Nghiên cứu xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp LC và MS MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN VĂN THUẬN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT
SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC/MS-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN VĂN THUẬN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT
SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LC/MS-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2014



LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS.
Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo dục,
người đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn
thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương – Giám Đốc
Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội người đã tận tình giúp đỡ và t
ạo điều kiện cho
em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thành Đạt – Phó Giám Đốc
Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội đã hết lòng hướng dẫn em thực hiện khóa luận
này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Kiểm
Nghiệm Hà Nội, gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo
động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Hà nội, ngày 03 tháng 09 n
ăm 2014

Học Viên
Nguyễn Văn Thuận


LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3
1.1.2. Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin
nghiên cứu 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6
1.2.1. Các phương pháp chiết tách 6
1.2.2. Tổng quan về phương pháp săc ký lỏng- khối phổ 11
1.2.2.1. Thiết bị khối phổ 11
1.2.2.2. Một số kỹ thuật ghi phổ 14
1.2.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng- khố
i phổ 15
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ
TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 15
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI 17
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20
2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn 20
2.1.2.

Máy móc- thiết bị 20
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu 21
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.2.1. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu 21
2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 21
2.2.3. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số Cephalosporin bằng
kỹ thuật LC/MS/MS 22
2.2.4. Đánh giá phương pháp phân tích 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 26
3.1.1. Khảo sát điều kiện đo phổ khối 26
3.1.2. Khả
o sát điều kiện LC 28
3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 36
3.1.4. Quy trình phân tích 39
3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 41
3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống 41
3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp 41
3.2.3. Độ tuyến tính 46
3.2.4. Độ đúng và chính xác của phương pháp 46
3.2.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚ
C THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC 51
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 54
4.1. LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 54
4.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 54
4.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 56
4.3.1. Tình hình kháng kháng sinh 56

4.3.2. Nghiên cứu dư lượng kháng sinh trong môi trường tại Việt Nam 58
KẾT LUẬN 60
KIẾN NGHỊ 61
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril
BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia)
IS Internal standard (chuẩn nội)
C18 Octadecyl carbon chain
DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector)
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography)
LC-
MS/MS
Sắc kí lỏng khối phổ 2 lần (High perform liquid chromatography
–
Tandem
Mass Spectrometry)
t
R
Thời gian lưu
S
píc
Diện tích pic
S
IS
Diện tích pic của chuẩn nội
TB Trung bình
MeOH Methanol
mg Milligram
ml Mililit

PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis)
UV - VIS Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible absorption
Spectrophotometry)
LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
SPE Chiết pha rắn (solid phase extraction)
IAC Chi
ế
t ái lực miễn dịch
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin 4
Bảng 1.2.Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu cần có 20
Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hóa ESI 26
Bảng 3.2: Kết quả lựa chọn ion mẹ 27
Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các kháng sinh, IS 28
Bảng 3.4. Chương trình Gradient pha động 29
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát cột sắc ký 31
Bảng 3.6. Khảo sát qui trình chiết pha rắn 37
Bảng 3.7. Kết quả kh
ảo sát qui trình chiết pha rắn 38
Bảng 3.8. Điều kiện LC và MS 40
Bảng 3.9. Độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích của kháng sinh so
với chuẩn nội 42
Bảng 3.10: Sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ của diện tích kháng sinh và chuẩn nội
theo nồng độ 47
Bảng 3.11. Đánh giá độ chính xác và độ đúng của phương pháp 48
Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của phương pháp 49
Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải thứ nhất 51
Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải thứ hai 52

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin 3
Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ 1 2
Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chương trình pha dộng 29
Hình 3.2. Kết quả khảo sát cột sắc ký 32
Hình 3.3: Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 34
Hình 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động 36
Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết của 2 qui trình chiết pha rắn 38
Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 45
Hình 3.7. Sắc ký đồ m
ẫu LOD 50
Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử thứ nhất 52
Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử thứ hai 53











