Xác định một số hợp chất nhóm anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




LÊ VIỆT NGÂN





XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM
ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI










LÊ VIỆT NGÂN







XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HỢP CHẤT NHÓM
ANTHOCYANIN TRONG RAU CỦ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện :
1. Bộ môn hóa phân tích – độc chất
2. Viện kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia



HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo,
tôi đã hoàn thành khóa luận của mình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Đình Chi
đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài
và viết khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia, TS. Lê Thị Hồng Hảo đã tạo điều kiện, giúp em hoàn thành đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Thị Hồng Hảo, ThS. Vũ Thị Trang đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em gửi lời cảm ơn
tới các anh chị, những người làm việc ở Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực
phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khóa

luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đã luôn bên em, chia
sẻ khó khăn, động viên, và giúp đỡ trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót. Em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên.

Hà Nội, Ngày 11 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Việt Ngân
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 3

1.1.

Giới thiệu 3

1.2.

Cấu trúc hóa học của Anthocyanin 3

1.3. Tính chất của Anthocyanin 4

1.4. Tác dụng của Anthocyanin 6

1.5. Sự phân bố của Anthocyanin 8

1.6. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin 9

1.7. Tổng quan về HPLC 10

1.7.1. Khái niệm chung 10

1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 10

1.7.3. Thiết bị sắc ký lỏng 12

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1. Đối tượng nghiên cứu 17

2.2. Nguyên vật liệu - thiết bị 17

2.2.1. Nguyên vật liệu 17

2.2.2. Thiết bị 18

2.2.3. Nội dung nghiên cứu 19

2.3.

Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC 19

2.3.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 20

2.3.3. Thẩm định quy trình 21

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích một số Anthocyanin bằng phương
pháp HPLC 22

3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện 22

3.1.2. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 23

3.2.

Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28

3.2.1. Khảo sát thời gian thủy phân 28

3.2.2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân 30

3.2.3. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu 31

3.3. Thẩm định phương pháp 33
3.3.1. Tính đặc hiệu/chọn lọc 33

3.3.2. Khoảng tuyến tính 34

3.3.3. Độ lặp lại 37

3.3.4. Độ thu hồi 40

3.3.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 43

3.4.

Kết quả áp dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số thực
phẩm rau củ 44

3.5. Bàn luận 44

3.5.1. Lựa chọn phương pháp 44

3.5.2. Điều kiện xử lý mẫu 45

3.5.3. Xây dựng phương pháp định lượng 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1.

Kết luận 47

4.2.Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt
AOAC
Association of Official Analytical
Community
Hiệp hội cộng đồng phân
tích chính thức
HPLC
High high performance
liquidchromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPTLC
High performance thin layer
chromatography
sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao
IS Ionspray Voltage Thế phun ion
LC-
MS/MS
Liquid chromatography tandem mass
spectrometry
Sắc ký lỏng ghép khối phổ
hai lần
LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng
MS Mass spectrometry Khối phổ
R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi
SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn
SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

TEM Ion source Temperature Nhiệt độ nguồn
PDA

Photodiode Array

Mảng diod quang

DEL Delphinidin
CYA Cyanidin
PEL Pelargonidin
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Trang
Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin 4
Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực
vật tại Việt Nam
8
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin 9
Bảng 2.1: Danh mục các pha động HPLC khảo sát 20
Bảng 3.1: Chương trình gradient 1 24
Bảng 3.2: Chương trình gradient 2 25
Bảng 3.3: Chương trình gradient 3 26
Bảng 3.4: Chương trình gradient 4 27
Bảng 3.5: Hàm lượng các chất theo thời gian thủy phân 29
Bảng 3.6: Hàm lượng các chất tại các nhiệt độ thủy phân khác nhau 30
Bảng 3.7: Hàm lượng các chất tại các tỷ lê dung môi chiết khác nhau 32
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn
delphinidin
35
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn cyanidin 36
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn

pelargonidin
37
Bảng 3.11: Độ lặp lại delphinidin trên nền mẫu rau 38
Bảng 3.12: Độ lặp lại cyanidin trên nền mẫu rau 38
Bảng 3.13: Độ lặp lại pelargonidin trên nền mẫu rau 39
Bảng 3.14: Độ lặp lại cyanidin trên nền mẫu củ 39
Bảng 3.15: Độ lặp lại pelargonidin trên nền mẫu củ 40
Bảng 3.16: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu rau 41
Bảng 3.17: Độ thu hồi của cyanidin trên nền mẫu rau 41
Bảng 3.18: Độ thu hồi của pelargonidin trên nền mẫu rau 42
Bảng 3.19: Độ thu hồi của delphinidin trên nền mẫu củ 42
Bảng 3.20: Độ thu hồi của cyanidin trên nền mẫu củ 42
Bảng 3.21: Độ thu hồi của pelargonidin trên nền mẫu củ 43
Bảng 3.22: Kết quả phân tích một số mẫu rau củ 44




DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình Trang

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin 4
Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH 5
Hình 1.3: Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 13
Hình 3.1: Phổ hấp thụ của delphinidin 22
Hình 3.2: Phổ hấp thụ của cyanidin 23
Hình 3.3: Phổ hấp thụ của pelargonidin 23
Hình 3.4: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình
gradient 1
25

Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 3 chất chuẩn với chương trình
gradient 2 (trên) và mẫu thực rau (dưới)
26
Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 3 26
Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 3 chất với chương trình gradient 4 27
Hình 3.8: Hàm lượng các chất khi thủy phân trong thời gian khác nhau
(60, 90, 120, 150 phút)
29
Hình 3.9: Hàm lượng các chất tại nhiệt độ thủy phân khác nhau 30
Hình 3.10: Hàm lượng các chất theo phần trăm HCl 2N trong dung môi
chiết mẫu
31
Hình 3.11: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 33
Hình 3.12: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin 34
Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu rau không chứa anthocyanin được thêm
chuẩn hỗn hợp
34
Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
delphinidin
35
Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
cyanidin
36
Hình 3.16: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ
pelargonidin
37


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay với mức sống càng nâng cao, người dân ngày càng quan tâm hơn
đến sức khỏe của bản thân. Trong nhiều năm gần đây, xã hội và giới khoa học
quan tâm nhiều đến tác hại của gốc tự do, chất chống oxy hoá và stress oxy hóa
[5].
“Stress oxy hóa” là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất
cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxi
hóa [10]. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó
có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer,
Parkinson) và lão hóa sớm [17].
Theo các nghiên cứu thì các hợp chất Anthocyanin có các hoạt tính rất tốt
như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư,
thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống
oxy hóa rất mạnh [19], [18], [26].
Trên thế giới đã có rất nhiều quy trình xác định hàm lượng tổng Anthocyanin
hay hoạt chất nhóm Anthocyanin bằng các kỹ thuật như: HPLC, UV-VIS,
HPTLC, LC-MS [21], [15], [27]. Tại Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu xác
định hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm hay thực phẩm chức năng [3], [4],
[6]. Tuy nhiên thì việc xác định từng hoạt chất trong nhóm Anthocyanin trong
thực phẩm rau củ thì rất ít. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề
nghiên cứu đề tài:
“Xác định một số hợp chất nhóm Anthocyanin trong rau củ bằng
phương pháp HPLC”
Với các mục tiêu sau đây:
2

1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định một số hợp chất nhóm
anthocyanin trong rau củ bằng phương pháp HPLC.
2. Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng để phân tích một số mẫu rau củ trên
thị trường.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN
1.1. Giới thiệu
Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm các chất màu tự nhiên
flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật [24]. Thuật ngữ
anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthocyanin là sự kết hợp giữa
Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là xanh thẫm [24]. Tuy nhiên, không
chỉ có màu xanh, anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rưc rỡ
khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian [25].
1.2. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin
Anthocyanin là những glycosid do gốc đường glucose, glactose kết hợp với
gốc aglycon có màu (anthocyanidin). Các anthocyanin khi mất hết nhóm đường
được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl
hóa acylat bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Aglycon
của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình 1.1. Các gốc đường có thể
được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít [3].
Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycosid, ở vị trí 3 và 5
gọi là diglycosid. Sự khác biệt giữa chúng là số lượng các nhóm hydroxy hóa,
bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc của chúng. Đến nay có
những báo cáo của hơn 500 anthocyanin khác nhau và 23 anthocyanidin, tuy
nhiên trong đó chỉ có sáu chất phổ biến nhất Pelargonidin, Peonidin, Cyanidin,
Malvidin, Petunidin và Delphinidin [25]. Trong bài báo cáo này chúng tôi tiến
hành xác định Pelargonidin, Cyanidin, Delphinidin trong thực phẩm rau củ.



