C
o

lần lượt là nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn; V
x,
V
o
lần lượt là tích độ
rộng và độ đậm của các vết).
- Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, DĐVN IV
Pha động: Dung dịch đệm pH 4,5 - acetonitril (70 : 30), điều chỉnh nếu cần. Lọc
qua màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm, lắc siêu âm.
Dung dịch chuẩn: Hoà tan rotundin chuẩn trong pha động để thu được dung dịch
có nồng độ khoảng 0,05 mg/ml.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu chuyển vào một túi giấy
lọc. Thấm ẩm bằng 0,5 ml dung dịch amoniac 6 N (TT), để yên trong 30 phút.
Chuyển túi giấy lọc vào bình Soxhlet dung tích 100 ml, thêm 30 ml cloroform
(TT), chiết trong 4 giờ đến hết alcaloid. Lấy dịch chiết cô trên cách thuỷ tới cắn,
hòa tan cắn trong dung dịch acid sulfurric 5 N (TT) (5 lần, mỗi lần 10 ml). Lọc
qua giấy lọc vào bình gạn. Kiềm hoá dịch lọc bằng amoniac đặc (TT) đến pH 10.
Chiết bằng cloroform (TT) 4 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết cloroform,
bốc hơi trên cách thuỷ đến cắn khô. Dùng pha động hoà tan cắn và chuyển vào
bình định mức 500 ml, thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc thường,
bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Phần dịch lọc còn lại tiếp tục lọc một lần nữa qua giấy lọc
có cỡ lỗ 0,45 µm được dung dịch thử.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (15 cm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 m)
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 283 nm.
Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 l.
Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Dựa vào diện
tích (hay chiều cao) pic thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và nồng độ
rotundin(C

21
H
25
NO
4
) của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng rotundin(C
21
H
25
NO
4
)
trong dược liệu.
11

1.3.4. Hàm lượng rotundin trong một số loài Bình vôi
Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã xác định hàm lượng rotundin trong 3 loài
Bình vôi nghiên cứu bằng phương pháp đo quang.
Bảng 1.3. Kết quả định lượng rotundin (nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững)
Stt
Tên loài
Nơi thu hái
Hàm lượng rotundin (%)
1
S. glabra (Roxb.) Miers
Ninh Bình
0,59
2
S. kuinanensis H.S.Lo
Lạng Sơn

3,06
3
Stephania sp3.
Quảng Ninh
1,52

Năm 2002, Lã Đình Mỡi [21] đã khảo sát hàm lượng rotundin trong 5 loài Bình
vôi (Bảng 1.4)
Bảng 1.4. Kết quả định lượng rotundin (nghiên cứu của Lã Đình Mỡi)
Stt
Tên loài
Nơi thu hái
HL
rotundin
(%)
HL rotundin so
với alcaloid toàn
phần (%)
1
S. brachyandra Diels.
Sapa, Lào Cai
3,7
50,1
2
S. glabra (Roxb.) Miers
Mai Châu, Hòa Bình
2,1
50,0
3
S. sinica Diels.

Tam Điệp, Ninh Bình
1,4
46,4
4
S. kwangsiensis
H.S.Lo
Cẩm Phả, Quảng Ninh
1,8
50,5
5
S. hainanensis H.S.Lo
Hà Nam - Ninh Bình
0,6
18,3

1.4. SINH LÝ NẨY MẦM CỦA HẠT VÀ ƯU NHƯỢC ĐIỂM VÀ MỘT SỐ
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH
1.4.1. Sinh lý nẩy mầm của hạt [21]
1.4.1.1. Sự hút nước: Hút nước là quá trình ñầu tiên của sự nảy mầm, quá trình
này phụ thuộc vào 3 yếu tố: Thành phần các chất có trong hạt, khả năng thấm của
vỏ hạt, lượng nước hữu hiệu và hoạt động của enzyme ngay sau khi hút nước đã
tạo ra thay đổi và quá trình trao đổi chất xảy ra.
12

1.4.1.2. Phá vỡ các mô dự trữ: bằng các phản ứng hoá học phá vỡ các mô dự trữ
và tổng hợp vật chất mới được chứng minh bằng các pha hoạt động của enzim bao
gồm tổng hợp các enzim phân giải chất dự trữ như α -amylase, ribonuleases, endo
- β gluconase và photphatase.
1.4.1.3. Khởi đầu sinh trưởng của phôi: Trong thời gian đầu của sự nảy mầm có
đặc điểm là giảm khối lượng chất khô của nội nhũ và đồng thời tăng trọng lượng

chất khô của trục phôi. Sự thay đổi này là giảm nitơ tổng số và protein hoà tan
xảy ra ở nội nhũ và sự chuyển dời hợp chất này đến trục mầm. Sự thay đổi tương
tự sẽ được thực hiện theo sau là sự thuỷ phân tinh bột nội nhũ thành maltose và
sau đó thành glucose.
1.4.1.4. Sự xuất hiện của rễ: Khi xuất hiện rễ thật quá trình nảy mầm được hình
thành nó xuất hiện có kết quả kéo dài và phân chia tế bào. Nhìn chung sự kéo dài
tế bào xảy ra trước sự phân chia tế bào. Bởi vậy sự xuất hiện của rễ xuyên qua vỏ
hạt khởi đầu bởi do kéo dài tế bào tiếp theo là phân chia thân ở hầu hết các hạt.
1.4.1.5. Hình thành cây con: Cây con tự nó được hình thành khi bắt đầu hút nước
và quang hợp. Khởi đầu trải qua một giai đoạn thay đổi trạng thái khi tự nó tạo ra
một ít dinh dưỡng cho nó, nó vẫn phụ thuộc mô dinh dưỡng từ các mô dự trữ. Khi
cây con hoàn chỉnh và bám chắc được vào đất nó bắt đầu hút nước và tạo ra hầu
hết dinh dưỡng cho nó dần dần trở lên sống tự lập và quá trình nảy mầm hoàn
thành
- Các yếu tố ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt: Đã có hạt tốt rồi, khi gieo,
hạt có thể mọc được hay không lại còn tùy một số điều kiện như:
+ Đủ ôxy: Đất gieo hạt phải tơi, xốp, thoáng khí, khi gieo hạt không lấp hạt quá
sâu.
+ Đủ nước (độ ẩm 60 - 70%).
+ Đủ nhiệt: Mỗi loại hạt có một nhiệt độ thích hợp cho chúng nảy mầm khác
nhau.
+ Không có sâu bệnh phá hại hạt.
13