1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc sử dụng kháng sinh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát đang trở thành vấn đề
thời sự của ngành y tế, trong đó việc gia tăng tình trạng kháng kháng sinh đang
là hậu quả nghiêm trọng. Bên cạnh nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không
hợp lý thì một lý do khác đang được quan tâm là sự tồn tại dư lượng kháng sinh

và những chất chuyển hoá của chúng trong môi trường vì chỉ cần m
ột dư lượng
nhỏ kháng sinh thải ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi
khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc. Hướng nghiên
cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động
của chúng trong môi trường được bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế
kỷ 20 và rất được quan tâm tại các nước phát triển. Nhi
ều nghiên cứu đã cho
thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi
trường nước đã trở nên phổ biến [17], [36].
Song song với việc nâng cao chất lượng chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân
dân, lĩnh vực sản xuất thuốc được đặc biệt chú trọng. Hiện cả nước có khoảng
gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc v
ới đủ
chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và
vitamin…Kháng sinh nhóm Cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng trên trực
khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn tại nước ta. Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản
xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên
nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồ
n dư kháng sinh
nhóm Cephalosporin trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được
quan tâm đúng mức. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên

2
cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải bệnh viện [2], nước
sông [34],nhưng đối với đối tượng nước thải từ cơ sở sản xuất dược thì mới bước
đầu nghiên cứu và có một nghiên cứu về dư lượng cefixim được công bố [20].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy d

ược
phẩm bằng phương pháp LC/MS-MS” với các mục tiêu như sau:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích và qui trình xử lý mẫu để xác
định đồng thời dư lượng các kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim trong
nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng kỹ thuật LC/MS-MS ở nồng độ ppb.
2. Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và
bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá d
ư lượng kháng sinh trong nước
thải của nhà máy sản xuất dược phẩm.

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng
* Công thức chung của cephalosporin

S
N
NH
R
1
O
R
2
H
O
OOH
H
H
R

3

Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin
Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), mang cấu trúc
3
-cephem,
3
mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –
lactam để hợp chất có tác dụng sinh học.
Trong A7AC, các carbon bất đối C
(6)
và C
(7)
đều có cấu hình R, và hầu
như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [7]
* Phân loại và phổ tác dụng

Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác
dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh
hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại [12]. Phổ chung của
các thế hệ cephalosporin được giới thiệu tại Bảng 1.1

4
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin [4], [12]
Nhóm
Tên đại
diện
Phổ tác dụng
Thế hệ

I
Cephalexin
Cephalothin
Cephazolin
…
- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn
Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu
kháng methicillin).
Thế hệ
II
Cefaclor
Cefuroxim
Cefotetan…
- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác
dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng
trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn.
Thế hệ
III
Cefixim
Cefoperazon
Cefotaxim
Cefdinir…
- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β-
lactamase, tác dụng trên cả P. aeruginosa.
- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1.
Thế hệ
IV
Cefepim… - Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3.
Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn
Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas,

Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu.
- Bền vững với β-lactamase.

1.1.2. Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin
nghiên cứu


5
Bảng 1.2. Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu [3],[7],[14]
Tên chất
Thế
hệ
Công thức phân tử,
công thức cấu tạo
Tính chất vật lí


1. Cefuroxim


II

C
20
H
22
N
4
O
10

S
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Ít tan trong nước, tan trong
aceton, ethyl acetat và methanol,
ít tan trong ethanol.
- Độ tan trong nước: 0,284 g/l.
- pK
a1
= 3,15; pK
a2
= 1,1




2.Cephalexin



I

C
16
H
17
N
3
O
4
S

- Dạng bột kết tinh màu trắng, hơi
có mùi lưu huỳnh.
- Tan ít trong nước; tan trong các
dung dịch kiềm loãng, thực tế
không tan trong ethanol 96%,
ether.
- Độ tan trong nước: 2,97.10
-1
g/l
- pK
a1
= 3,45; pK
a2
= 7,44


