Nghiên cứu vai trò của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu probiotics chứa lactobacillus acidophilus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







NINH THỊ KIM THU


NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALGINAT
TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN
LIỆU PROBIOTICS CHỨA
Lactobacillus acidophilus






LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC






HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







NINH THỊ KIM THU


NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALGINAT
TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN
LIỆU PROBIOTICS CHỨA
Lactobacillus acidophilus




CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ 60720402




Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Đàm Thanh Xuân
2. ThS. Nguyễn Thị Trinh Lan

HÀ NỘI 2013
MỤC LỤC
DANH MỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chương 1: TỔNG QUAN
2
1.1. Đại cương về probiotics
2
1.1.1. Khái niệm
2
1.1.2. Các vi sinh vật được sử dụng trong chế phẩm probiotics
2
1.1.3. Cơ chế tác dụng
4
1.1.3.1. Cơ chế tác dụng
5
1.1.3.2. Ứng dụng của probiotics
5
1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt
Nam
5
1.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm
probiotics trên thế giới

7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotics
ở Việt Nam
7
1.3. Lactobacillus acidophilus
10
1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý
10
1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat
11
1.3.3. Các dạng chế phẩm probiotics chứa L. acidophilus
11
1.4. Alginat
12
1.4.1. Tính chất
12
1.4.2. Ứng dụng
13
1.4.3. Một số nghiên cứu sử dụng alginate trong bào chế probiotics
13
1.5. Phương pháp đông khô
15
1.5.1. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô
16
1.5.2. Ứng dụng
16
1.5.3. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật
16
1.6. Nang cứng
19

1.6.1. Đặc điểm dạng thuốc nang cứng
19
1.6.2. Đánh giá chất lượng nang cứng
20
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
21
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
21
2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng
21
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
22
2.1.3. Các dung dịch và hỗn dịch sử dụng trong nghiên cứu
22
2.1.4. Thiết bị
22
2.2. Phương pháp nghiên cứu
23
2.2.1. Phương pháp nhân giống
23
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối
23
2.2.3. Phương pháp đông khô
24
2.2.4. Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall
25
2.2.5. Phương pháp tạo thuốc bột chứa L. acidophilus
25
2.2.6. Phương pháp tạo nang cứng chứa L. acidophilus

25
2.2.7. Phương pháp xác định hàm ẩm
25
2.2.8. Phương pháp xác định số lượng VSV theo nguyên tắc pha loãng
liên tục
26
2.2.9. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống
27
sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột
2.2.10. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của alginate đến khả năng
sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc nang
cứng
28
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
30
3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi
khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá trình đông khô
30
3.1.1. Đánh giá thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus
acidophilus tạo thành sau khi đông khô
30
3.1.2. Đánh giá độ ẩm và tốc độ hút ẩm của các mẫu đông khô vi sinh
vật với tá dược bảo vệ là sữa gầy và alginate
33
3.1.3. Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót
sau đông khô
36

3.1.4. So sánh khả năng sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông
khô có và không có kết hợp alginate và sữa gầy

39
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi
khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột và đóng
nang cứng
42
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi
khuẩn L. acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột
43
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi
khuẩn L. acidophilus trong quá trình tạo nang cứng
45
Chương 4: BÀN LUẬN
48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
55




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B. subtilis : Bacillus subtilis
Cfu (Colony- Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc
FAO (Food and Agriculture Organization) : Tổ chức nông lương thế giới
Glass : một trạng thái nhiệt động quá bão hòa không bền với độ nhớt cao
HDL (High density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng cao
HDSK : Hỗn dịch sinh khối
IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn bơ sữa thế giới
Kl/kl : Khối lượng/khối lượng
Kl/tt : Khối lượng/thể tích

L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus
LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn lactic
LDL (Low density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng thấp
MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
MT : Môi trường
PPI (Proton Pump Inhibitor) : Ức chế bơm proton
S. boulardii : Saccharomyces boulardii
Tt/kl : Thể tích/khối lượng
VSV : Vi sinh vật
WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế thế giới




DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotics
7
Bảng 1.2
Một số chế phẩm probiotics trên thị trường Việt Nam
9
Bảng 1.3
Cơ chế bảo vệ của tá dược trong quá trình đông khô
17
Bảng 2.1
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
21

Bảng 2.2
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
22
Bảng 3.1
Thể chất của các mẫu đông khô L. acidophilus với các tá
dược bảo vệ tại thời điểm ngay sau khi đông khô
31
Bảng 3.2
Biến thiên hàm ẩm (%) của một số mẫu đông khô L.
acidophilus với tá dược bảo vệ khác nhau theo thời gian
34
Bảng 3.3
Số lượng vi khuẩn sống sót trong 4 mẫu sau đông khô
37
Bảng 3.4
Tỷ lệ VSV sống sót sau đông khô so với mẫu ban đầu
37
Bảng 3.5
Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn
hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ
40
Bảng 3.6
Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô
trong các mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginate và sữa
gầy.
41
Bảng 3.7
Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột đông khô
44
Bảng 3.8

Số lượng vi sinh vật sống sót trong 1 viên nang trong môi
trường acid HCl pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút
45
Bảng 3.9
Tỷ lệ vi sinh vật sống sót của mẫu alginate so với mẫu tinh
bột trong môi trường pH 1,2
46


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
STT
Tên bảng
Trang
Hình 1.1
Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử.
11
Hình 1.2
Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-
mannuronic
12
Hình 3.1
Hình ảnh mẫu đông khô với nước cất.
32
Hình 3.2
Đồ thị biểu thị hàm ẩm trung bình của các mẫu ngay sau
đông khô và trong thời gian bảo quản.
34
Hình 3.3
Hình ảnh mẫu đông khô với alginate ngay sau khi tháo khỏi
máy và sau 3 phút để ngoài môi trường.

35
Hình 3.4
Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn L. acidophilus sống sót
trong các mẫu sau đông khô
38
Hình 3.5
Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn
hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ
40
Hình 3.6
Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô
trong các mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginate và sữa gầy.
42
Hình 3.7
Biểu đồ thể hiện số lượng vi sinh vật sống sót sau khi thử
trong môi trường acid HCl pH 1,2
44
Hình 3.8
Số lượng vi sinh vật sống sót trong 1 viên nang trong môi
trường acid HCl pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút
46

LỜI CẢM ƠN
 xinTS. Đàm
Thanh Xuân và ThS. Nguyễn Thị Trinh Lan,
 
Ds. Lê Ngọc Khánh cùng 
Công Nghiệp Dược 
.




 
p và hoàn thành   





30
 viên
Kim Thu


1

T V

Probiotics thuộc nhóm các vi sinh vật sống không thể thiếu đối với sức
khỏe con người. Những vi sinh vật này đưa vào cơ thể khi còn sống với một
lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ. Chúng thường được bổ sung
kèm với chế độ ăn hoặc qua các chế phẩm chứa probiotics.
Vi sinh vật hay được sử dụng nhất trong các chế phẩm probiotics là
nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, mà trong đó điển hình là Lactobacillus
acidophilus.
Tuy nhiên, probiotics kém ổn định do bất lợi của điều kiện bảo quản
cũng như hàng rào sinh học của vật chủ. Do vậy, các nghiên cứu trong nước
cũng như trên thế giới hiện nay đều được thực hiện với mục tiêu giúp ổn định
vi sinh vật. Trong đó, alginat là tá dược được nghiên cứu nhiều nhất trên thế
giới. Nhưng trong nước các nghiên cứu về tá dược này còn rất hạn chế.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
    a alginat      
Lactobacillus acidophilus.
Với các mục tiêu:
alginat
.
alginat 
  