4

R
1
OH

OH O
+
3
R
2



OH
OH


A

3
5
7
B


Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản aglycon của anthocyanin
Bảng 1.1: Cấu trúc của 6 chất phổ biến nhất trong nhóm anthocyanin
Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R
3

′ R
4
′ R
5
′ R
3
R
5
R
6

R
7


Cyanidin −OH −OH

−H −OH

−OH

−H

−OH

Delphinidin −OH −OH

−OH −OH

−OH

−H

−OH

Pelargonidin −H −OH

−H −OH

−OH

−H

−OH

Malvidin −OCH
3

−OH

−OCH
3

−OH

−OH

−H

−OH

Peonidin −OCH
3

−OH

−H −OH

−OH

−H

−OH

Petunidin −OH −OH

−OCH
3

−OH

−OH

−H

−OH

Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R
1

và R
2
, thường là H, OH hoặc OCH
3
[3].
1.3. Tính chất của anthocyanin
Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá
phân
cực
nên tan tốt trong dung môi phân
cực [3].

5

Anthocyanin hòa tan tốt trong H
2
O, C
2
H
5
OH, CH
3
OH, …, trong đó khả năng
tan trong CH
3
OH – HCl và C
2
H
5
OH – HCl là tương đương nhau và cao nhất [7].

Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều
yếu tố khác,… Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng
xanh đậm [3].
Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ.
Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay
đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [25].
Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường [3]:
- Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin có
màu đỏ.
- Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ.
- Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base Cacbinol hay base Chalcon
không màu.
- Ở pH = 7 - 8 lại về dạng base Quinoidal Anhydro màu xanh.

Hình 1.2: Sự phụ thuộc cấu trúc anthocyanin vào pH.
6

Màu sắc của anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharid.
Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể phá hủy và mất màu [3].
Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ
cực đại tại bước sóng 510 – 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến
màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ
anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ
anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [3].
Như vậy, trong môi trường acid, các anthocyanin là những base mạnh và có
thể tạo muối bền vững với acid. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với
base. Như vậy chúng có tính chất lưỡng tính. Muối với acid thì có màu đỏ, còn
muối với kiềm thì có màu xanh [3].
1.4. Tác dụng của anthocyanin
Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo

điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán do hình thành nên màu sắc sặc sỡ trên cành
hoa và quả. Mặt khác, anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV cho phép
bảo vệ bộ gen của thực vật trước nhóm tác nhân có thể gây đột biến gen này.
Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ được tăng cường để đáp ứng phù hợp với môi
trường: hạn hán, ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phospho, nhiễm
nấm, vi khuẩn, tổn thương, côn trùng, ô nhiễm…[14], [32].
Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học
Harvard (Mỹ) [13], các anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các
tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông
trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu
não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng.
Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng anthocyanin có tác dụng tốt
7

trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu, hạn chế nguy
cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin
chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất này đã chứng tỏ khả
năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện
trong một số trường hợp, sự biến đổi về cấu trúc của các phân tử anthocyanin
cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng. Các nghiên cứu còn cho thấy
anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết của
những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa bệnh của anthocyanin vẫn
đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học. Các ứng
dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức
năng chữa bệnh có hiệu quả [13], [31].
Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin
được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa
cho thực phẩm [31]. Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên
liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực
phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy hóa

tổng hợp BHA [31]. Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn được
sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và
khá an toàn. Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ
quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu
tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [31].
Anthocyanin bên cạnh vai trò là màu thiên nhiên được sử dụng trong thực
phẩm, còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy
hóa cao, chống lão hóa, tăng cường sức đề kháng, làm bền thành mạch, chống
8

viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng chống các tia phóng
xạ [14], [16].
1.5. Sự phân bố của Anthocyanin
Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm ở
hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thực vật này,
anthocyanin được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì.
Các hợp chất anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73 loài
và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực phẩm [11]. Các họ thực vật như
họ nho (Vitaceae) và họ hoa hồng (Rosaceae) là các nguồn anthocyanin chủ yếu.
Bên cạnh đó còn có một số loài thuộc các họ khác: Cà tím (Solanaceae), quả lý
(Saxifragaceae), quả việt quất (Ericaceae) và bắp cải tím (Brassicaceae)… Các
loại anthocyanin phổ biến nhất là các glycosid của cyanidin, kế đến là
pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và maldivin. Số lượng các
3 – glycosid nhiều gấp 2,5 lần các 3,5 – glycosid. Loại anthocyanin hay gặp nhất
chính là Cyanidin – 3 – glycosid [29].
Bảng 1.2: Hàm lượng anthocyanin toàn phần có trong một số mẫu thực vật tại
Việt Nam [8].
STT

Mẫu

Hàm lượng
anthocyanin
toàn phần (%)
1 Thân của loài ngô (Zea mays L.) 0,59
2 Lá chua, bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) 1,49
3 Hoa của loài chuối tiêu (Musa paradisiaca L.) 0,34
4 Quả của loài dâu tằm (Mosrus alba L.) 1,75
5 Lá của loài tía tô (Perilla frutescens (L.) Britt.) 1,72
9

6 Củ của loài khoai lang tím (Ipomoea batatas (L.) Poir.)

0,46
7 Vỏ của loài nho (Vitis vinifera L.) 1,27
8 Lá của loài mơ leo (Paederia scandens (Lour.) Merr.) 1,05
9 Lá của loài rau dền tía (Amaranthucs tricolor L.) 1,74
1.6. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích anthocyanin.
Stt
Kỹ
thuật
phân
tích
Mẫu
phân
tích
Điều kiện phân tích
Điều kiện xử lý
mẫu
Tài

liệu
tham
khảo
1 HPLC
Mẫu bắp
cải tím
-
Cột: C
18
Waters (250 x 4.6
mm, 5 µm)
- Pha động: A (H
3
PO
4
1,5 %)
B (H
3
PO
4
1,5 %,
CH
3
COOH 20 % trong hỗn
hợp CH
3
CN – H
2
O (25:75)
- Tốc độ dòng: 1.0 mL/min

- Nhiệt độ cột: 40
0
C
-
Detector PDA tại 530 nm
Thủy phân bằng
HCl ở nhiệt độ
90
0
C trong 2 giờ,
lọc sau đó chạy
sắc ký
[28]
2 HPLC
Mẫu tía
tô đông
khô
-
Cột Satisfaction RP C
18
(250
× 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động: A (H
2
O – CH
3
OH
(9:1))
B (CH
3

CN – HCOOH (9:1))
- Detector PDA tại 530 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- Nhiệt độ cột: 25
o
C
-
Thể tích tiêm mẫu: 25 µL
Nghiền, hòa tan
trong HCl 10 %,
lọc sau đó chạy
sắc ký
[22]
3
HPLC-
PDA-
MS/MS
Trái cây
nhiệt
đới: quả
sơ ri và
acai
-
Cột: Shim – pack CLCODS
C
18
(250 × 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động: HCOOH -
CH
3

OH (5:95)
- Tốc độ dòng: 1mL/phút
- Nhiệt độ cột: 25
0
C
- Thể tích tiêm: 20 µL
Detector: PDA và phân tích
Chiết bằng
CH
3
OH có 0,5 %
HCl để qua đêm
ở 5
0
C, lọc, làm
giàu, lọc trước
khi chạy sắc ký

[27]
10

khối phổ 2 lần MS/MS.
4
HPLC-
DAD-
ESI-
MS/MS
Quả
mọng
(berries)

-
Cột: YMC – pack ODS –
AM C
18
(250 × 4,6 mm, 5
µm)
- Pha động: CH
3
CN – H
2
O –
HCOOH, gradient dung môi
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
- Nhiệt độ cột: 40
0
C
- Thể tích tiêm: 25 µL
-
Detector: ESI – MS/MS.
Mẫu được chiết
bằng CH
3
OH –
HCOOH (97:3)
trước khi chạy
sắc ký
[12]
5 HPLC
Bilberry
extract

-
Cột: YMC-Pack Pro C
18
RS,
250 x 4.6 mm, 5 µm; YMC-
UltraHT Pro C
18
RS, 100 x
3.0 mm, 2 µm.
- Pha động: A: H
2
O –
HCOOH (90:10)
B: CH
3
CN – CH
3
OH – H
2
O
– HCOOH (22,5:22,5:40:10)

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
- Nhiệt độ cột: 30
0
C
- Detector UV-Vis tại bước
sóng 535 nm
-
Thể tích tiêm mẫu: 10 µL

Mẫu được hòa
trong CH
3
OH –
H
2
O (85:15),
rung siêu âm, lọc
trước khi chạy
sắc ký
[33]
1.7. Tổng quan về HPLC
1.7.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography –
HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha
động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào
ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với
tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau. Thành phần pha động đưa
chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp
lý [1].
1.7.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [1], [2]
11

Thời gian lưu:
Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian
lưu t
R
.
Thời gian chết: Thời gian t
M

của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó
bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: t
R
’ = t
R
– t
M

Hệ số phân bố K:
K =
M
S
C
C

C
S
, C
M
: Nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong
hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng
hơn.
Hệ số dung lượng k’:
k’ =
M
S
MM
SS

V
V
K
VC
VC
.
.
.

=
M
MR
t
tt 

V
S
, V
M
tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động.
k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số V
S
/V
M

Thông thường chọn k’ = 1 – 5.
Hệ số chọn lọc α:
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B:
α =
 

 
M
A
R
M
B
R
A
B
A
B
tt
tt
k
k
K
K



'
'

K
B
, K
A
lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’
A

, k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
12

(t
R
)
A
, (t
R
)
B
tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.
Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1. Trong phân tích sắc
ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 – 2. Nếu α quá lớn,
thời gian phân tích kéo dài.
Số đĩa lý thuyết:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký
2
2/1
2
54,516

















W
t
W
t
H
L
N
RR

L: Chiều dài của cột được chia thành N đĩa lý thuyết;
H: Chiều cao của đĩa lý thuyết;
W: Chiều rộng của pic sắc ký;
W
1/2
: Chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic.
Độ phân giải của cột:
Độ phân giải (R
S
) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong
hỗn hợp trên cột sắc ký:
R

S
=
   
 
   
 
BA
A
R
B
R
BA
A
R
B
R
WW
tt
WW
tt
,
2/1
,
2/1
.18,1
.
2
1







Ở đây: W
A
, W
B
tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B;
W
1/2,A
, W
1/2,B
tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với

một nửa chiều cao của pic.
1.7.3. Thiết bị sắc ký lỏng [1], [2]



13








Hình 1.3. Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao.

a. Hệ thống cung cấp pha động:
- Nguốn cấp pha động: Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi
hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong
bình thủy tinh hoặc thép không rỉ.
- Bộ phận loại khí (degasser): Trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45
µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến
dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan bằng
cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
- Bộ phận trộn pha động (mixer): Trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc
áp suất cao
 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: Mỗi bình chứa dung môi có một
van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó chỉ
dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng,
việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao.
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm
làm đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
Hệ thống cấp
dung môi
Bơm Bộ phận tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thống thu
nhận và xửa lý
số liệu (máy ghi,
máy tính)
Buồng cột
14

b. Bộ phận tiêm mẫu

- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở
đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng
chứa mẫu có dung tích khác nhau, thường dùng loại 0,50 – 20 µL. Có vòng chứa
mẫu lớn hơn.
- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu
cột. Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao. Cách tiêm này có
độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm.
- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa,
cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào cột
hằng định nên độ lặp lại cao.
c. Cột sắc ký
- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,
thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 – 30 cm, đường kính trong 4 – 10 mm.
Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 – 10 µm. Ưu điểm của cột nhồi có hạt cỡ nhỏ là
chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn.
- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc
ký để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi
thọ cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích
thước hạt lớn hơn.
- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Loại pha
tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica). Nhóm OH trên bề mặt
silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan.
15


Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan
Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:
- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:
 Gốc octadecyl (C
18

)
 Gốc octyl (C
8
)
 Gốc phenyl propyl
- Pha tĩnh phân cực có R’ là:
 Cyano
 Amino
 Diol
Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai loại
sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo:
- Sắc ký phân bố pha thuận: thường dùng pha tĩnh lỏng phân cực như
C
2
H
2
(OC
2
H
4
OH)
2
, H
2
O. Còn pha động là dung môi ít phân cực hơn như
hexan.
- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C
18
hoặc
C

8
) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như H
2
O, CH
3
CN.
d. Detector
Có nhiều detector được sử dụng trong HPLC và sử dụng các nguyên lý khác
nhay tùy thuộc tính chất đối tượng cần nghiên cứu:
- Detector hấp thụ UV-Vis