Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên động vật thực nghiệm của phân đoạn chiết chloroform từ thân cây ý dĩ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.68 MB, 103 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ ĐÔNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE
HUYẾT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM
TỪ THÂN CÂY Ý DĨ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ ĐÔNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE
HUYẾT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM
TỪ THÂN CÂY Ý DĨ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ SỐ: 60 72 04 08
Người hướng dẫn khoa học: TS. Phùng Thanh Hương
HÀ NỘI 2013
Lời cảm ơn
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, các em và các
bạn.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới Ts. Phùng Thanh Hương, người thày luôn sát cánh tận tình
hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Trường đại học Dược Hà
Nội, trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo điều kiện cho tôi
được học tập và nghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lý, Phòng sau đại
học trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược trường Cao đẳng Dược
Trung ương Hải Dương, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thày cô giáo, anh, chị, em kỹ thuật viên Bộ môn Hóa
sinh, Bộ môn Dược lý trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược trường
Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực
nghiệm tại Bộ môn
Xin gửi lới cảm ơn tới bạn bè, các anh chị em đồng nghiệp trường Cao
đẳng Dược trung ương Hải Dương, các bạn trong lớp Cao học 16 đã động viên
và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn.
Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn giành tặng cho những người thân trong
gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và giành mọi thời gian để tôi học
tập làm việc và hoàn thành luận văn này.
HV. Nguyễn Thị Đông
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
TRANG
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 3
TỔNG QUAN 3
1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 3
1.1.1. Định nghĩa, phân loại và tiêu chuẩn chẩn đoán 3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh 4
1.1.2.1. Bệnh sinh đái tháo đường typ 1 4
1.1.2.2. Bệnh sinh đái tháo đường typ 2 6
1.1.3. Hướng tác dụng của thuốc điều trị đái tháo đường 9
1.1.3.1. Insulin [1] 9
1.1.3.2. Các thuốc làm tăng cường lượng insulin 9
1.1.3.3. Các thuốc tăng cường tác dụng của insulin ở mô đích 11
1.1.3.3. Các thuốc làm ức chế tiêu hóa hấp thu glucid 13
1.1.3.4. Các thuốc có tác dụng tương tự insulin trong điều hòa chuyển hóa
glucid 13
1.2. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT THỰC NGHIỆM.14
1.2.2. Đái tháo đường do di truyền 15
1.2.3. Động vật đái tháo đường typ 2 do chế độ dinh dưỡng 15
1.3. CÂY Ý DĨ 16
1.3.1. Đặc điểm hình thái 17
1.3.2. Phân bố 17
1.3.3. Thu hái 18
1.3.4. Bộ phận dùng 18
1.3.5. Thành phần hóa học 18
1.3.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý 18
1.3.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng dược lý của cây Ý dĩ 18
1.3.6.2. Các nghiên cứu trong nước liên quan đến tác dụng hạ glucose huyết
của thân cây Ý dĩ 19
Chương 2 21
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 22
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu 22
2.1.2. Động vật thí nghiệm 22
2.1.3. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 23
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ 23
2.1.3.2. Hóa chất nghiên cứu 23
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu và điều chế mẫu thử 24
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột thực nghiệm 26
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột nhắt trắng bình thường
27
2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột nhắt trắng tăng glucose
huyết thực nghiệm bằng STZ 27
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột cống trắng gây ĐTĐ typ
2 thực nghiệm 28
2.2.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh 30
2.2.3.1. Định lượng glucose huyết 30
2.2.3.2. Định lượng insulin huyết thanh 31
2.2.3.3. Xác định hoạt độ enzym G6Pase gan 32
2.2.3.4. Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B in vitro của
HDCL 34
2.2.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học 36
2.2.5. Xử lý số liệu 36
Chương 3 37
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37
3.1. Tác dụng của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ trên chuột nhắt
trắng bình thường 37_Toc371443689
3.2. Tác dụng của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ trên chuột nhắt
trắng tăng glucose huyết bằng streptozocin 38
3.2.1. Tác dụng trên mô hình tăng glucose huyết bởi STZ liều 200mg/kg 38
3.2.2. Tác dụng trên mô hình tăng glucose huyết bởi STZ liều 150mg/kg 39
3.2.2.1. Kết quả định lượng glucose huyết 40
3.2.2.2. Kết quả định lượng insulin huyết thanh 41
3.3. Kết quả ảnh hưởng của HDCL trên chuột cống trắng gây ĐTĐ typ 2
thực nghiệm 45
3.3.1. Kết quả về glucose huyết 45
3.3.2. Kết quả định lượng insulin huyết thanh 46
3.3.3. Kết quả hoạt độ enzym G6Pase gan 47
3.3.4. Kết quả trên mô bệnh học tụy 48
3.4. Kết quả ảnh hưởng của HDCL trên khả năng dung nạp glucose của
chuột cống ĐTĐ typ 2 51
3.5. Kết quả đánh giá khả năng ức chế PTP1B in vitro 53
Chương 4 55
BÀN LUẬN 55
4.1. VỀ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT
CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ 55
4.2. VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT
CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ 59
ĐỀ XUẤT 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CTLA-4