2

TNG QUAN
1.1.  probiotics
1.1.1. Khái nim
Probiotics bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “sự sống”. Khái niệm
probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn
sách “Kéo dài sự sống” của ông đưa ra 1908. Ông cho rằng những người nông
dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi
khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột. [55]
Thuật ngữ “probiotics” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi
Kollath. Probiotics được định nghĩa là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn,
kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác”. [55]
Năm 1974, Parker đã phát triển định nghĩa này, ông cho rằng probiotics
là “những vi sinh vật và những cơ chất giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường
ruột”. Sau đó đến năm 1989, Fuller đã thay đổi định nghĩa này, ông cho rằng
probiotics là “thực phẩm” bổ sung một số vi sinh vật sống có ích cho vật chủ
nhằm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của nó. Định nghĩa này nhấn mạnh
vai trò khả năng sống của vi sinh vật. Năm 1998, Salminen đã định nghĩa
probiotics là “những thực phẩm chứa vi khuẩn sống ảnh hưởng có lợi cho sức
khoẻ”. Năm 2002 Marteau đã định nghĩa probiotics hoàn chỉnh hơn

“probiotics là những chế phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay những thành phần
của tế bào vi sinh vật mà ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ”. [23], [55]
Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Lương thực thế
giới (FAO) đưa ra định nghĩa probiotics được coi là hoàn chỉnh nhất hiện nay:
“Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với lượng phù hợp sẽ
đem lại lợi ích cho sức khỏe của sinh vật chủ”. [23], [55]
1.1.2. Các vi sinh vc s dng trong ch phm probiotics
Probiotics được chia làm 3 nhóm chính sau [6]:
3

- Nhóm vi khuẩn lactic (chiếm phần lớn): gồm 2 chi phổ biến là chi
Lactobacillus và Bifidobacterium.
- Nhóm không phải vi khuẩn lactic:
+ Chi Propionibacterium: P. freudenreichii, P. cyclohexanicum,
+ Chi Bacillus: B. subtilis, B. clausii,
+ Chi Brevibacillus: B. laterosporus,…
+ Chi Sporolactobacillus: S. laevolacticus,…
+ Chi Escherichia: E. coli,
- Nhóm nấm men: chủ yếu là chi Saccharomyces cerevisiae.
Việc lựa chọn các vi sinh vật trên dùng làm nguyên liệu probiotics đều
phải dựa vào các tiêu chí sau:
 Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ
 Chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non
 Không sinh độc tố và không gây bệnh cho vật chủ
 Có khả năng sinh enzym, chất kháng sinh hoặc các sản phẩm cuối cùng
mà vật chủ có thể sử dụng được
 Có khả năng sống và cư trú trong ruột
 Dễ nuôi cấy và có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài
L. acidophilus là trực khuẩn chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có
ích cư trú ở đoạn trên của ống tiêu hóa. Nó có khả năng làm giảm số lượng

các vi sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase - một
enzym quan trọng trong chuyển hóa sữa; có liên quan đến quá trình sản xuất
một số vitamin nhóm B như: niacin, acid folic, pyridoxin; tăng cường chức
năng của hệ thống miễn dịch; giảm sự tiêu diệt vi sinh vật có ích do sử dụng
kháng sinh dài ngày.[6]
Với các đặc điểm trên, L. acidophilus là vi sinh vật được lựa chọn đầu
tiên để sản xuất các chế phẩm probiotics.
4

1.1.3.  tác dng ca probiotics
1.1.3.1.  tác dng [3],[4],[6],[7]
- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám: Probiotics cạnh tranh chất dinh
dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh để duy trì và phát triển. Bằng
cách chiếm lĩnh và bám chặt vào thành ruột, probiotics ngăn ngừa các vi
khuẩn có hại tấn công và phát triển.
- Tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruột: Probiotics sống
tại đường ruột cũng đồng thời tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc
ruột và giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và kháng nguyên từ ruột vào
mạch máu. Chức năng này giúp giảm sự nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các
kháng nguyên có trong thực phẩm.
- Sản sinh ra các chất ức chế: Một số probiotics sản sinh ra các kháng
sinh như bacteriocins giúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh. Trong quá trình
lên men đường, các thành phần khác nhau của probiotics sản sinh ra acid
lactic giúp làm giảm pH của ruột và ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn
không cần thiết. Một số sản phẩm sinh ra trong quá trình trao đổi chất, quá
trình lên men chuyển hóa carbohydrat như butyrat và acid butyric có khả năng
chống ung thư.
- Kích thích đáp ứng miễn dịch: Probiotics có khả năng làm tăng cả
phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế
bào phản ứng miễn dịch (macrophases, lymphocytes) và tăng cường sự sản

xuất ra các thành phần miễn nhiễm (cytolines, immunoglobulins, interferon).
- Tăng cường chức năng tiêu hóa: Probiotics trong ruột non giúp giảm
lượng mật trong cơ thể và giảm cholesterol. Probiotics sản sinh ra các enzym
khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrate và làm thuận tiện hơn quá trình
ruột hấp thụ năng lượng từ các chất dinh dưỡng. Probiotics cũng đồng thời lên
5

men những carbohydrat không tiêu hóa được trong ruột non và sản xuất ra
vitamin B, K.
1.1.3.2. ng dng ca probiotics:
Probiotics được ứng dụng:
 Trong các bệnh tiêu hóa [16], [20], [27]
- Tăng khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym khác
- Hỗ trợ trong điều trị tiêu chảy do sử dụng kháng sinh
- Tác dụng lên Helicobacter pylori
 Tăng cường miễn dịnh [22], [39]
- Kích thích miễn dịch niêm mạc
- Tăng cường miễn dịch, giảm phản ứng dị ứng
- Giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn, nấm
- Giảm nguy cơ mắc ung thư
 Chống tăng huyết áp, giảm cholesterol máu [14], [26]
 Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản
1.2. Tình hình nghiên cu và s dng probiotics trên th gii và Vit Nam
1.2.1. Tình hình nghiên cu sn xut và s dng các ch phm probiotics
trên th gii
Việc sử dụng thực phẩm có probiotics (như 1 thành phần tự nhiên của
thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc
nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotics mới thực sự phát
triển từ những năm 80 của thể kỷ 20. Những nghiên cứu về đặc điểm phân
loại và quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành

bởi Apajalahti và cs (1998) [13]; Vander Wielen và cộng sự (2000) [49] đã
cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium
chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ thuật gen,
các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh
6

vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotics.
Netherwood và cs (1999) [38]; Gong và cs (2002) [23]; Zhu và cs (2002) [54]
đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc
điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của
probiotics. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một
hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật
đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ. Đã có rất nhiều nghiên cứu về
vai trò của probiotics đối với đời sống động vật như tác động của probiotics
đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Mayer, 1991)[46];
(Hersbberg và Mayer, 2000) [25] đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở
vật nuôi (McCracken và Lorenz, 2001). [37]
Những ảnh hưởng có lợi của probiotics thể hiện ở nhiều khía cạnh khác
nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotics
còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc
ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động
vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách
sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi
(các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính
ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột. [22], [40]
Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải
chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất
nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây
tác dụng. Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản
xuất, bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản, do

vậy đã có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông
khô tạo bột [32], [33], áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi
nang hóa [15], [21], phương pháp sử dụng kết hợp với tá dược bảo vệ [41],
7

[42]. Việc bảo vệ các vi sinh vật probiotics để chúng sống sót và phát huy tác
dụng khi đến ruột là một vấn đề quan trọng và đang được giải quyết.
1.2
am
Ở nước ta, các chế phẩm probiotics đã chiếm lĩnh thị trường hơn 10
năm; tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất probiotics phục vụ cho đời sống còn
rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Đến
nay, trên thị trường nước ta đã có mặt các sản phẩm probiotics của bốn thế hệ
bào chế như sau: [6]

 





(Non-
coated)
VSV sống (trong
sữa chua, phomat,
kim chi, …)
Giá rẻ → sử dụng
nhiều.
VSV gần như không
sống sót khi qua dạ dày

và dịch mật.
Bào tử VSV.
Thuận lợi cho nuôi
cấy, sản xuất, lưu
hành.
Mất nhiều thời gian
phát triển thành VSV →
chậm tác dụng, hạn chế
khả năng cạnh tranh với
VSV gây bệnh.
Probiotics đông
khô.
Tỉ lệ sống ở nhiệt
độ thường cao hơn
Tỷ lệ VSV bị chết vẫn
cao.