3.Cefixim








III

C
16
H
15
N
5
O
7
S
2


-Bột trắng hoặc gần như trắng. Ít
tan trong nước, aceton, glycerin,
tan trong methanol, propylen
glycol, hơi tan trong ethanol, thực
tế không tan trong ether, ethyl
acetat và hexan, hầu như không
tan trong dung dịch sorbitol 70%
-Độ tan trong nước: 0,104 g/l.
-Hằng số pK
a1
= 3,45; pK
a2

= 2,92

6

5.Terbutaline

C
12
H
19
NO
3


- pK
a1
= 8,86; pK
a2
= 9,76
- Dạng bột kết tinh màu trắng
hoặc trắng xám, không mùi hoặc
có mùi của acid acetic.
- Dễ tan trong nước, ít tan trong
methanol
- pK
a1
= 8,86; pK
a2
= 9,76

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.2.1. Các phương pháp chiết tách
a. Chiết lỏng- lỏng
Chiết lỏng- lỏng là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung
môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất. Các
dạng chiết xuất bao gồm:
+ Chiết các chất dạng acid, base hoặc chất lưỡng tính.
+ Chiết các chất dạng nội phức.
+ Chiết cặp ion.
Chiết lỏng- lỏng là kỹ thuật đơn giản, dễ
thực hiện và được sử dụng phổ biến
nhất trong các phương pháp xử lý mẫu huyết tương và mẫu có nền mẫu tương
đối phức tạp. Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm: dùng nhiều dung môi, khó
khăn kết nối với các thiết bị như GC hay HPLC, có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch
kết quả.
b. Chiết pha rắn
Chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE) là một phương pháp chiết d
ựa vào
sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được

7
chiết từ pha lỏng vào pha rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào
các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ
được giữ lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung
môi khác phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so
với thể tích dịch ban đầu. Vì thế qua chiết pha rắn, ngoài tác dụ
ng làm sạch có
thể thực hiện thêm bước làm giàu mẫu. Ngoài ra, người ta có thể sử dụng luồng
khí nóng để rửa giải các chất từ pha rắn, đây là cách thuận tiện để chuyển các
chất vào phân tích trên sắc ký khí [6], [10], [29].

Quá trình chiết pha rắn trải qua 4 giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa tạp
chất và rửa giải [10].
- Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để làm ướt các
nhóm ho
ạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung
môi.
- Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ để
đưa mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được toàn
bộ chất phân tích trên cột. Chất phân tích cùng một số chất khác được giữ lại trên
cột, các tạp chất đi ra khỏi cộ
t càng nhiều càng tốt để tránh cạnh tranh và ảnh
hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh.
- Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác có
liên kết với pha tĩnh. Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa tan và
kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích.
- Rửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột được hòa tan và kéo ra khỏi cột
bằng một dung môi phù hợp. C
ần phải tối ưu loại dung môi rửa giải, thể tích

8
dung môi rửa giải, pH dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải…để có thể rửa giải
được tối đa chất phân tích nhưng rửa giải tối thiểu các tạp chất còn trên cột.
¾ Các loại pha rắn cơ bản và ứng dụng trong phân tích
Chiết pha rắn có bản chất tương tự như sắc ký lỏng, vì thế các loại pha rắn được
sử dụng trong SPE hầu hết tươ
ng tự pha rắn của cột sắc ký lỏng. Tuy nhiên có sự
khác nhau nhất định về dạng hoặc tính chất của pha rắn. Hầu hết các chất hấp
phụ sử dụng trong SPE đều có bản chất nền Silica có gắn với các nhóm hữu cơ
khác.
* Nền silica (SiO

2
).
Silica là một polymer vô cơ có cấu trúc chung là (SiO
2
)
x
, có thể được tạo
thành nhờ quá trình polymer hóa acid silicic. Bề mặt silica có chứa các nhóm
hydroxyl (-OH) và thường được gọi là nhóm silanol (SiOH).
Tùy theo đặc tính của pha liên kết mà có thể chia thành một số loại cột có
bản chất khác nhau, có thể kể ra bao gồm pha đảo, pha thuận và trao đổi ion.
- Pha đảo: Nền silica gắn thêm các nhóm không phân cực như C8, C18…
- Pha thuận: Nền silica gắn thêm các nhóm phân cực như –NH
2
, -CN,
diol…
- Trao đổi ion: Nền silica gắn thêm các nhóm trao đổi cation (dẫn chất
phenylsulfonic) hoặc anoin (dẫn chất amoni bậc 4).
* Florisil (Magnesi silicat)

9
Magnesi silicat (MgSiO
3
) là các loại hạt có đường kính từ 25-200 µm kích
thước thông thường từ 60-100 µm. Đây là loại chất hấp phụ ít phân cực và tính
acid yếu hơn so với Silica. Vì có bản chất phân cực yếu nên Florisil thường được
dùng cho các HCBVTV rất phân cực, những chất mà không thể sử dụng cột
silica do liên kết quá mạnh với các nhóm silanol.
* Graphite cacbon (than chì)
Nền than chì cũng đã được một số tác giả nghiên cứu làm pha rắn trong

SPE. Than chì là chất kỵ nướ
c bởi vì cấu trúc bao gồm các lớp carbon phẳng
dạng lục giác. Bề mặt có dạng xốp, cũng có các nhóm hoạt động như nhóm
hyroxyl, nhóm carbonyl và các nhóm acid vì thế có thể hấp phụ các chất khác.
Bề mặt này cũng có thể gắn các nhóm tương tự như đối với nền silica.
* Nền polymer hữu cơ tổng hợp
Các loại nền có bản chất tự nhiên đã chứng minh được vai trò quan trọng
của nó trong SPE, tuy nhiên nh
ững nền này dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường, có
thể bị bất hoạt bởi các yếu tố bên ngoài như không khí, nước, môi trường pH. Để
thay thế, ngày nay người ta sử dụng các loại nền polymer hữu cơ trên cơ sở trùng
hợp một số chất hữu cơ. Những chất này có diện tích bề mặt lớn, dung lượng hấp
thu lớn hơn bởi vì tỷ lệ carbon cao hơ
n và bề mặt kỵ nước hơn. Hơn nữa khoảng
pH làm việc của nền polymer rộng hơn so với nền silica.
- Styren-divinylbenzen (PS-DVB)
Nền PS-DVB thu được khi đồng trùng hợp styren và divinylbenzen, có
diện tích bề mặt lớn nên dung lượng của cột rất cao, hoạt động ở bất kỳ khoảng

10
pH nào vì không có nhóm silanol. Đây là pha rắn thích hợp cho các chất kém
phân cực, không phân cực có khối lượng phân tử lớn.
- Các nền polymer chứa nhóm hoạt động
Gần đây, nhiều tác giả đã nghiên cứa phát triển để gắn các nhóm ưa nước
trên nền PS-DVB nhằm tăng tính chọn lọc và khả năng ứng dụng của loại cột
này. Điển hình nhất có thể kể đến là cột Oasis HLB.của Waters. HLB
(Hydrophilic Lipophilic Balance) có nghĩa là cân bằng thân nước, thân dầu. Loại
cột này được chế tạo bằng cách đồng trùng hợp N-vinylpyrrolydon và
divinylbenzen, trên bề mặt có hai vùng, một vùng thân nước và một vùng thân
dầu.

* Mixed mode.
Cột Mixed mode (tính năng trộn lẫn) là cột có nhiều cơ chế lưu gữ khác
nhau, nhằm đạt hiệu quả cao hơn trong quá trình làm sạch mẫu. Thông thường,
cột mixed-mode có hai cơ chế lưu giữ khác nhau.
* Ái lực miễn dịch.

Chiết bằng ái lực miễn dịch (IAC) dựa trên liên kết kháng nguyên – kháng
thể trong đó một loại imunoglobulin được dùng để gứn với chất phân tích. Bởi vì
imunoglobulin liên kết chọn lọc với chất kháng nguyên dùng để sản xuất ra nó
nên đây là kỹ thuật lý tưởng để phân tích chọn lọc một một chất hoặc một nhóm
chất nào đó. Ứng dụng của IAC còn khá hạn chế do kỹ thuật này có ứng dụng
hạn chế và khá tốn kém.


11
1.2.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ [1],[13]
Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry) là một phương pháp phân
tích dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Phương
pháp này nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân
tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử
trong một điện trường hoặc từ trường nhất định.

Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được
chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích
hợp. Các ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối
phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion
dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về
ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến h
ơn.
1.2.2.1.Thiết bị khối phổ [13],[31]

Một khối phổ kế bao gồm các bộ phận chính như sau:
Bộ nạp mẫu (Inlet):
Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối phổ. Có hai
phương pháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần phân
tích:
Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng (dễ bay hơi) b
ằng
syringe
tiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC/MS), sắc khí lỏng (LC/MS).
Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các rắn, tinh thể, sơn hoặc keo
Bộ nguồn ion hóa (Ion source): Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành
các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà

12
thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng
cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân
không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn
(hội tụ). Mỗi ion có khối lượng m và điện tích z nhất định. Tỷ số m/z (hay còn
gọi là số khối) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuy
ển động này của ion. Đây là
một thông số rất quan trọng trong định tính cũng như định lượng.
− Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ
được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ
trường để đi đến bộ phận phát hiện.
− Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuế
ch
đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
− Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ

Trong đó:
1: Bộ nạp mẫu (Inlet)
2: Bộ nguồn ion hóa (Ion source)
3: Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)
4: Bộ phận phát hiện (Detector)
5: Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
54
3
2
1

13
Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ
phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương
thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình
phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất
khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại
hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương
đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Để khắc phục những khó khăn trên, cần
phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện
(interface technology) như chùm tia hạt, bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục
… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80 nhờ
kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API)
mới tạo ra bước đột phá thật sự cho phương pháp LC-MS/MS.
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển
ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước
đó cho LC-MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous
Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS)
đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft
ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được

khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển
được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân
tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS:
• Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI).
• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI).
• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photon
Ionization – APPI).

14
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.
1.2.2.2. Một số kỹ thuật ghi phổ [13],[31]
Trong phân tích khối phổ việc xác định chính xác 1 ion rất quan trọng cho
việc xác định được hợp chất cần phân tích. Một hợp chất xác định trong những
điều kiện nhất định sẽ cho 1 ion có số khối xác định trên phổ đồ. Tuy nhiên, một
ion có số khối xác định trên phổ đồ lại có thể xuất phát từ nhiều hợp chất khác
nhau vì vậy trong phân tích một hỗn hợp hoặc lẫn nhiều tạp chất nếu điều kiện
sắc kí chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định các ion thông qua số khối
trên phổ đồ có thể bị ảnh hưởng. Đối với trường hợp này khối phổ 1 lần (MS) có
thể cho kết quả không chính xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần (2 lần
MS/MS).
+ Quét toàn phổ (Full Scan)
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường
dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với
đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo
sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường
được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất.
+ Selected Ion Monitoring (SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng

cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa
chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện
có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để
khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

15
+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ
thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
− SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò
để phát hiện.
− MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng
nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ
MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ
cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng
va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan
tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
1.2.2.3.Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ
Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà
khối phổ thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành
phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong
dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản,
chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi
trường. Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định
mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích.
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ
TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
Hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh và các loại dược phẩm nói chung

có trong môi trường ngày nay rất được quan tâm ở các nước phát triển. Ví dụ

16
như một nghiên cứu tại New Mexico (Hoa Kỳ) đã phát hiện ra ngoài kháng sinh
còn có một số dược phẩm như: thuốc chống trầm cảm, chống dị ứng, viêm, và
hoóc môn trong nước bề mặt và nước ngầm ở các nồng độ khác nhau. Nhóm
nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ
(HPLC-MS/MS) để xác định các kháng sinh nhóm Tetracyclin có trong các
nguồn nước tự nhiên. Cụ thể oxytetracyclin 1890 – 4600 ng/L; tetracyclin 660
ng/L [28].
Nghiên cứu của Dương Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng được
phương pháp phân tích sự có mặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nước
thải bệnh viện. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột
silicagel tự chế tạo và định lượng được các kháng sinh ciprofloxacin,
norfloxacin, levofloxacin, ofloxacin và lomefloxacin có mặt trong nước thải
bệnh viện bằng HPLC với detector huỳnh quang. Điều kiện sắc ký: cột C18,
nhiệt độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bước sóng kích thích 278 nm và
bước sóng phát xạ 445 nm. Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến
106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [2].
Trong đề tài nghiên cứu về dư lượng kháng sinh Macrolides, Sulfonamides
và Trimethoprim ở lưu vực sông Mê Kong, Satoshi Managaki và cộng sự đã sử
dụng phương pháp LC/MS/MS với cột sắc ký YMC pro C18 (3 µm, 150 mm ×
2 mm), pha động là hệ: Dung dịch acid formic 1% - MeOH (1 % acid formic)
chạy gradient, với tốc độ dòng là 0,15 ml/phút. Mẫ
u nước sông được xử lý bằng
kỹ thuật chiết pha rắn với cột Oasis HLB (200mg, Water). Giới hạn định lượng
của phương pháp là từ 0,1 – 1,2 ng/ml [34].
Vishal et al cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dư lượng của các kháng
sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và

17
levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ tại các thời điểm
khác nhau. Dư lượng ciprofloxacin được phát hiện là 2,20 – 236,6 µg/l và
norfloxacin là 6,4 – 29,6 µg/l. Một nghiên cứu khác cũng đã xây dựng phương
pháp để xác định các nhóm thuốc kháng sinh fluoroquinolon, sulfonamid,
trimethoprim, beta-lactam (penicillin và cephalosporin), nitroimidazol và
tetracyclin trong nước thải bệnh viện. Kết quả cho thấy nồng độ chất phân tích
khác nhau dao động trong phạm vi sau đây (đơn vị µg/l): ciprofloxacin 3,6-
101,0; metronidazol 0,1-90,2; sulfamethoxazol 0,4-12,8; ofloxacin 0,2-7,6;
trimethoprim 0,6-7,6; và doxycyclin 0,6-6,7 [35],[36].
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC
CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI
Nghiên cứu của Xiao-Lin Hou và cộng sự (2013) đã xây dựng và đánh giá
dư lượng của 10 cephalosporins (cefalexin, cefquinome, ceftiofur, cefacetrile,
cefalonium, cefapirin, cefazelin, cefoperazone, cefradine, cefotaxim) và
desacetylcefapirin trong sữa bò bằng kĩ thuật UHPLC-ESI-MS/MS. Các mẫu
được chiết pha rắn qua cột HLB sau khi pha loãng với dung dịch đệm phosphate
(pH 8,5). Mẫu được phân tích bằng LC-MS/MS trên cột UPLC BEH RP18
(2,1mm × 100 mm, 1,7µm) với gradient rửa giải (acid formic 0,1% và MeOH).
Nghiên cứu đã sử dụng chuẩn nội là Ceftiofur-D
3
. Các giá trị LOD từ 0,004
µg/kg đến 0,60 µg/kg; LOQ từ 0,014 µg/kg đến 2,0 µg/kg. Phương pháp được
ứng dụng để phân tích 40 mẫu sữa thu thập trên thị trường và 9 mẫu sữa bò sau
khi tiêm dưới da Cephalexin [37].
Một nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phương pháp
xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược. Đề tài sử