Hai điều kiện là ôxy (không khí) và độ ẩm quan trọng, nếu đảm bảo 2 yếu tố này
thì hạt có thể nảy mầm tốt. Nhưng thực tế thì hai điều kiện này lại thường mâu
thuẫn với nhau nếu ẩm quá thì thiếu ôxy và nhiều ôxy quá thì lại hay thiếu độ ẩm.
Giải quyết mâu thuẫn này bằng cách gieo hạt ở đất có nhiều mùn, nhiều cát, đặt
hạt ở độ sâu thích hợp, không quá nông, hoặc quá sâu, thường độ sâu không quá
3 - 4 lần đường kính của hạt, tưới nhẹ để có độ ẩm, phủ rác bồi lên trên mặt đất

khi gieo xong.
1.4.2. Ưu nhược điểm của quá trình nhân giống hữu tính [2], [3], [4], [5], [22],
[25, [26];
Ưu điểm:
- Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện.
- Cây có bộ rễ phát triển mạnh, tuổi thọ thường cao hơn các phương pháp nhân
giống khác.
- Cây nhân giống từ hạt sinh trưởng khỏe, tính chống chịu với ngoại cảnh cao
- Hệ số nhân giống cao.
- Chí phí sản xuất thấp hơn so với các phương pháp khác.
Nhược điểm:
Nhiều biến dị, ví dụ như cây mẹ tốt nhưng cây con có thể xấu. Những cây con
nhân giống từ một cây mẹ nhưng lại rất khác nhau, sản lượng và chất lượng không
giống nhau.
Một số lưu ý trong quá trình nhân giống cây con từ hạt
- Kiểm tra sức nảy mầm của hạt trước khi gieo: Phương pháp thực hiện là tùy
từng loại hạt giống khác nhau mà chúng ta có thể lấy từ vài chục hạt đến hàng
trăm hạt từ các vị trí khác nhau đại diện cho lô hạt để gieo thử. Nếu tỉ lệ nảy mầm
dưới 50% thì cần có các biện pháp xử lý để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của lô hạt. Do
biết tỉ lệ nảy mầm có thể điều chỉnh lượng hạt cần gieo
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính
1.4.3.1. Ảnh hưởng của chất lượng hạt giống
Hạt giống phải có chất lượng tốt thì tỉ lệ nảy mẩm sẽ cao (điều kiện cần).
14

1.4.3.2. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt [3], [4], [5], [6], [33]
Trong thực tế thường sử dụng 3 phương pháp xử lý sau:
- Phương pháp vật lý:
Phương pháp này thường được áp dụng phổ biến. Nhiệt độ cao làm cho hạt nứt nẻ
hoặc mềm ra, nước và không khí dễ thấm qua vỏ hạt, quá trình sinh lý dược xúc

tiến mạnh hơn, hạt nẩy mầm nhanh, đều và diệt trừ mầm mống sâu bệnh lẫn trong
hạt. Có nhiều hình thức tạo nhiệt độ cao như nước nóng, đốt …Trong thực tiễn
sản xuất cây giống lâm nghiệm thì phương pháp tạo nhiệt độ bằng nước nóng
được áp dụng phổ biến và rất hiệu quả đối với nhiều hạt giống.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Làm sạch
+ Sơ bộ kiểm tra hạt.
+ Sàng, sảy, loại bỏ các hạt kém chất lượng.
+ Rửa hạt bằng nước sinh hoạt 2 -3 lần.
Bước 2: Khử trùng hạt: Ngâm hạt bằng thuốc tím nồng độ 0,05% (0,5 gam thuốc
trong 1 lít nước) trong 15 - 20 phút, vớt hạt, rửa lại bằng nước sinh hoạt đến khi
sạch.
Bước 3: Ngâm hạt trong nước nóng: Nhiệt độ 40 - 45
o
C trong khoảng từ 6 – 20
giờ (duy trì nhiệt độ trong thời gian ngâm hạt, thời gian phụ thuộc vào từng loại
hạt), hết thời gian ngâm, rửa lại hạt, để ráo nước đem ủ.
Bước 4: Ủ và rửa chua hạt
+ Cho hạt vào túi vải và ử trong tro bếp hoặc cát ẩm
+ Hàng ngày rửa chua hạt thấy hạt nứt nanh đem gieo
- Phương pháp cơ học
Phương pháp này áp dụng cho những loại hạt vỏ dày, cứng khó thẩm nước. Tác
động bằng cách đập, khía hạt, cắt …. Sau đó ngâm hạt trong nước 2 sôi 3 lạnh.
Phương pháp này ít được dùng trong sản xuất vì năng suất lao động thấp, hạt dễ bị
tổn thương, nhiễm bệnh hại.
- Phương pháp xử lý hạt bằng hóa chất