Cytotoxic T lymphocyte antigen-4
DM:
Dung môi
DPP4
Dipeptidyl-peptidase-4)
ĐTĐ:
Đái tháo đường
FFA:
Free fatty acid (acid béo tự do)
GLP:
Glucagon like peptide
GLUT:
Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose)
HDCL:
Hỗn dịch pha từ cắn phân đoạn chiết chloroform
IR:
Insulin receptor
IRS:
Insulin receptor substrate
LHA:
Human leucocyte antigen (kháng nguyên bạch cầu người)
PĐC:
Cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ
PEPCK:
Phosphoenol pyruvate carboxykinase
pHPS:
Para hydroxybenzen sulfonic acid
PPAR:
Peroxisome proliferator activator receptor
PTP1B:
Protein tyrosine phosphatase 1B
SGLT1:
Sodium-glucose linked transporter
STZ:
Streptozocin
TNF:
Tumor necrosis factor
DANH MỤC BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm.29
Bảng 2.2. Thành phần của các dung dịch insulin chuẩn……………… ………31
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng trên PTP1B 35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HDCL đến glucose huyết của chuột nhắt trắng bình
thường 37
Bảng 3.2. Nồng độ glucose huyết của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bởi
STZ liều 200 mg/kg 38
Bảng 3.3. Nồng độ glucose huyết của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bởi
STZ liều 150 mg/kg…………………………………………………………………….40
Bảng 3.4. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết
bởi STZ liều 150mg/kg…………………………………………………………………42
Bảng 3.5. Hoạt độ enzym G6Pase của chuột gây tăng glucose huyết bởi STZ liều
150 mg/kg………………………………………………………………………………44
Bảng 3.6. Nồng độ glucose huyết của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống
mẫu thử…………………………………………………………………………………45
Bảng 3.7. Hoạt độ G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu
thử…………………………………………….…………… ……………………… 48
Bảng 3.8. Mức độ ức chế PTP1B của các nồng độ cắn phân đoạn chiết
chloroform thân cây Ý dĩ 54
DANH MỤC HÌNH TRANG
Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin…………………………….… 7
Hình 1.2. Hình ảnh cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi (L). var. ma-yuen Stapf……17
Hình 2.1. Hình ảnh thân cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi (L). var. ma-yuen Stapf)22
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn chloroform thân cây Ý dĩ… 25
Hình 2.3. Tóm tắt quy trình định lượng insulin……………………… ………….32
Hình 3.1. Mức độ hạ glucose huyết của các lô chuột trên mô hình tăng glucose
huyết bởi STZ liều 200 mg/kg………………………………………………………39
Hình 3.2. Mức độ hạ glucose huyết của các lô chuột nhắt trắng trên mô hình gây
tăng glucose huyết bởi STZ liều 150 mg/kg……………………………….…….…41
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ
insulin……………………………………………….……………… 42
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và lượng phospho
vô cơ…………………………………… ………………………………… …… 43
Hình 3.5. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống bị ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày
uống mẫu thử………………………….……………………………………… ….….46
Hình 3.6. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô chứng âm, ( nhuộm HE x 400
lần)…………………………………………………………………………………… 48
Hình 3.7. Ảnh vi thể tụy của lô thử (nhuộm HE x 400 lần)………………. ….…49
Hình 3.8. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô chứng dương (nhuộm HE x 400 lần).50
Hình 3.9. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô 4 (chuột bình thường ăn chế độ bình
thường (nhuộm HE x 400 lần)……………………… …………………………… 51
Hình 3.10. Sự thay đổi nồng độ glucose huyết của chuột cống ĐTĐ typ 2 trong
test dung nạp glucose…………………………………………………………………52
Hình 3.11. Khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 2 giờ
uống mẫu thử 53
Hình 4.1. Tiêu bản mô học tiểu đảo tụy của người bình thường, người bệnh béo
phì không ĐTĐ, người bệnh ĐTĐ typ 2……………… ………………………….61
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng
glucose huyết kèm theo nhiều biểu hiện rối loạn chuyển hoá. Hậu quả của sự
tăng glucose huyết là những biến chứng nghiêm trọng có thể đe dọa đến tính
mạng của người bệnh [1]. Theo nghiên cứu của Martin Shilink và cộng sự, năm
2010, số lượng bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ là 285 triệu người, chiếm 6,4% dân số
thế giới và vẫn tiếp tục gia tăng mạnh [34]. Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người
mắc bệnh đái tháo đường hiện nay đang là một gánh nặng cho ngành y tế. Chi
phí để quản lý, chăm sóc và điều trị bệnh rất tốn kém. Theo công bố của tổ chức
y tế thế giới, chi phí trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng
153- 286 tỷ đô la, thậm chí còn cao hơn thế, ước tính đến năm 2025, toàn bộ chi
phí cho bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới là 213- 396 tỷ đô la, chiếm khoảng 7- 13%
ngân sách chăm sóc sức khoẻ của thế giới [34]. Điều này sẽ gây khó khăn cho
những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Mặt khác, các thuốc điều trị
đái tháo đường có nguồn gốc tổng hợp hoá học thường kèm theo rất nhiều tác
dụng không mong muốn, chi phí điều trị cao và người bệnh có xu hướng phải
tăng liều sau một thời gian dài dùng thuốc [1]. Một câu hỏi được đặt ra là: Làm
thế nào để đáp ứng được nhu cầu sử dụng thuốc ngày càng gia tăng và hạn chế
được những biến chứng gây ra bởi bệnh đái tháo đường trong điều kiện kinh tế
nước ta? Kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu, sản xuất
ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an toàn cao
đang là hướng lựa chọn hợp lý để giải quyết vấn đề này [7]. Từ hướng nghiên
cứu đó, đã có rất nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng
hạ glucose huyết như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh [5], [6], [10].
2
Cây Ý dĩ (Coix lachryma jobi) được biết đến như một loại thực phẩm và
cũng là một vị thuốc [21]. Theo Y học cổ truyền, Ý dĩ có nhiều công dụng như:
lợi sữa, kích thích tiêu hoá, chữa lỵ, viêm khớp, bồi bổ cơ thể [21]. Các nghiên
cứu về tác dụng sinh học của Ý dĩ chủ yếu tập trung vào hạt [22]. Năm 2009,
chúng tôi đã chứng minh được tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nước của
thân cây Ý dĩ trên chuột bị tăng glucose huyết thực nghiệm [3]. Khảo sát tiếp theo
cho thấy tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol
không có sự khác biệt. Từ dịch chiết ethanol, chúng tôi tiến hành chiết xuất và thử
tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết trên một mô hình thực
nghiệm. Kết quả sơ bộ cho thấy phân đoạn chloroform có tác dụng hạ glucose
huyết tốt nhất. Để tiếp tục nghiên cứu về tác dụng hạ glucose huyết và tìm hiểu cơ
chế tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ý dĩ chúng tôi tiến hành đề tài
"Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên động vật thực nghiệm của phân
đoạn chiết chloroform từ thân cây Ý dĩ" với 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform
thân cây Ý dĩ trên động vật thực nghiệm.
2. Bước đầu tìm hiểu cơ chế hạ glucose huyết của phân đoạn chiết
chloroform từ thân cây Ý dĩ.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1.1. Định nghĩa, phân loại và tiêu chuẩn chẩn đoán
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hoá do nhiều nguyên nhân
khác nhau gây nên, đặc trưng của bệnh là tăng glucose huyết mạn tính cùng với
rối loạn chuyển hoá hydratcarbon, lipid, protein do thiếu insulin có kèm hoặc
không kèm kháng insulin với các mức độ khác nhau. Hệ quả của tăng glucose
huyết mạn tính là tổn thương nhiều cơ quan như: Mắt, thận, thần kinh [1]
Theo phân loại của hiệp hội đái tháo đường Mỹ (ADA) năm 2011, ĐTĐ
được chia thành 4 loại: ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2, ĐTĐ thai kỳ và các typ đặc biệt
khác, trong đó thường hay gặp là ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2. Bệnh nhân được
chẩn đoán xác định là mắc bệnh ĐTĐ khi [13]:
- Hemoglobin (A1c) ≥ 6,5% hoặc
- Nồng độ glucose huyết lúc đói 7,0 mmol /L ( 126mg/dL)
- Có các triệu chứng của tăng glucose huyết và nồng độ glucose huyết ở thời
điểm bất kỳ 11,1 mmol /L (200mg/dL) hoặc
- Nồng độ glucose huyết ở thời điểm hai giờ sau nghiệm pháp dung nạp
glucose đường uống 11,1 mmol/L (200mg/dL)
Glucose huyết tăng nhưng không đáp ứng với tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ ở
trên được xếp vào loại rối loạn glucose huyết lúc đói (IFG: impaired fasting
glucose) hoặc rối loạn dung nạp glucose (IGT: impaired glucose tolerance), tùy
thuộc vào loại xét nghiệm đánh giá đã dùng, bệnh nhân được chẩn đoán là tiền
ĐTĐ khi:
4
+ Glucose lúc đói từ 100mg/dL (5,6 mmol/L) đến 125 mg/dL (6,9mmol/L)
(IFG) hoặc
+ Glucose ở thời điểm hai giờ sau khi uống 75 gam glucose, glucose huyết
từ 140mg/dL (7,8 mmol/ L) đến 199mg/dL (11,0 mmol/ L) (IGT) hoặc HbA1c:
5,7 - 6,4 % [13].
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh
1.1.2.1. Bệnh sinh đái tháo đường typ 1
- ĐTĐ typ 1 là tình trạng thiếu insulin tuyệt đối do tế bào beta của đảo tụy
bị tổn thương gây nên [13], [34]. Hầu hết các trường hợp ĐTĐ typ 1 là hậu quả
của sự phá hủy tế bào beta đảo tụy tự miễn gây thiếu hụt không hồi phục nồng
độ insulin trong máu [29].
- Cơ chế bệnh sinh
Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 đầu tiên phải kể đến di truyền có liên
quan chặt chẽ với yếu tố kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte
antigen -HLA). HLA là những phân tử nằm trên bề mặt các tế bào trình diện
kháng nguyên. Hai tập hợp gen HLA có vai trò quan trọng đặc biệt là DR4-DQ8
và DR3-DQ2 được tìm thấy ở hơn 90% người bị ĐTĐ typ 1 [12]. Các cá thể có
kiểu gen chứa 2 tập hợp gen này có nguy cơ mắc ĐTĐ typ 1 cao nhất và khởi
phát bệnh từ rất sớm. Có nhiều giả thiết cho rằng các tập hợp gen HLA nguy cơ
cao nói trên có vai trò trình diện những đoạn peptid đặc hiệu của tiểu đảo tụy cho
lympho T. Gen có vai trò quan trọng thứ hai trong các yếu tố di truyền liên quan
đến bệnh ĐTĐ typ 1 là gen mã hóa insulin nằm trên nhiễm sắc thể số 11. Đầu 5’
của gen này có các đoạn polynucleotid lặp lại. Các nghiên cứu cho thấy độ dài
của các đoạn lặp này sẽ quyết định nguy cơ mắc ĐTĐ typ 1. Các đoạn lặp có độ
dài càng lớn thì nguy cơ mắc ĐTĐ càng thấp và ngược lại [12]. Trong thực tế,
5
nguyên nhân liên quan đến gen mã hóa insulin chiếm 10% tổng số các trường
hợp nhạy cảm về di truyền của bệnh ĐTĐ typ 1 [32], [55].
Các nghiên cứu sàng lọc về di truyền học đã chỉ ra ít nhất 15 vị trí gen
khác liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1 [25], trong đó, có 2 gen liên quan tới cơ chế
hoạt hóa lympho T. Đó là gen mã hóa kháng nguyên lympho T gây độc tế bào
(CTLA-4), thuộc nhiễm sắc thể số 2 và gen mã hóa lymphoid tyrosine
phosphatase (PTPN22), được biểu thị đặc hiệu ở tế bào lympho T [38].
Yếu tố thứ hai phải kể đến trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự tác
động của môi trường: Ở những cá thể có yếu tố di truyền nhạy cảm với bệnh như
trên, khi gặp một số yếu tố môi trường nhất định, có thể khởi phát hoạt động của
hệ miễn dịch, gây thâm nhiểm đảo tụy. Một trong những yếu tố môi trường được
chứng minh có liên quan đến bệnh ĐTĐ là virus. Sở dĩ nhiễm virus được coi là
nhân tố quan trọng trong các nguyên nhân gây ĐTĐ typ 1 ở người vì tỉ lệ phát
bệnh tăng theo mùa, đặc biệt trong mùa có dịch cúm. Mặc khác, từ tiểu đảo tụy
của một số bệnh nhân ĐTĐ typ 1 tử vong do nhiễm toan ceton, người ta đã phân
lập được virus Coxsacki loại B4. Khi tiến hành gây nhiễm với virus Coxsacki ở
động vật thí nhiệm cho thấy tế bào beta bị nhiễm virus và xuất hiện ĐTĐ ở
những động vật này [27].
Cuối cùng là sự kết hợp của 3 yếu tố: di truyền, môi trường và miễn dịch:
sau khi xuất hiện các yếu tố khởi phát của môi trường, hiện tượng thâm nhiễm
đảo tụy ở các cá thể nhạy cảm về di truyền với bệnh bắt đầu xảy ra ở tế bào beta,
từ đó sẽ tiếp tục dẫn đến quá trình phá hủy của toàn bộ tiểu đảo tụy. Tế bào beta
có thể bị phá hủy bởi 2 cơ chế:
Các lympho T hiệu ứng giải phóng các hạt chứa perforin vào tế bào đích.
Cơ chế này cần có sự liên kết giữa receptor của lympho T đặc hiệu với tự kháng
nguyên và phức hợp hòa hợp tổ chức của tế bào đích.
6
Cơ chế làm chết tế bào beta theo chương trình (apoptosis) thông qua Fas
(CD95) và FasL (CD95L). Cơ chế này không cần sự liên kết giữa receptor của tế
bào T với phức hợp hòa hợp tổ chức [32].
Sau khi “khởi động”, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ diễn ra: các tiểu đảo
tụy bị thâm nhiễm bởi các tế bào đơn nhân, các đại thực bào và tế bào lympho T
độc (quá trình thâm nhiễm này được gọi là viêm tiểu đảo tụy). Ở giai đoạn này,
trong huyết thanh người bệnh xuất hiện rất nhiều kháng thể kháng tiểu đảo tụy,
đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1. Tế bào beta bị tổn thương làm cho quá trình
sản xuất insulin giảm dần, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng
độ glucose trong máu ở mức bình thường, bệnh ĐTĐ thật sự sẽ xuất hiện [14].
1.1.2.2. Bệnh sinh đái tháo đường typ 2
ĐTĐ typ 2 thuộc bệnh rối loạn chuyển với đặc hóa đặc điểm: có sự đề
kháng insulin ở mô đích [1],[34]
- Hiện tượng kháng insulin
Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc làm mất tính nhạy cảm của cơ quan
đích với insulin [1]
Insulin sau khi được tiết ra từ tế bào β đảo tụy, gắn với tiểu đơn vị α của
insulin receptor (IR), thông tin sẽ được truyền qua màng tế bào tới vùng bào
tương của các tiểu đơn vị β, vùng này có hoạt tính tyrosin kinase nội tại. Tiểu
đơn vị β tự phosphoryl hoá tại các đuôi tyrosin gây ra hàng loạt các phản ứng
trong tế bào thể hiện trong hình 1.1.
7
Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin ở gan và cơ [26]
Con đường truyền tin nội bào bị ức chế sẽ dẫn đến hiện tượng kháng
insulin. Trong thực tế, hiện tượng kháng insulin đã được chứng minh theo các cơ
chế sau:
Bất hoạt insulin receptor (IR) thông qua tăng hoạt tính của các enzym khử
phosphoryl của tyrosin trong con đường truyền tin nội bào của insulin. Một số
enzym đã được nghiên cứu như các protein tyrosin phosphatase (PTP) trong đó
chủ yếu là PTP1B. PTP1B có trong lưới nội chất và trong tế bào mô đích của
insulin với tác dụng tăng hoạt tính các enzym khử phosphoryl (ức chế quá trình
phosphoryl hoá) của tyrosin trong IR và trong insulin receptor substrate (IRS) do
đó giảm tính nhạy cảm của insulin trên tế bào [30], [15].
Sự gia tăng phosphoryl hoá các phân tử serin hoặc threonin không những
làm giảm khả năng hoạt hoá IP3 mà còn làm giảm quá trình phosphoryl hoá
Cơ
Gan
FFA
FFA Nồng độ glucose Nồng độ glucose
Tăng tân t
ạo
đư
ờng
Sự phosphoryl hóa serin
S
ự phosphoryl hóa tyroxin
Sự phosphoryl hóa tyroxin
giảm IRS1 và IRS2
8
tyrosin của insulin receptor, tăng thoái hoá IRS do đó làm giảm tác dụng và tăng
kháng insulin [17], [26].
Bất hoạt IP3 thông qua ức chế tiểu đơn vị điều hoà ngược p85 nằm trên
IP3K: Sự thể hiện quá mức dạng hoạt động p100 trên PI3K hoặc kích thích quá
mức Akt đều ức chế p85 làm giảm tác dụng sinh học của insulin [8], [49].
Yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin là thừa cân, béo
phì [64]. Theo Venables, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ typ 2 liên quan đến béo
phì và lối sống ít vận động [67]. Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và phòng
bệnh Mỹ, khoảng 55% bệnh nhân ĐTĐ đồng thời mắc béo phì, 85% bệnh nhân
ĐTĐ bị thừa cân. Một trong các nguyên nhân gây béo phì là do chế độ ăn nhiều
chất béo và ít vận động. Ở những bệnh nhân béo phì, nồng độ acid béo tự do
(FFA) tăng cao cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân, gia tăng FFA
gây rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên. Sự gia tăng FFA gây đề kháng
insulin. FFA có vai trò trong việc điều hòa, phóng thích glucose ở gan và góp
phần làm kháng insulin ở gan trên người béo phì [34].
- Hiện tượng bù và sự suy kiệt tiếp theo của tế bào beta
Tình trạng kháng insulin làm giảm tác dụng điều hòa chuyển hóa của
insulin ở các mô đích, với biểu hiện rõ ràng nhất là sự tăng glucose huyết. Khi
nồng độ glucose huyết cao sẽ kích thích tế bào beta của đảo tụy tăng tiết insulin.
Bên cạnh đó, các yếu tố nguy cơ còn có tác động trực tiếp đến tế bào beta. Sự
kết hợp của hai tác động này đôi khi dẫn đến hiện tượng kích thích quá mức tế
bào beta, sau một thời gian sẽ dẫn đến sự suy giảm của tế bào beta. Ngoài ra,
nồng độ FFA và glucose trong máu tăng làm tăng chuyển hoá tại ty thể, tăng các
gốc tự do gây gia tăng tình trạng viêm. Mặt khác, tăng tổng hợp insulin ở tế bào
beta gây ra hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai nguyên nhân này đều dẫn đến
sự chết theo chương trình của tế bào beta. Ở giai đoạn này, sự sản xuất và bài tiết
9
insulin ở tụy giảm đi kèm theo hiện tượng kháng insulin sẵn có làm tình trạng
mất kiểm soát nồng độ glucose huyết tiếp tục xấu đi kèm theo nhiều biến chứng
nghiêm trọng [57].
1.1.3. Hướng tác dụng của thuốc điều trị đái tháo đường
Mục tiêu chung trong điều trị ĐTĐ là nhằm kiểm soát nồng độ glucose
huyết trong giới hạn cho phép, ngăn ngừa và hạn chế biến chứng, góp phần nâng
cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh. Để đạt được mục tiêu trên, các liệu
trình điều trị ĐTĐ thường kết hợp giữa chế độ ăn uống, sinh hoạt, luyện tập hợp
lý với việc dùng thuốc. Dưới đây là một số cơ chế chính trong điều trị ĐTĐ.
1.1.3.1. Insulin [1]
Insulin là một hormon polypeptid do tế bào beta của đảo tụy tiết ra. Tác
dụng chính của insulin lên sự ổn định nồng độ glucose huyết xảy ra sau khi
insulin đã gắn với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào của các mô nhạy cảm
với insulin, đặc biệt là gan, cơ vân và mô mỡ. Insulin ức chế tạo glucose ở gan,
tăng sử dụng glucose ở ngoại vi và do đó làm giảm nồng độ glucose trong máu.
Insulin ngoại sinh được dùng để thay thế hoặc bổ sung cho sự thiếu hụt của
insulin nội sinh trong ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2 giai đoạn sau.
1.1.3.2. Các thuốc làm tăng cường lượng insulin
Để bù đắp cho sự thiếu hụt bài tiết insulin hoặc khiếm khuyết trong hoạt
động của insulin, bên cạnh việc điều trị bằng insulin ngoại sinh, một hướng điều
trị phổ biến là làm tăng cường số lượng insulin nội sinh trong cơ thể, do tăng giải
phóng insulin từ đảo tụy.
Các cơ chế tác dụng của thuốc kích thích bài tiết insulin bao gồm:
- Ức chế kênh K
+
phụ thuộc ATP, làm giảm nồng độ K
+
, gây khử cực
màng và mở kênh Ca
2+
phụ thuộc điện thế, kết quả là làm tăng giải phóng insulin
từ tế bào beta. Với cơ chế tác dụng đó, các thuốc này được dùng trong ĐTĐ typ
10
2, khi tụy vẫn còn khả năng bài tiết insulin [12]. Các thuốc này đã được đưa vào
sử dụng trên lâm sàng từ những năm 50 của thế kỷ trước. Hiện có 2 nhóm thuốc
đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị ĐTĐ là nhóm sulfonylurea (gồm
khoảng 20 thuốc chia thành 2 thế hệ) và nhóm meglitinid (gồm 2 thuốc đã được
phép lưu hành là lepaglinid và neteglinid) [46].
- Một nhóm chất kích thích bài tiết insulin khác đang được chú ý là các
incretin như glucagon-like peptide-1 (GLP1). Các peptid này có khả năng làm
tăng bài tiết insulin sau bữa ăn thông qua receptor nằm trên màng tế bào beta
[50]. Ngoài ra, GLP1 còn kích thích sinh tổng hợp insulin qua con đường
AMPv-PKA. Nhược điểm chủ yếu của các peptid này là dễ bị phân huỷ, đặc biệt
dưới tác dụng của enzym dipeptidyl peptidase 4 (DPP4). Để khắc phục nhược
điểm này, các nhà khoa học đã tìm ra những dẫn chất tương tự cũng tác dụng
trên receptor của GLP-1 nhưng bền vững hơn và có khả năng kháng lại DPP4,
điển hình là exenatid. Thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy exenatid có tác dụng
kéo dài hơn và hiệu quả điều trị tốt hơn chính GLP-1. Một giải pháp khác cho
người bệnh ĐTĐ theo hướng này là các thuốc ức chế DPP4, làm tăng thời gian
tồn tại và tác dụng của GLP-1. Hiện nay, một số chất ức chế DPP4 đã được sử
dụng rộng rãi cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2 là sitagliptin và vildagliptin [50].
- Một trong những hướng nghiên cứu mới thu hút sự chú ý của nhiều nhà
khoa học là các chất đối vận với ghrelin trên receptor GHSR [28]. Ghrelin là một
peptid có 28 acid amin được bài tiết chủ yếu ở dạ dày và hoạt động trên receptor
GHSR để kích thích bài tiết hormon tăng trởng GH và làm tăng cảm giác thèm
ăn. Do đó, ban đầu các chất đối vận với ghrelin chủ yếu được nghiên cứu với tác
dụng điều trị béo phì. Tuy nhiên, từ năm 2001, người ta đã phát hiện ra ảnh
hưởng của ghrelin trên bài tiết insulin của tuyến tụy, cụ thể là ức chế bài tiết
insulin ở cả người và động vật thí nghiệm. Nồng độ ghrelin và insulin trong máu
11
luôn tỷ lệ nghịch với nhau và do đó, nồng độ ghrelin tăng sẽ kéo theo tăng
glucose huyết [50], [66]. Từ phát hiện đó, các nhà khoa học đã tập trung tìm
kiếm các chất đối vận ghrelin có tác dụng kích thích sản xuất insulin để điều trị
ĐTĐ như dẫn chất quinazolin thay thế piperidin. Nghiên cứu in vivo cho thấy
thuốc có khả năng làm giảm trọng lượng cơ thể, giảm glucose huyết và tăng
nồng độ insulin nội sinh [66]. Một nghiên cứu khác trên 2 chất đối vận ghrelin
phân tử nhỏ là YIL-781 và YIL-870 cũng ghi nhận khả năng làm tăng nồng độ
insulin máu, giảm trọng lượng và tăng dung nạp glucose [45]. Những kết quả
trên mở ra khả năng sử dụng các chất đối vận ghrelin để điều trị ĐTĐ typ 2, ở
giai đoạn có suy giảm sản xuất insulin ở tụy [45].
1.1.3.3. Các thuốc tăng cường tác dụng của insulin ở mô đích
Sự suy giảm đáp ứng với insulin ở mô đích là một trong những đặc điểm
bệnh học quan trọng của ĐTĐ typ 2. Do vậy, đây là một trong những nhóm
thuốc quan trọng trong điều trị ĐTĐ typ 2, giúp giải quyết được tình trạng kháng
insulin.
Một nhóm thuốc kinh điển trong điều trị ĐTĐ typ 2 có cơ chế tác dụng
làm tăng nhạy cảm của mô ngoại vi với insulin là nhóm biguanid, với dẫn chất
duy nhất đang được dùng rộng rãi trong lâm sàng là metformin. Cơ chế tác dụng
quan trọng nhất của metformin là tăng cường con đường truyền tín hiệu của
insulin ở mô đích. Ngoài ra, metformin có tác dụng làm giảm lượng acid béo tự
do, qua đó gián tiếp giúp cải thiện tình trạng kháng insulin [51].
Hiện nay, một nhóm thuốc đang được sử dụng rộng rãi và rất có hiệu quả
trong điều trị ĐTĐ typ 2 là nhóm thiazolidinedion. Một trong các cơ chế được
giải thích về tác dụng của nhóm thuốc này là tác động thông qua receptor PPAR
nằm trong nhân tế bào. Sau khi gắnvới thiazolidinedion, receptor PPAR tạo
12
thành dimer với receptor X retinoid, phức hợp này sẽ gắn vào ADN, làm điều
hoà quá trình biểu hiện gen của một số protein quan trọng trong quá trình biệt
hoá tế bào cũng như chuyển hoá glucose và lipid. Một trong những đáp ứng sinh
học quan trọng nhất liên quan đến receptor PPAR là kích thích biệt hoá tế bào
mỡ, kích thích các enzym và protein vận chuyển của tế bào mỡ như lipoprotein
lipase, yếu tố vận chuyển acid béo trong việc thu nạp acid béo. Kết quả là làm
giảm nồng độ acid béo tự do trong huyết tương, tức là gián tiếp cải thiện nguyên
nhân gây kháng insulin ở mô đích. Bên cạnh đó, thiazolidinedion còn làm tăng
nhạy cảm với insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mỡ
sản xuất [41]. Một số chất chủ vận receptor PPAR mới được phát hiện và
nghiên cứu cũng đồng thời là chất chủ vận receptor PPAR, một receptor có vai
trò quan trọng trong chuyển hoá lipid. Do đó, bên cạnh tác dụng giảm kháng
insulin, các chất này còn có tác dụng giảm lipid máu, góp phần cải thiện tình
trạng của bệnh nhân ĐTĐ typ 2, đặc biệt ở thể béo phì [41].
Một trong những khâu quan trọng trong cơ chế truyền tin của insulin
thông qua receptor đặc hiệu ở tế bào đích là sự phosphoryl hoá tyrosin ở hậu thụ
thể. Quá trình này bị đảo ngược dưới tác dụng của enzym protein tyrosin
phosphatase – 1B (PTP1B). Do đó, PTP1B được coi là chất điều hoà âm tính đối
với hoạt động của insulin ở tế bào đích. Với nguyên lý đó, các chất ức chế
PTP1B có tác dụng làm tăng hoạt động của insulin và trong thực tế, các chất này
đang được nghiên cứu trong việc tìm kiếm thuốc điều trị kháng insulin [15].
Trên thực nghiệm, ức chế PTP1B làm giảm béo phì. Chuột nhắt gây đột biến
PTP1B đề kháng với béo phì, tăng nhạy cảm với insulin, loại chuột nhắt này
không bị béo phì ngay cả khi cho ăn chế độ ăn giàu chất béo [42].
13
Một mục tiêu nghiên cứu khác của các nhà khoa học cũng theo hướng tăng
cường hoạt động của insulin ở mô đích là các chất ức chế glycogen synthase
kinase-3 (GSK3). GSK3 có vai trò quan trọng trong điều hoà hoạt động của tế
bào, đặc biệt là trong quá trình truyền tin của insulin. GSK3 kích thích sự
phosphoryl hoá serin của IRS-1, do đó gián tiếp ức chế sự phosphoryl hoá
tyrosin là điều kiện cần cho quá trình hoạt động của receptor insulin. Sự
phosphoryl hoá serin dưới tác động của GSK3 xảy ra ngay cả khi insulin không
gắn với receptor. Như vậy, GSK3 đóng vai trò như một chất giới hạn hoạt động
của insulin ở tế bào đích. Trong thực tế, người ta đã ghi nhận sự tăng hoạt tính
GSK3 ở chuột bị ĐTĐ và béo phì cũng như ở cơ xương của bệnh nhân ĐTĐ typ
2 [30]. Do đó, các chất ức chế GSK3 sẽ có tác động làm tăng hoạt động của
insulin tại mô đích.
1.1.3.3. Các thuốc làm ức chế tiêu hóa hấp thu glucid
Để làm giảm hoặc làm chậm hấp thu các glucid tại đường tiêu hóa, hạn
chế tăng glucose huyết sau khi ăn, các thuốc có thể tác dụng trên các đích sau:
- Ức chế các enzym thủy phân glucid tại đường tiêu hóa như amylase, α-
glucosidase.
- Ức chế hoạt động của yếu tố vận chuyển glucose ở ruột SGLT1 (chưa có
thuốc được ứng dụng trên lâm sàng).
1.1.3.4. Các thuốc có tác dụng tương tự insulin trong điều hòa chuyển hóa
glucid
Để đối phó với sự thiếu hụt insulin về số lượng và/ hoặc tác dụng trong
bệnh ĐTĐ, có thể chủ động hỗ trợ hoặc thay thế tác dụng của insulin bằng các
thuốc có tác dụng tương tự insulin trong điều hoà chuyển hoá glucose. Cụ thể là :
kích thích các enzym chủ chốt trong quá trình thoái hoá glucose và tổng hợp
14
glycogen hoặc ức chế các enzym chủ chốt trong quá trình tân tạo glucose và thuỷ
phân glycogen thành glucose.
Metformin là một trong những thuốc có khả năng đó. Bên cạnh tác dụng
làm tăng nhạy cảm của mô đích với insulin như đã trình bày ở phần trên,
metformin còn có tác dụng ức chế tân tạo glucose trong cơ thể, do đó, góp phần
chống tăng glucose huyết. Tác dụng này của metformin thông qua cơ chế ức chế
glucose 6 phosphatase, enzym quan trọng nhất của con đường tân tạo glucose.
Ngoài ra, metformin còn có tác dụng tương tự insulin trong việc hoạt hoá protein
đặc hiệu vận chuyển glucose (GLUT) [51].
Tương tự như metformin, các muối của vanadium cũng có tác dụng ức chế
tân tạo glucose thông qua ức chế các enzym chủ chốt như PEPCK, glucose 6
phosphatase ở gan và thận. Ngoài ra, các dẫn chất này cũng có tác dụng ức chế
thoái hoá lipid tương tự như insulin và do đó, gián tiếp làm giảm tỷ lệ tân tạo
glucose/ thoái hoá glucose, tức là làm giảm glucose huyết. Để khắc phục độc
tính của các thuốc này do sự ức chế không đặc hiệu các phosphatase, người ta
đang thử nghiệm các muối hữu cơ của vanadium với hi vọng tìm ra những thuốc
điều trị ĐTĐ typ 2 có hoạt lực mạnh hơn và ít độc hơn [20].
1.2. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT THỰC NGHIỆM
Có nhiều phương pháp khác nhau để gây tăng glucose huyết thực nghiệm
trên động vật, từ đơn giản nhất là cho uống glucose cho đến phẫu thuật cắt bỏ
tụy. Dưới đây xin trình bày một số nhóm phương pháp được sử dụng phổ biến
nhất trong các nghiên cứu thực nghiệm.
1.2.1. Tăng glucose huyết thực nghiệm do hóa chất
Các hóa chất thường dùng để gây tăng glucose huyết thực nghiệm thường
là những chất có thể gây phá hủy tế bào β đảo tụy như alloxan, streptozocin,
dithizon, gold-thioglucose, monosodium glutamat, 8-hydroxyl quinolon [30],
15
[36], [44]. Trong đó hay được sử dụng nhất là streptozocin (hay streptozotocin -
STZ), một chất có cấu trúc gần giống glucose và tác dụng chọn lọc lên tế bào β
đảo tụy. Sau khi xâm nhập vào tế bào, STZ sẽ tách thành 2 thành phần là glucose
và methylnitrosourea. Methylnitrosourea là tác nhân alkyl hóa mạnh gây biến đổi
cấu trúc ADN, ức chế sự sao chép ADN do đó ức chế sự nhân lên của tế bào β,
mặt khác ức chế quá trình ribosyl hóa polyADP của tế bào β. Tác động chung là
làm phá hủy tế bào β gây ra tình trạng thiếu hụt insulin, làm tăng glucose huyết
[28]. Tùy vào liều lượng STZ được sử dụng và tùy vào chủng loại, giống của
động vật thí nghiệm mà có thể gây tình trạng tăng glucose huyết thực nghiệm,
ĐTĐ typ 1 hoặc ĐTĐ typ 2 [31], [64], Một số tác giả gây mô hình ĐTĐ kiểu typ
2 cho động vật thí nghiệm bằng cách kết hợp sử dụng STZ với các chất có tác
dụng bảo vệ tế bào β như nicotinamid hoặc tiêm STZ cho chuột mới sinh [54].
1.2.2. Đái tháo đường do di truyền
Có thể gây ĐTĐ typ 1 hoặc ĐTĐ typ 2 di truyền cho động vật thí nghiệm
bằng phương pháp lai tạo và chọn giống. Động vật ĐTĐ typ 1 di truyền hay
được sử dụng nhất là chuột cống BB và chuột nhắt NOD [18]. Chuột ĐTĐ typ 2
di truyền hay được dùng nhất là chuột nhắt ob/ob, chuột nhắt db/db và chuột
cống Zucker fa/fa [18]. Động vật ĐTĐ di truyền có các biểu hiện tương đối
giống với các biểu hiện ở người, mặc dù cơ chế bệnh sinh có thể không hoàn
toàn tương tự.
Hiện nay, ở Việt Nam đã có tác giả công bố các nghiên cứu trên chuột
cống GK (Goto-kakiraki) [10], tuy nhiên các thí nghiệm này đều được tiến hành
tại nước ngoài. Ở Việt Nam chưa thấy có các giống chuột ĐTĐ do di truyền.
1.2.3. Động vật đái tháo đường typ 2 do chế độ dinh dưỡng
Phương pháp được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu gần đây là gây
ĐTĐ thể béo phì bằng chế độ ăn giàu chất béo ở loài gặm nhấm [4], [8]. Nguyên
