Nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 184 21 tổng hợp

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



PHẠM THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO
Streptomyces 184.21 TỔNG HỢP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




PHẠM THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO
Streptomyces 184.21 TỔNG HỢP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học
Trường Đại học Dược Hà Nội







HÀ NỘI – 2015
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo PGS-TS Cao Văn Thu-
người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành
khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, các cán bộ, kĩ thuật viên giảng dạy,
công tác tại bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học
Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Bộ môn Hóa vật liệu- khoa Hóa
trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực
nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa
luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn
bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 11, tháng 5, năm 2015
Sinh viên
PHẠM THỊ YẾN

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh. 2
1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 4
1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 5
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn 6
1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 6
1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn………………………………7
1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 7
1.4.2. Đột biến cải tạo giống 7
1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 8
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. 8
1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9
1.7. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh 10
1.7.1. Phổ hồng ngoại (IR) …….10
1.7.2. Phổ tử ngoại (UV)…………………………………………… 11
1.7.3. Phổ khối (MS)………………………………………………………… 11

1.8. Một số nghiên cứu liên quan 11
1.8.1. Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những chất
hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày . 11
1.8.2. Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh ở
Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces. 12
1.8.3. Xác định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng cách
kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces ambofaciens…………12
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 14
2.1.1. Nguyên vật liệu…………………………………………………………14
2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ………………………………………. …….17
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phương pháp thực nghiệm. 17
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống……………………………………17
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán …….18
2.3.3.Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp…………… …….19
2.3.4. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
………………………………………………………………………………19
2.3.5. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV……… ……………… 19
2.3.6. Đột biến hóa học bằng HNO
2
………………………………………… 20
2.3.7. Phương pháp lên men mẻ…….…………………………………………21
2.3.8. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch
lên men ………………………………………………………………………21
2.3.9. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ. ……22
2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký……………………………22
2.3.11. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết……………… ……23
2.3.12. Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu được… ……………24
2.3.13. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP……………………………24

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN. 25
3.1. Kết quả thử hoạt tính của Streptomyces 184.21 khi phân lập 25
3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định. 25
3.3. Nghiên cứu hình thái của Streptomyces 184.21 27
3.4. Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên. 27
3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần………………………………………… 29
3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 31
3.7. Kết quả đột biến kháng sinh sau đột biến hóa học. 32
3.8 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh…………………………… …….33
3.9. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh
trong dịch lọc……………………………………………………………… …….35
3.10. Kết quả chọn dung môi chiết xuất KS…………………………………….36
3.11. Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi………………… 37
3.12. Kết quả sắc kí cột………………………………………………………….38
3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ các nhóm
chức đặc trưng của kháng sinh thu được………………………………………… 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
CW Cell wall (Thành tế bào)
DM Dung môi
DMHC Dung môi hữu cơ
ĐB Đột biến
Gr Gram
Gr (+) Gram dương
Gr (-) Gram âm
HTKS Hoạt tính kháng sinh

IR Infrared (Hồng ngoại)
L-DAP L-diaminopimelat acid
MS Mass spectrometry (Phổ khối)
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
P. mirabilis Proteus mirabilis
RAPD Random amplified polymorphic DNA
(ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên)
S. aureus Staphylococcus aureus
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TK Tinh khiết
UV Ultraviolet (Tử ngoại)
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật




DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Nội dung
Bảng 1.1 Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định
Bảng 2.2 Các môi trường kiểm định
Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 3.1
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 184.21 trên vi
khuẩn khi phân lập
Bảng 3.2
Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 184.21 trên 5 loại môi
trường

Bảng 3.3 Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 184.21 theo ISP
Bảng 3.4 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 184.21
Bảng 3.5 Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 1
Bảng 3.6 Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 2
Bảng 3.7 Kết quả hoạt tính KS sau đột biến hóa học
Bảng 3.8 Kết quả chọn môi trường lên men
Bảng 3.9 Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày, 5 ngày
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của KS trong dịch lọc
Bảng 3.12 Kết quả thử chiết kháng sinh bằng 5 DMHC ở 5 pH khác nhau
Bảng 3.13
Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ( hiện hình VSV bằng E.
coli)
Bảng 3.14
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các phân đoạn sau chạy cột lần
1
Bảng 3.15 Kết quả sắc kí lớp mỏng các phân đoạn 3-7
Bảng 3.16 Kết quả chạy cột lần 2
Bảng 3.17 Kết quả chạy cột lần 3
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Tên hình Nội dung
Phụ lục P1 Hình dạng chuỗi bào tử Streptomyces 184.21
Phụ lục P2
Bề mặt bào tử Streptomyces 184.21

Phụ lục P3
Phổ UV-VIS của kháng sinh do chủng Streptomyces 184.21 sinh
tổng hợp.
Phụ lục P4

Kháng sinh tinh 1 do Streptomyces 184.21 tổng hợp

Phụ lục 5
Phổ hồng ngoại IR do Streptomyces 184.21 tổng hợp

Phụ lục P6 Phổ khối MS do Streptomyces 184.21 tổng hợp
Phụ lục P7
Thử hoạt tính KS pha dung môi và pha nước







ĐẶT VẤN ĐỀ

Tác dụng ức chế S. aureus của Penicillin được phát hiện vào tháng 10/1928
và Penicillin được sử dụng vào năm 1943 đã mở ra kỉ nguyên mới trong y học lâm
sàng và nghành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh.
Ngoài được sử dụng trong dự phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn,
nhiễm nấm, bệnh ung thư cho người, kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi,
trồng trọt và công nghiệp thực phẩm. Do được sử dụng tràn lan và không đúng cách
nên tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng.
Nhận thức được vai trò quan trọng của các kháng sinh trong đời sống nói
chung, y học nói riêng, hiệu quả kinh tế to lớn mà ngành công nghiệp kháng sinh
mang lại, cùng với mối lo về tình trạng đa kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia
tăng, các nhà khoa học vẫn đang ngày đêm nghiên cứu để tìm ra các kháng sinh
mới. Hiện nay các nhà khoa học đã phát minh hơn 16.000 chất kháng sinh, hàng
năm lại có khoảng hơn 100 kháng sinh mới được công bố và một số được đưa vào

sử dụng, nên việc tìm ra một kháng sinh mới là rất khó. Phương pháp chủ yếu để
tìm ra các kháng sinh mới hiện nay vẫn là phương pháp sinh học- nghiên cứu các
chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.
Tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường ĐH Dược Hà Nội, chúng tôi đã chọn đề
tài” Nghiên cứu kháng sinh nhờ Streptmyces 184.21 tổng hợp” với các mục tiêu
như sau:
- Sơ bộ xác định hình thái Streptomyces 184.21 theo ISP.
- Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh của
Streptomyces 184.21.
- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích.
- Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được.

1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1.Định nghĩa kháng sinh[3], [6], [7].
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh.
Theo các nhà sinh học định nghĩa: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do
vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn
lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus…)
hay cả tế bào ung thư, ở nồng độ thấp.
Các nhà hóa học thì muốn định nghĩa kháng sinh phải bao hàm các chất tổng
hợp bằng hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon
(pefloxacin, norfloxacin…).
1.1.2.Phân loại kháng sinh[9], [10], [11], [15].
Có rất nhiều cách khác nhau để phân loại kháng sinh: Phân loại theo nguồn
gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh bán tổng hợp), theo phổ tác
dụng (phổ rộng hay chọn lọc), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách tế
bào, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nhân, thay
đổi tính thấm màng tế bào, ức chế tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học…

Song cách phân loại KS theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất.
Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1.1).
Bảng 1.1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học
Phân loại Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể
1. Kháng sinh có
chứa đường trong
Aminoglycosid Streptomycin, neomycin
Orthosomycin Everninomycin
2
phân tử.
N-glycosid Streptothrinin
C-glycosid Vancomycin
Glycolipid Moenomycin
2. KS chứa vòng
lacton lớn
(macrocyclic
lacton).
KS macrolid Erythromycin
KS polyen Candicidin, nystatin
Asamycin Rifamycin
Macrotetrolid Tetralactin
3. Quinon và các KS
cùng họ.
Anthracyclin Adriamycin
Naphthoquinon Actinortidin
Benzoquinon Mitomycin
Các tetracyclin Tetracyclin, terramycin
4. Các KS aminoacid
và peptid.
Dẫn xuất aminoacid Cycloserin

KS β-lactam Penicillin, cephalosporin
KS peptid Bacitracin, polymycin
Chromopeptid Actinomycin
Depsipeptid Valinomycin
5. KS dị vòng chứa N Các KS nucleotid Polyoxin
6. KS dị vòng chứa O Các KS polyether Monensin
7. Các kháng sinh
nhân thơm
Dẫn xuất benzen Chloramphenicol
Các ether thơm Novobiocin

1.1.3.Ứng dụng của kháng sinh[6], [15].
- Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn, nấm
gây ra. Ngày nay, một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị bệnh ung thư.
- Ngoài lĩnh vực y học: Kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác.
3
+ Trong chăn nuôi: Kháng sinh được dùng để điều trị các bệnh cho động
vật (Griseoviridin trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú trâu, bò. Metimyxin hoặc
chloramphenicol dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra…). Kháng sinh được sử
dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, kích
thích tăng sản lượng trứng ở gà, vịt.
+ Trong trồng trọt: Để xử lí hạt, đất trồng. Ngâm hạt giống trong dung
dịch kháng sinh trước khi gieo để kích thích hạt nảy mầm và tiêu diệt nấm và các
VK gây bệnh cho cây trồng (validamycin, blastixidin, kasugamycin).
+ Kháng sinh dùng trong công nghiệp thực phẩm: Thực phẩm đóng hộp
dùng chất KS để bảo quản giúp giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử
trùng giảm xuống làm cho chất lượng sản phẩm tốt hơn, các vitamin không bị phá
hủy, hương vị ít bị biến đổi (subtilin, nisin).
1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomyces) [7], [14].
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm VK thật (Eubacteria) phân bố rất rộng

rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả
trong cơ chất và vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Theo Waksman trong
1g đất có khoảng 29.000- 2.400.000 xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số VSV.
Xạ khuẩn là các vi khuẩn Gr(+), có tỷ lệ G+C>55% trong ADN, hiếu khí hoại
sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh.
Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như KS,
vitamin, acid hữu cơ, các enzym…nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều.
1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn [7], [12], [14].
Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn
ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản còn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu, thậm
chí hầu như không phát triển tùy từng chi, từng loài.
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi từ 0,3-1,0 µm đến 2-3 µm. Đa số khuẩn
ty xạ khuẩn không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn
4
rất phong phú, có thể gặp các màu da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu, trắng, vàng,
xám…Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan
trong nước, có loại phụ thuộc pH, có loại chỉ tan trong DMHC. Trong môi trường
đặc hiệu, có loại xạ khuẩn có thể tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen.
Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành các
khuẩn ty khí sinh. Người ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt
với khuẩn ty sơ cấp bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm.
Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ. Khuẩn
lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng
màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.
Đối với các xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae sau một thời gian phát triển
nên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Các chuỗi bào tử có thể
mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng, uốn cong, móc câu-
đơn hoặc kép, và xoắn lò xo. Bào tử trần của họ xạ khuẩn này có các hình dạng:
hình cầu, hình bầu dục, hình trụ…Bề mặt bào tử có thể là nhẵn, sần xùi da cóc, có
gai hoặc có tóc.

1.2.2. Đặc điểm của tế bào xạ khuẩn [7], [12]
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào VK Gr(+), có một số điểm khác biệt sau:
- Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng 10-20nm, có chức năng
duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ TB. Căn cứ vào thành phần hóa học thành
TB xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm: CW1, CW2, CW3, CW4. Các xạ khuẩn chi
Streptomyces được xếp vào nhóm CW1, thành TB có chứa L-DAP và glycin.
- Màng TB chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10 nm, có cấu trúc và chức năng như
của VK nói chung.
- Mezosom nằm ở phía trong của TB chất, có hình phiến, hình bọng hay hình ống.
Mezosom làm tăng diện tích tiếp xúc của TB chất và qua đó làm tăng hoạt tính
enzym, tăng vận chuyển điện tử…
5
- Các vật thể ẩn nhập trong TB chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat (hình
cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Sudan III), các hạt polysachaird (bắt màu với dung
dịch Lugol).
1.2.3 Phân loại xạ khuẩn [7], [13]
Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà KH nghiên cứu phát triển
để phân loại xạ khuẩn, phải kể đến khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại
Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze,… Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn
(Actinomycetes) thành bộ Actinomycatales và các VSV giống xạ khuẩn. Bộ
Actinomycetales được chia thành các họ: Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,
Streptomycetaceae, Mocromonosporaceae, Nocardiaceae,…
Khóa phân loại Streptomyces thuộc Chương trình Streptomyces quốc tế (ISP)
do Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ
khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại
này, các đặc trưng phân loại được sử dụng bao gồm: màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn
ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử,
khả năng tiêu thụ các nguồn carbon.
1.3.Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh [2], [6], [7]
- Để phân lập VSV sinh KS người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau:

đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia súc, gia cầm, bùn, nước ở sông,
hồ… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh KS mà ta mong
muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các MT chọn lọc (MT1, MT2 đối với
xạ khuẩn).
- Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:
+ Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch.
+ Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa VSV kiểm định.
+ Phương pháp làm giàu đất bằng VSV kiểm định.
+ Phương pháp thêm KS vào trong MT phân lập.
6
+ Phương pháp sử dụng các VSV đột biến có cường độ hô hấp thấp làm VSV kiểm
định (phân lập KS chống ung thư).
1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn
VSV tổng hợp KS phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính thấp.
Vì vậy để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh đưa vào sản
xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên
cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp.
1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên [6], [20]
Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10
-10
- 10
-5
trong ống giống
thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau.Trong đó có biến chủng có hoạt tính
kháng sinh mạnh hơn 20-30 % những cá thể khác.Cần phải chọn lấy dạng chủng có
hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.
1.4.2. Đột biến cải tạo giống [6], [18]
 Trong thực tế việc chọn lọc ngẫu nhiên các dạng chủng có hoạt tính cao chỉ
để nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được
những chủng có khả năng siêu tổng hợp KS người ta áp dụng phương pháp

đột biến nhân tạo.
 Các tác nhân gây đột biến bao gồm:
 Các tác nhân hóa học: nitrozoguanilin, HNO
2
, ethylenimin,
dimethylsulfat, hydroxylamin,….
 Các tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hóa
khác. Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường
độ bức xạ, khoảng cách chiếu và thời gian chiếu.
 Các tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động.
 Để tạo ra các biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS cao phải tiến hành
đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ
7
hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp
TB trần.
 Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến, phần lớn các VSV chết.
Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp
KS tăng (đột biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm).
Cần chọn lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu
tiếp.
1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn [19], [20]
Việc cải tạo thành công chủng VSV sẽ không có ý nghĩa nếu chủng giống
không được bảo quản tốt để có thể sống sót và duy trì các tính trạng thu được. Do
đó việc bảo quản giống VSV là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng.
Các phương pháp bảo quản giống VSV có thể kể đến như: cấy chuyền, làm
khô, đông khô, đông lạnh.
1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [6], [10], [15], [19]
Có hai phương pháp lên men chính:
 Lên men bề mặt: Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề
mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng.

 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi
hỏi thiết bị phức tạp.
 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa, tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện
tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng trường không gian thấp.
 Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí & kỵ khí) được nuôi cấy trong môi
trường lỏng
 Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình,
tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
8
 Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung,
lên men bán liên tục, lên men liên tục.
1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm [1], [6], [8], [9], [17]
 Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc tính của
loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB. Để thu
lấy các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp.
 Một số phương pháp chiết tách thường dùng:
 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
 Phương pháp trao đổi ion.
 Phương pháp tạo phức kết tủa.
 Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên
cột….).
 Phương pháp chưng cất.
 Phương pháp thăng hoa.
 Chiết xuất:
Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp. Đó là
quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha
lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn), hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng
lỏng- lỏng, thường một pha là nước).
 Phương pháp sắc ký:

 Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ
từ một hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân
tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một
cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trên cột
hay trên bề mặt rắn. Các chất hòa tan là thành phần của mẫu sẽ di
chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa
pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các
9
thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc đồ, làm
cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng.
 Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy
thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
 Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp
KS:
- Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên
bản mỏng. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành
phần được pha theo tỷ lệ. Pha động di chuyển qua bản mỏng
nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực.
- Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ yên trên cột, pha
động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực. Quá trình rửa
giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha
động.
1.7. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh [1], [4], [5]
1.7.1 Phổ hồng ngoại
 Phổ hồng ngoại là loại phương pháp do sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR)
khí nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
 Trong phân tử khi có nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng
thái dao động thì tạo nên một giải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan
giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải

hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có dải phổ
hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng IR.
1.7.2. Phổ tử ngoại
 Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng
hay số sóng là phổ tử ngoại.
10
 Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử
của phân tử. Các điện tử ở trạng thái cơ bản E
0
chuyển sang trạng thái
kích thích E
1
, E
2.
Các điện tử tham gia vào hiệu ứng này có thể là các
điện tử trong liên kết đơn, liên kết bội, hệ thống thơm…, hay cặp điện tử
tự do không tham gia liên kết của O, N, các halogen.
1.8. Một số nghiên cứu liên quan
1.8.1. Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những chất
hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày [24]
Việc tìm kiếm những kháng sinh mới là rất cần thiết, góp phần giảm thiểu
tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang tiếp diễn.
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra những nguồn giàu tiềm năng cho việc
phát hiện các kháng sinh mới là những loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên các côn
trùng thuộc Bộ Hymenoptera. Để chứng minh điều này, các nhà khoa học ở Bộ môn
vi sinh vật học, trường Đại học Madison- Wisconsin, Mỹ đã nghiên cứu trên hai
loài ong bắp cày Sceliphron caementarium và Chalybion californicum. Họ tiến hành
phân lập từ 33 con ong bắp cày và thu được hơn 200 chủng xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces. Nghiên cứu 15 loài trong số những xạ khuẩn phân lập được, phát
hiện 11 chất chuyển hóa bậc hai có cấu trúc khác nhau, trong đó có một chất chứa

vòng lactam chưa bão hòa gọi là sceliphrolactam. Đồng thời, họ cũng nghiên cứu
hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của kháng sinh do 15 loài xạ khuẩn này sinh
ra.
Các loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên ong bắp cày giúp bảo vệ loài ong này
khỏi các vi sinh vật gây bệnh, và chúng có thể là nguồn cung cấp những kháng sinh
tự nhiên mới mà các nhà nghiên cứu dược phẩm quan tâm.
1.8.2. Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh ở
Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces [25]
11
Một con đường sinh tổng hợp sử dụng acid pivalic như là đơn vị khởi đầu đã
được phát hiện ở ba loài vi khuẩn Alicyclobacillus acidoterrestris, Rhodococcus
erythropolis và Streptomyces avermitilis. Khi thêm acid pivalic được đánh dấu bằng
đồng vị Deuteri vào môi trường dinh dưỡng của A. acidoterrestris và
R.erythropolis, nó sẽ kết hợp với các acid béo để tạo thành các acid béo có thêm
nhánh tert- butyl (t-FAs). Thêm vào đó, trong R. erythropolis, acid pivalic chuyển
hóa thành hai đơn vị khởi đầu là acid isobutyric và acid 2- methylbutyric, tương ứng
là tiền chất của iso- even FAs và anteiso-FAs. Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở loài
S.avermitilis khi có thêm acid pivalic mang lại ba nhánh FAs. Ngoài con đường
này, cả acid pivalic và acid 2- methylbutyric cũng được kết hợp trong sinh tổng hợp
kháng sinh avermectin.
1.8.3. Xác định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng cách kích
hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces ambofaciens [23]
Nhu cầu tìm kiếm các thuốc mới để chống lại bệnh nhiễm trùng, ung thư và
những bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng con người luôn là rất lớn. Gần đây,
những phương pháp nghiên cứu tiếp cận di truyền rất phát triển, thúc đẩy sự đổi
mới trong việc tìm kiếm các thuốc có nguồn gốc tự nhiên. Phân tích bộ gen của
S.ambofaciens ATCC23877 phát hiện thấy nhiều cụm gen sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa bậc 2, bao gồm một cụm gen sinh tổng hợp polyketide typ I (Polyketide
synthetase- PKS). PKS bao gồm 25 gen (9 gen trong số đó mã hóa PKSs), dung
lượng khoảng 150 kb. Đó là một trong những gen sinh tổng hợp polyketid lớn nhất

được mô tả cho đến nay. Những sản phẩm chuyển hóa của cụm gen này chưa được
biết rõ, phân tích quá trình phiên mã cho thấy nó không biểu hiện trong điều kiện
phát triển ở phòng thí nghiệm. Biểu hiện của một gen nhất định trong cụm mã hóa
một protein, tương tự như liên kết ATP của LuxR trong một nhóm protein lớn
(LAL), kích hoạt biểu hiện các gen sinh tổng hợp. Điều này dẫn đến việc xác định
được 4 trong 51 macrolid, được đặt tên là Stambomycin A-D như là sản phẩm
chuyển hóa của cụm gen. Cấu trúc của các hợp chất này bao gồm một số tính năng
12
sinh tổng hợp thú vị, như sắp xếp các đơn vị mở rộng bất thường trong chuỗi
polyketid và hydroxyl hóa các chuỗi polyketid đang phát triển để cung cấp nhóm
hydroxyl cấu thành macrolid. Stambomycin có thể chống lại sự gia tăng nhanh của
các tế bào ung thư ở người. Cơ sở dữ liệu tìm kiếm xác định các gen

điều chỉnh mã
hóa LAL trong nhiều cụm gen sinh tổng hợp bí ẩn của bộ gen xạ khuẩn, cho thấy
biểu hiện hoạt hóa các con đường chuyển hóa riêng biệt đại diện cho cách tiếp cận
mới các sản phẩm có hoạt tính sinh học từ tự nhiên.








13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.21 được phân lập từ
mẫu đất trồng tỉnh Tây Ninh tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường ĐH Dược
Hà Nội.
 Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh- Sinh
học trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật kiểm định
Vi khuẩn Gr(+) Vi khuẩn Gr(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 (B. cereus) Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli)
Bacillus pumilus ATCC 10241
(B.pumilus)
Proteus mirabilis BV 108 (P. mirabilis)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (B.subtilis)
Pseudomonas aeruginosa VM 201
(P.aeruginosa)
Sarcina lutea ATCC 9341 (S. lutea) Salmonella typhi DT 220 (S. typhi)
Staphylococcus aureus ATCC 1228
(S.aureus)
Shighella flexneri DT 112 (S. flexneri)

 Môi trường: Gồm các MT kiểm định, MT nuôi cấy xạ khuẩn, môi trường
ISP.
 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (Bảng 2.2).


14
Bảng 2.2: Các môi trường kiểm định
Thành phần

Môi trường

NaCl
(%)
Cao thịt
(%)
Pepton
(%)
Thạch
(%)
pH
Canh thang 0,5 0,3 0,5 0
7,0-7,4
Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8

 Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn (Bảng 2.3):

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn
MT

Thành phần
MT1 MT2 MT5 MT6 MT7
Tinh bột 2 2 2,4 2
Lactose
Glucose 1
Cao ngô
Saccarose 3
Bột đậu tương 1,5
Cao thịt 0,3 0,3
Pepton 0,3 0,5

15

Chú thích: - Đơn vị tính theo gam.
- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở áp suất 1 att/20 phút.
- Các môi trường lên men dịch thể (MTdt): thành phần tương
ứng với môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch.
 Các môi trường ISP2, ISP3 xác định hình thái theo ISP
Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl
2
.4H
2
O 0,1g; FeSO
4
.7H
2
O 0,1g;
ZnSO
4
.7H
2
O 0,1g; nước cất vđ 100ml; pH=7,0-7,2.
KNO
3
0,1
KCl 0,05
NaNO
3
0,2
NH
4

NO
3

CaCO
3
0,4 0,2
(NH
4
)
2
SO
4
0,2
K
2
HPO
4
0,05 0,1
MgSO
4
.7H
2
O 0,05 0,05
NaCl 0,05 0,1 0,5
Gạo nấm men 0,5
Thạch 1,8 2 2 2 1,8
Nước máy (ml) 100 100 100 100 100
pH 6,8-7,2
16