Enteric-
coated
VSV đưa vào dưới
dạng viên nén,
viên nang có lớp
bao ngoài tan
trong ruột.
Bảo vệ VSV khi đi
qua dạ dày và dịch
mật.
Mất thời gian màng bao
tan rã để giải phóng
VSV.

8


Micro-
encapsul
ated
Dạng bao vi nang.
Hoàn thiện ý tưởng
của thế hệ 2.
Chưa khắc phục được
nhược điểm của thế hệ
2: khả năng phóng thích
tại ruột chưa tốt, tan
chậm trong ruột.

Dual –
coated
Lớp bên trong là
protein, lớp ngoài
là polysaccharid.
VSV có tỷ lệ sống
cao. Chịu được
acid dịch vị và
muối mật. Lớp bao
bên trong có tính
thúc đẩy phóng
thích VSV tại đích.
Đòi hỏi công nghệ cao,
kỹ thuật bào chế hiện
đại, trang thiết bị đắt

tiền.
Giá thành cao.

Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta là Công ty
TNHH một thành viên Pasteur Đà Lạt, Công ty TNHH một thành viên vaccin
và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm quen thuộc trên thị trường như
Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver. Tuy nhiên,
nguyên liệu chủ yếu trong các chế phẩm probiotics của Công ty TNHH một
thành viên Pasteur Đà Lạt cũng như công ty TNHH một thành viên vaccin và
sinh phẩm Nha Trang đều là chủng vi sinh vật Bacillus subtilis. Và mới đây
đã xuất hiện thêm công ty ANABIO R$D, có nhà máy sản xuất nguyên liệu
probiotics hiện đại không kém so với các nước trên thế giới. Ngoài việc sản
xuất nguyên liệu probiotics cổ điển trong nước như nguyên liệu chứa chủng vi
sinh vật Bacillus subtilis, ANABIO còn có thêm nguyên liệu chứa các chủng
vi sinh vật lactic. Do vậy, thị trường chế phẩm probiotics không chỉ lớn về số
lượng mà còn đa dạng về chủng loại vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm
các chế phẩm probiotics đã được hạ nhiều lần, người sử dụng có thể sử dụng
9

sản phẩm chất lượng cao mà giá thành lại rẻ. Tuy nhiên, sản phẩm ở đây vẫn
chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên khả năng bảo vệ VSV vẫn còn rất thấp (Bảng 1.2.)

Bng 1.2: Một số chế phẩm probiotics trên thị trường Việt Nam
STT





1

1
L-Bio-3D
300mg vi khuẩn: L. acidophilus,
B. longum, L. rhamnosus
Me-Auspharm
– Việt Nam
2
1
Antibio
Gói bột uống 1g chứa 10
8
cfu L.
acidophilus
Organon – Mỹ
3
1
Biosubtyl
LD
Gói 1g chứa 10
7
- 10
8
vi khuẩn B.
subtilis và L. acidophilus
Viện vaccin
Đà Lạt – Việt
Nam
4
1
Biolacto

Viên nang chứa ít nhất 10
8
vi
khuẩn L. acidophilus và L. bul
garicus
Union – Mỹ
5
1
Lactomed
Viên nang 320 mg chứa:
L. bifidus 2 ×10
6
vi khuẩn
L. acidophilus 2 × 10
6
vi khuẩn
Streptococcus faecalis 2 × 10
6
vi
khuẩn
II Dong - Hàn
Quốc
6
1
Ultraflore
Viên nang 0,2 g chứa 2 × 10
9
nấm
men Saccharomyces cerevisiae
Sobio – Pháp

7
1
Antibio
-philus
Viên nang chứa 2 × 10
8
– 2 × 10
9

vi khuẩn L. acidophilus
Lyocentre –
Pháp
8
1
Probio
Gói bột đông khô chứa 10
9
L.
Imexpharm –
10

acidophilus
Việt Nam
9
2
Abiiogran
Thuốc cốm, 1g chứa 10
8
cfu L.
acidophilus

Dae Han New
Pharm – Hàn
Quốc
10
3
Lactomin
plus
Hỗn hợp Probiotics bao vi nang
chứa L. acidophilus, B. longum, L.
rhamnosus 300 mg
Mebipharm-
Austrapharm
– Việt Nam
11
4
Laclean
gold
Bột cốm pha hỗn dịch chứa Lactic
Acid Bacteria 1,25 x 10
9
,
L.acidophilus (100 tỉ cfu/g); L.
rhamnosus (100 tỉ cfu/g); B.
longum (50 tỉ cfu/g); B. bifidum
(50 tỉ cfu/g); Enterococcus
faecium (100 tỉ cfu/g)
Cell-biotech –
Hàn Quốc
12
4

Kidlac
Bột cốm pha hỗn dịch uống:
Lactic Acid Bacteria 0,5 x 10
9
, L.
acidophilus (100 tỉ cfu/g), B.
longum (50 tỉ cfu/g), B. breve (50
tỉ cfu/g), Enterococcus faecium
(100 tỉ cfu/g)
Cell-biotech –
Hàn Quốc

1.3. Lactobacillus acidophilus
1.3.1. m hình thái, sinh lý
L. acidophilus thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, là trực khuẩn
Gram dương, kích thước từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0 µm, mọc đơn hoặc đôi hoặc
tạo chuỗi ngắn, không có bào tử, không di động, kỵ khí không bắt buộc, phản
11

ứng catalase âm tính, phát triển tối ưu ở 37
0
C, không phát triển ở 20 – 22
0
C
hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48
0
C [4], [12], [44].


Hình 1.1: Hình ảnh L. acidophilus trên kính hiển vi điện tử.

1.3.2. Kh n hóa carbohydrat
L. acidophilus chuyển hóa glucose, lactose, sucrose sinh acid lactic,
nhưng không sinh khí; không chuyển hóa glycerol, erythritol, D-arabinose, L-
arabinose, D-ribose, D-xylose. [6], [12]
1.3.3. Các dng ch phm probiotics cha L. acidophilus
Trên thị trường dược phẩm hiện nay, các chế phẩm chứa L. acidophilus
chủ yếu là dược phẩm và thực phẩm chức năng bào chế dưới dạng bột, cốm,
nang cứng.
Khác với chế phẩm khác, chế phẩm probiotics phải duy trì số lượng VSV
sống sót nhất định trong thời hạn sử dụng cũng như trong hệ thống tiêu hóa
của người sử dụng. Do đó, phương pháp sản xuất và thành phần chế phẩm
probiotics được cải biến khác so với chế phẩm thông thường.
Về thành phần, chế phẩm probiotics thường có thêm các tá dược bảo vệ
như chất xơ, đường,…
Về phương pháp sản xuất nguyên liệu, hiện nay có rất nhiều phương pháp
sản xuất nhằm tăng khả năng bảo vệ VSV. Điển hình là phương pháp bẫy
bằng cách tạo vi nang [21], phương pháp phun sấy [15],…Trong đó, một
trong những phương pháp tỏ ra hiệu quả và được sử dụng nhiều là phương
12

pháp đông khô. Phương pháp đông khô giúp cho VSV ổn định và giúp VSV
có tỷ lệ sống sót cao trong thời gian bảo quản. [17]
1.4. Alginate
1.4.1. Tính cht
Alginate có nguồn gốc chủ yếu là từ tảo nâu, rong mơ. Alginate là tên
chỉ chung acid alginic và 1 số muối của nó như natri alginate, kali alginate.
Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai
gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M).[43]

Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-
mannuronic
Tùy theo nguồn gốc của alginate mà độ dài trung bình của mạch phân
tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác
nhau. Điều này làm cho tính chất của alginate biến đổi trong một dải rộng.
Muối natri của acid alginic dễ hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu được
bảo quản trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp. Dung dịch Natri
alginate ổn định nhất ở pH 4÷10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại, hấp tiệt
khuẩn có thể làm giảm độ nhớt của dung dịch [24], [43], [50].
13

Thực tế natri alginate không tan trong ethanol (95%), ether,
chloroform, và hỗn hợp ethanol nước có chứa hơn 30% ethanol. Không tan
trong các dung môi hữu cơ khác và trong dung dịch acid có pH<3. Tan chậm
trong nước, tạo dung dịch keo nhớt [43], [18].
Tùy theo nguồn gốc của phương pháp sản xuất mà natri alginate có độ
nhớt khác nhau, dao động từ 10 ÷ 3000.u. Thông thường độ nhớt của dung
dịch natri alginate 1% (kl/tt) có độ nhớt khoảng 20-400 mPas. Độ nhớt của
natri alginate thay đổi theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của các ion
kim loại [43]. Dung dịch natri alginate 1% với dung môi nước có pH đạt 7,2
[43].
1.4.2. 
Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginate được sử dụng làm tá
dược rã, tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong bào
chế viên giải phóng kéo dài. Natri alginate còn được sử dụng làm tá dược độn
trong dạng viên nang, tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất trong các chế
phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ, chất nhũ hóa giúp ổn định thể

chất nhũ tương, hỗn dịch. Trong thời gian gần đây natri alginate được sử dụng
để bào chế dạng vi nang và siêu vi nang chứa dược chất, hay được sử dụng
trong một số dạng chế phẩm tác dụng tại chỗ khác như thuốc nhỏ mắt, nhỏ
mũi [43]. Trong công nghệ vi sinh, alginate được sử dụng trong kĩ thuật bất
động tế bào và bất động enzym, ngoài ra hiện nay nó đang được nghiên cứu
ứng dụng để tạo vi nang chứa vi sinh vật để tăng khả năng sống của chúng
trong các điều kiện bất lợi [21], [31], [41].
Trong ngành y tế, loại vải sợi sản xuất từ natri và calci alginate được sử
dụng để băng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn. Ngoài
ra, do tính trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong
14

nước, natri alginate được sử dụng trong một số thuốc dùng để ngăn cản trào
ngược dạ dày- thực quản, giảm chứng ợ hơi… [43].
1.4.3.  alginate s
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu tìm ra phương pháp và tá
dược thích hợp nhằm cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotics
ngày càng được quan tâm. Một số nghiên cứu gần đây về vi nang hóa vi sinh
vật bằng việc kết hợp dung dịch alginate với dung dịch CaCl
2
đã làm gia tăng
số lượng VSV sống sót trong các điều kiện bất lợi như: nhiệt độ cao, acid thấp
dạ dày, muối mật [21], [31], [43]. Latha Sabikhi đã thực hiện nghiên cứu
năm 2010 về đánh giá khả năng bảo vệ L. acidophilus trong chế phẩm
probiotics bằng phương pháp tạo vi nang với alginate. Với nguyên liệu ban
đầu chứa khoảng 10
9
cfu/g, mẫu không được bảo vệ đều có số lượng sống sót
sau 1h, 2h trong điều kiện pH 1 giảm xuống còn khoảng 10
5

÷10
6
cfu/g (giảm
khoảng 1000 lần), còn với phương pháp tạo vi nang thì sau 1h trong pH 1 số
lượng Lactobacillus acidophilus LA1 giảm từ 10
7
cfu/g lúc ban đầu xuống
còn khoảng 10
6
cfu/g (nghĩa là giảm khoảng 10 lần), sau 2h trong điều kiện
acid pH 1, số lượng VSV của mẫu bao vi nang còn 10
5
cfu/g (giảm 100 lần so
với ban đầu). Còn trong thí nghiệm có sử dụng alginate làm tá dược độn thì
sau 1h trong môi trường acid HCl pH 1,2 số lượng vi sinh vật giảm từ 1,7 x
10
9
cfu/g xuống còn khoảng 1,9 x 10
7
cfu/g (tương đương khoảng xấp xỉ 100
lần), còn tại thời điểm sau 2h lượng vi sinh vật còn lại là khoảng 1,1 x 10
7

cfu/g (giảm khoảng 155 lần so với ban đầu) [31].
Một số nghiên cứu khác lại cho thấy việc tạo nang cứng với các muối
alginate của các kim loại hóa trị một (muối natri alginate hoặc kali alginate)
cũng cho tác dụng bảo vệ vi sinh vật. Randolph Stanley Porubcan nghiên cứu
tạo nang cứng probiotics chứa natri alginate với hàm lượng biến thiên từ 10%
đến 99%. Kết quả của nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phối hợp tối ưu này là 20 ÷
15

60%. Cũng theo nghiên cứu của Randolph Stanley Porubcan, số lượng VSV
bị chết trong môi trường acid pH 1,6 không nhiều, cụ thể trước khi thử trong
môi trường acid pH 1,6 thì số lượng cfu/ nang là 9,0x10
9
, sau khi thử trong
môi trường acid pH 1,6 trong 90 phút số lượng cfu/ nang không chứa alginate
nhỏ hơn 10
4
, còn số lượng cfu/ nang chứa alginate là 4x10
8
. Kết quả nghiên
cứu cũng cho thấy khi sử dụng alginate làm tá dược độn trong nang cứng đã
làm gia tăng tỷ lệ VSV sống sót trong môi trường acid pH thấp [42].
1.5
Đông khô được định nghĩa như là một quy trình tạo sự ổn định mà trong
đó vật cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có
trong vật (dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau
đó là quá trình khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị mà sẽ không thể khiến VSV
phát triển hoặc xúc tác các phản ứng hóa học [17], [32].
Đông khô gồm có 3 giai đoạn chính: tiền đông, thăng hoa và làm khô
 
Tiền đông là giai đoạn đầu tiên của quá trình đông khô, thường được tiến
hành ở nhiệt độ -70
0
C đến -80
0
C. Ở giai đoạn này phần lớn nước được tách
ra khỏi dược chất và tá dược, hệ tách thành nhiều pha. Kết thúc giai đoạn
này, có thể có trạng thái kết tinh, vô định hình hoặc kết tinh kết hợp với vô

định hình. [17], [11]
 
Ở giai đoạn này vật được đặt trong buồng sấy, tiến hành hút chân không.
Nước được chuyển trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không
qua giai đoạn lỏng. Trong giai đoạn này nhiệt độ và áp suất bên trong buồng
sấy được duy trì ở mức dưới nhiệt độ đóng băng. [17], [11]
 Giai 
16

Ở giai đoạn này nhiệt độ tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết và ở
trạng thái lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy
trong các thiết bị sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong
buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa. [11]
1.5.1. 
Đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như:
Giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; Giữ được hoạt tính sinh học; Bảo vệ
nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin… Giữ
nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp
thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu. Tuy nhiên, phương pháp đông khô cũng
có những nhược điểm riêng khiến nó chưa được sử dụng rộng rãi: giá thành
thiết bị cao; vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ
thuật cao; tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao [11].
1.5.2.  
Do những ưu nhược điểm ở trên nên phương pháp đông khô chỉ được áp
dụng trên các sản phẩm có yêu cầu chất lượng cao, đồng thời kém bền với
nhiệt độ cao. Trong ngành Dược được ứng dụng để sản xuất các bột đông khô
để pha tiêm (ví dụ: kháng sinh penicillin, cephalexin…), làm khô các chế
phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật. Ngoài ra đông khô cũng được sử
dụng như một phương pháp bảo quản trong ngành công nghiệp thực phẩm để
bảo quản 1 số sản phẩm khác.

1.5.3. 
Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng nó cũng là
1 trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá
trình tạo nguyên liệu và chế phẩm probiotics. Đặc biệt giai đoạn tiền đông là
nguyên nhân gây lên áp lực cho thành tế bào vi khuẩn. Đông lạnh làm cho lớp
lipid màng tế bào dễ bị tổn thương. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay