Định danh vi khuẩn bacillus sp bằng chỉ thị ADN

B Y T
I HC HÀ NI






BACILLUS

KHÓA LUN TT NGHI











HÀ NI - 2015
B Y T
I HC HÀ NI





N
BACILLUS

KHÓA LUN TT NGHI






1. 

2. 



HÀ NI - 2015


LI C



tr
-

-




Ths. Hà Th Thu


Xin c i Phòng Vi sinh phân t -Vin Công
ngh sinh hc - Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit lòng giúp
c hi tài tt nghip.
Cui cùng xin c
trong sut quá trình hc tp ti gian thc hin khóa lun.




Sinh viên









DANH MC T VIT TT
DANH MC BNG
DANH MC HÌNH NH
 1
 3
1.1. Bacillus 3
1.1.1.  3

1.1.2.  3
1.1.3.  4
1.1.4.  5
1.2.  9
1.2.1.  9
1.2.2. () 13
U 17
2.1. ng, nguyên liu nghiên cu 17
2.1.1. ng nghiên cu 17
2.1.2. Hóa cht, sinh phm 17
2.1.3. Trang thit b 18
2.2. u 19
2.2.1.  pháp tách chit ADN tng s 20
2.2.2. i ADN bng PCR 22
2.2.3. n di ADN trên gel agarose 23
2.2.4.  23
2.2.5.   n np ADN plasmid vào t bào kh bin E.coli
ch. 25
2.2.6. t ADN plasmid t vi khun 26
2.2.7. t ADN bng enzym gii hn 27


2.2.8. ch ADN plasmid 28
2.2.9. i trình t ADN 28
2.2.10.  ADN 30
C NGHIM VÀ KT QU 31
3.1. Kt qu 16S rADNamyE 31
3.1.1. tách chit ADN tng s t t bào chng vi khun nghiên
cu 31
3.1.2. Kt qu16S rADN 31

3.1.3. amyE 35
3.2. So sánh trình t 16S rADN, amyE nh danh chng vi khun nghiên cu 38
N 39
4.1.     nh trình t 16S rADN   amyE c   
 39
4.2. o sánh trình t nh danh chng vi khun nghiên cu 40
KT LUN 43
 43





DANH MC T VIT TT

A,T,G,C
Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin

ADN
Acid deoxyribonucleic

BLAST
Basic Local Alignment Search Tool

bp
Base pair

dNTP
Deoxyribonucleotid triphosphat

E.coli
Escherichia coli

EDTA
Ethylen Diamin Tetra acetic Acid

EtBr
Ethidium Bromid

IPTG
-D-1- thiogalactopyranosid

LB
Luria-Bertani

MALDI-TOF
matrix assisted laser desorption ionisation-time of flight

OD
Optical Density

PCR
Polymerase Chain Reaction

rADN
ADN mã hóa cho ARN ribosom

SDS
Sodium Dodecyl Sulphat

sp.
Species

TAE
Tris - Acetic acid  EDTA

Taq
Thermus aquaticus

X-gal
5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl--D-Galactosid



DANH MC BNG

Bng 2.1.16S rADN
17
Bng 2.2. Cp mi dùng trong phn amyE
17
Bng 2.3. Thành phn phn ng PCR
22
Bng 2.4. Chu trình nhit ca phn ng P16S rADN
22
Bng 2.5.amyE
23
Bng 2.6. Thành phn phn ng to vertor tái t hp
24
Bng 2.7. Thành phn phn ng ct plasmid
27

Bng 2.8. Thành phn phn ng gii trình t gen
29
Bng 2.9. Chu trình nhit phn c trình t
29


DANH MC HÌNH NH

Bacillus subtilis
4
2Bacillus cereus
4

13
Hình 2.1.
20
Hình 2.2.
24
Hình 3.1. Kt qu tách chit ADN tng s
31
Hình 3.2. Kt qu16S rADN
32
Hình 3.3. Kt qu n di plasmid tách t các khun l
gen 16S rADN
33
Hình 3.4. Kt qu ct kim tra plasmid bng enzym gii h 
16S rADN
33
Hình 3.5. Kt quamyE
35

Hình 3.6. Kt qu n di plasmid tách t các khun l
gen amyE
36
Hình 3.7. Kt qu ct kim tra plasmid bng enzym gii h 
 amyE
37
1



c s dng các ch phm cha vi khu
u tr các ri long min d nên ph bin
trên th gii.          Lactobacillus,
Bifidobacterium, Streptococcus
Bacillus, Pediococcus, Enterococcus
s [5]hiu loài Bacillus i hóa
trong các ch phm thc phm chB. clausii, B. subtillis, 
               Lactobacillus,
Bifidobacterium. Tuy nhiên, chi Bacillus   m nhiu chng có th gây
b B. cereus. Ti Vit Nam, hàng lot ch phm
probiotics cha thành phn chính là  Bacillus c tiêu th khá
mnh. Tuy nhiên, mt v quan trng n hiu qu  an toàn ca
các ch phm này là vi khui loài công b trên nhãn hay
không? Mt      u ch ph     Vit
Nam không ch có thành ph i thành phn ghi trên nhãn mà còn
cha vi khun có kh Biosubtyl (Công ty Biophar
t),             B.
cereus B. subtilis[16,23]. Do vy, 
nh danh chính xác vi khun probiotics. Hin nay, các công
c nh danh truyn thnh danh da trên hình thái vi khun, khun lc t

ra không thc s hiu qu trong vin m c bit
i vi chi Bacillus gm nhii ging nhau.
Bacillus sp. 

1. nh trình t nucleotid ca 2 gen 16S rADN và amyE ca chng vi
khun nghiên cu.
2

2. S dng các trình t gen trên làm ch th  nh danh chng vi khun
nghiên cu.





3



1.1. Bacillus
1.1.1. 
Chi Bacillusn hình que, sinh bào t [27,29,32] thu
- vi khun G[29]
[27].
1.1.2. 
1.1.2.1. 
Chi Bacillus là mt phân b rng rãi nht trong t
ng phân lp tc [27,35]

[27].

1.1.2.2. 
 Bacillus[27]

[27,32]
c x, s khô hn và cht kh trùng [27,32]
B. anthracis
sinh bào t [32].
1.1.2.3. 
Phn ln các loài trong chi Bacillus có th phát tri 
ng hay thch máu [27]
a các loài [27].

4


Bacillus subtilis
[21].

. Bacillus cereus
[21].

1.1.2.4. 
Bacillus
[27].
 Bacillus [27].
1.1.3. 
 
- n sinh bào t
       ng bc bào t    B.
anthracis, B. cereus, B. megaterium, B. mycoides, B. thuringiensis, B.

pumilus, B. subtilis, B. licheniformis.
- i các bào t hình elip 
      .    B. alvei, B. circulan, B.
macerans, B. polymyxa.
- 
B. sphaericus [15].
 Bacillus

- u lo
yêu c
B. polymyxa.
-    ng loài tit ra nhiu carbohydrase ngo  
amylase, glucanase (      
5

B. subtilisB. amyloliquefaciens, B. licheniformis và
B. pumilus. Nh
 u ht các vi khu          u
chng có kh ng và phát trin t
glucose và t cht nhn t cui cùng. Mt s B.
anthracis, B. cereus, B. licheniformis và B. thuringiensis, vi khun k khí tu
t ra nhiu enzym ngoi bào bao gm nhii
quan tr-glucanase và protease.
-        Brevibacillus brevis - m  
 các lo
 bao
gm B.badius và B. freudenreichii.
- B. sphaericus
B. insolitus, B. psychrophilus và mt s loài khác. Tt cu khí
, phân bit vi tt c các trc khu các axit

meso-diaminopimelic trong peptidoglycan ca vách tc
c bit, B. sphaericus không s dng cho s 

histidin và glutamat.
- B. stearothermophilus
i con
i cht khác nhau, t hiu khí nghiêm ngn
hiu khí.
- 
Alicyclobacillus [34]
1.1.4. 
Chi Bacillus i quan trc tính
sinh lý và các cht chuyn hóa ca các loài Bacillus c s dng trong các ngành
công nghic phm, nông nghip và thc ph
6

sn xut mt lot các sn phc kháng
sinh và thuc trBacillus

1.1.4.1. 
Bacillus
Bacillus subtilis (natto)
               
 là mt enzym tiêu si huyt mnh c
kh các bnh tim mch [28].
Bacillus

B. subtilisB.
licheniformis [40].
Bacillus


Bacillusng 50% t ng enzym [40].
Các protease serin kic sn xut bBacillus
ng dt ty r[40].
 Bacillusng dng trong mt s
c phm, lên men, dt may, và các ngành công nghip giy
[40].
Bacillus
trong     ansucrase  B. circulans,    B.
subtilis, B. subtilis, B. coagulansB. circulans, [40].
1.1.4.2. 
Bacillus
Bacillus thuringiensi
[19,27]B. thuringiensis 

7


[19].
1.1.4.3. 
Trong chi Bacillus, Bacillus subtilis       nhân

 khác bi
t bào ca vi khun [21,27]Bacillus subtilis 168 [27].
1.1.4.4. 
Bacillus

[32].
Bacillusc biB. subtilisc phm
      a lên men truyn th     

   i các vi sinh vt khác trong      
[6].
1.1.4.5. c hc
a) 
            Bacillus, do
B.anthracis gây ra. 

[32].
B.cereus 
Staphylococcus aureus 
Clostridium perfringens [2]. Trong nh
Bacillusn mt lot các
bnh nhim trùng bao gm c các  áp xe, nhim khun huyt, nhim trùng vt
ng, nhim trùng tai, viêm ni tâm m
c và hô hp và nhing tit ni
n các loi nhim trùng là B. cereus, tiB.
8

licheniformis và B. subtilis cp, các loài Bacillus có th làm trm
trng cách sc ty mô
hoc cht chuy[32].
b) 
Bacillus  u c
bào to ra bi Bacillus dng trong
u tr là bacitracinB. licheniformis, gramycidin Styrotricidin
B. brevis, polymyxinB. polymixaB. circulans [4,40,46].
Riêng  Bacillus subtilis  n xu    subtilin,
bacilysin, subsporins A-C, và rhizocticins A-D [40].
enzym penicillinamidase do B. megatherium sinh ra 
- 

-lactamase [4].
c) s

vt sng có li cho sc khe vt ch [45]
   
[16].

             
Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus
Bacillus, Pediococcus, Enterococcus
s [5].
Bacillus sp. 
Bacillus có nhim so vi các loài không có kh 
t c chi Lactobacillus:
- Sn phng bào t có th c bo qun  nhi phòng 
u kin khô mà
9

- Bào t có th sng sót khi di chuya dch v
d dày, trong khi phn lLactobacillus b tiêu dit.
             
trong t
 [12].
Các vi sinh vt thuc chi Bacillus c s dng làm probiotics t ít nht 50
hà khoa hc s n probiotics thuc
chi Bacillus  c nghiên cu rng rãi nht là
Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus
licheniformis [12].
Trong chi Bacillus, Bacillus subtilis        


 Bacillus subtilis     Bacillus   Bacillus pumilus và
Bacillus cereus [16,23,24]           

B.cereus
 [16].


probiotics.
1.2. 

ng t
sinh - khc có th
u gen, chng ht trình t c bit [25].

[26].
1.2.1. 
10

 
n thi gian, và r
 chun hóa và gii thích [7]. Tuy nhiên, các xét nghim truy
tr 
[7].
1.2.1.1. 
a) 

m G
-i vi khun da trên ct ca
thành t bào c[42].
Vách t bào ca vi khu    t l  


t lt lc g
c màng trong [8]. Nh
phân loi vi khun da vào màu s li bi các t 
Gram. Vi khun b iodin s có màu tím khi quan
 i kính hin vi quang h  c xp vào nhóm vi khu  
nhng dòng vi khun khác không gi c m-
t mc xp vào nhóm vi khun gram âm [8].
Nhu
     

b) 
  
               

c coi là mt tiêu chunh danh vi khun,
tuy nhiên có rt nhi   t tên theo hình dng (ví d  Bacillus,
11

Streptococcus, Staphylococcus) và nó là mm quan tr nhn d


[8].

- 

- 
- 
c) 





- Hình du ho
- ng kính c, va, ln.
- a m
-  mt: mn sóng, thô, dng ht, có gai tht nh hoc sáng
l
- 
- c, m hoc trong sut.
- M 
- [42].

- 

-  [41].

- 
12

- 

- 

- 
1.2.1.2. 


           



m hóa sinh

1) IMViC.
2) 
3) 
4) Test urease.
5) Lên men các carbohydrat.
6) t.
7) 
8) 
9) Test oxidase.
10) Kho nghi[22].


              
(bioMerieux SA, La Balme-les-Grottes, France), BBL
[7].

13

- [7].
- 

- 

[7].
- 

1.2.2. ()




cid béo, phân
tích trình t gen 16S rADN-
i các công c d
truy v d liu có n nhng công c nhn dng và trình t gen
nh danh vi khun [42].
rARN 
   [3]. Gen mã hóa rARN 16S (gi tên là gen 16S rADN) thuc
ADN ribosom (Hình 1.3).



1.3. C16S 
14


Vic phát minh ra
16S rADN ca vi khu18S rADN ca
sinh vt nhân chun mng d li
t sng  [44].
Gen 16S rADN             

- 16S rARN
 
  [9,31]         gen 16S  
[31].
- Gen 16S rADNng 1550 bp và bao gm c vùng bi
bo tn.  l  s

ng di truyn [9,31].
- Trình t gen 16S rADN nh cho mt s ng ln các chng.
GenBank u
trình t 16S rADNt
nhiu trình t so sánh vi trình t c[9].
- rADN

[44].
- Gen 16S rADN[9,31].
16S rADN

16S rADN

[42].

- [44].
15

- 44
 thu
[36,37,44]
[36,37].
- 

[33].
16S
rADN
- 

- Chng c d lii là t[10,11].

-  ng trình t cn thit gia các ch
[9].
Gen 16S rADN 
 
 [17].
Mng mi trong các nghiên cu phân loi vi sinh v c
quan tâm nh dng ch th phân t gm mt lot gen mã hóa
protein thay th  A, B ca enzym
ARN polymerase (rpoA, rpoB), gen mã hóa ti   A, B ca enzym gyrase
(gyrA, gyrB), gen mã hóa cho mt s[13].
16S rADNo th di truy
16S rADN


16S [30],
                

16


u qu ng h
 phân bic các loài g
Bacillus globisporus Bacillus psychrophilus [30]
chi Mycobacterium [38].
 Bacillus
phân   -4 gly     amyE    -
Bacillus.






17

U

2.1. ng, nguyên liu nghiên cu
2.1.1. ng nghiên cu
Chng Bacillus sp. c phân lp t 
b bng hình thái b, Vin Vi sinh và công ngh sinh hng
c t i hc quc gia Hà ni.
2.1.2. Hóa cht, sinh phm
Mi dùng cho phn ng PCR

2.1. Cp mi dùng trong phn 16S rADN
Tên mi
Trình t mi
16SP1 (R)
-AGAGTTTGATCCTGGC-
16SP2 (F)
-TACCTTGTTACGACT-

.PCR amyE
Tên mi
Trình t mi
amyE1 (R)
-AGGTCTGGAAAAGAAAAGAGG-
amyE2 (F)
-CGATTCAAAACCTCTTTACTG-

Thang ADN chun 1 Kb, enzym Taq ADN polymerase, dung dm cho
Taq polymerase, dNTP, ethidium bromid, ethanol, Tris-base, acid acetic, EDTA,
glycerol, agarose (BioNeer, Hàn Quc), xanh bromophenol, agar, ampicillin, X-gal,
MgCl2, TAE, cn 96% và mt s hóa cht khác dùng trong sinh hc phân t ca
các hãng BioLab, BioRad, Merk, Fermentas.
 Dung dch tách plasmid:
- Sol I: Tris HCL, pH 8:25mM, EDTA, pH 8: 10mM, glucose: 50mM.
- Sol II: NaOH: 0,2M, SDS: 1%.
- m acetat kali 3M, pH 5,5.
- Dung dch chloroform: isoamylalcohol (24:1).
- Dung dch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA).