Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và độc tính cấp của cây cổ an (arcangelisia flava (l ) merr)

TRƯ
NGHIÊN C
THÀNH PH
TÍNH C
(
ARCANGELISIA FLAVA
KHÓA LU
BỘ Y TẾ
TRƯ
ỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N
ỘI


LÊ TÙNG SƠN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PH
ẦN HÓA HỌC V
À Đ
TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN
ARCANGELISIA FLAVA

(L.) MERR

KHÓA LU
ẬN TỐT NGHIỆP DƯ
ỢC

HÀ NỘI – 2015
ỘI

ỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
À Đ
ỘC
ẤP CỦA CÂY CỔ AN

(L.) MERR
)

ỢC
SĨ
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ TÙNG SƠN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC
TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN
(ARCANGELISIA FLAVA (L.) MERR)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
1.TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. DS. Đỗ Phương Lan
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật

Trường Đại học Dược Hà Nội


HÀ NỘI – 2015


LỜI CẢM ƠN



Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người
thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian va tâm huyết tận tình giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Dược sĩ Đỗ Phương Lan, người
hướng dẫn, người thầy thứ hai, đã theo sát tôi trong tiến trình, giúp tôi vượt qua khó
khăn, bỡ ngỡ.
Tôi cũng rất cảm ơn Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết
lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Bạn Nguyễn Thị Lương – A2K65, bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, dược sĩ
Nguyễn Thị Thùy Linh, đã sát cánh cùng tôi, luôn động viên, giúp đỡ trong quá trình
làm khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, các giảng
viên trong trường đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình rèn
luyện, học tập tại trường.
Cuối cùng xin được gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình người thân đã tạo
quan tâm chăm sóc, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Tùng Sơn

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……………………………………………………… 2
1.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CỦA CHI ARCANGELISIA
BECCARI 2
1.1.1 Phân loại chi Arcangelisia Beccari 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari 2
1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam 2
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 3
1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 6
1.4. CÔNG DỤNG 7
1.5. SƠ LƯỢC VỀ BERBERIN 7
1.5.1. Công thức hóa học và tính chất 7
1.5.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng 8
1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 9
1.6.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 9
1.6.2. So sánh giữa HPTLC và TLC 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………12
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 12
2.1.1. Nguyên vật liệu 12
2.1.2. Thiết bị 13
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14
2.2.1. Về thực vật 14
2.2.2. Về thành phần hoá học 14
2.2.3. Về tác dụng sinh học 14
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật 14
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học 15
2.3.3. Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT …20
3.1.1. Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu 20
3.1.2. Giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu 21
3.1.3. Đặc điểm vi học bột dược liệu 21
3.1.4. Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá 22
3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 25
3.2.1. Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học 25
3.2.2. Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng 27
3.2.3. Bán định lượng berberin trong alcaloid toàn phần của AR7 29
3.3. Kết quả thử độc tính trên chuột nhắt trắng 35
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37
4.1 Về thực vật 37
4.2. Về thành phần hóa học 37
4.3. Về thử độc tính cấp trên chuột 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
TÀI LIỆU THAM
KHẢO Error! Bookmark
not defined.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADC Analog-to-digital converter
BR Berberin
DD Dung dịch
HPTLC High performance thin layer chromatography

LDL Low-density lipoprotein
PƯ Phản ứng
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TLC Thin layer chromatography

TT Thuốc thử
UV-VIS Ultraviolet–visible spectroscopy




DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Công thức hóa học của một số chất được phân lập từ Arcangelisa flava (L.)
Merr.
Hình 1.2. Công thức hóa học của các furanoditerpen được phân lập từ Arcangelisia
flava (L.) Merr.
Hình 1.3. Công thức hóa học của dihydroberberine (4) và 20-hydroxyecdysone (5).
Hình 3.1. Ảnh các mẫu nghiên cứu
Hình 3.2. Ảnh hình thái quả và hạt của mẫu AR4
Hình 3.3. Đặc điểm bột dược liệu của 3 mẫu AR4, AR7, AR8
Hình 3.4. Các hình ảnh vi phẫu lá cây Cổ an trong nghiên cứu
Hình 3.5. Các hình ảnh vi phẫu cuống lá cây Cổ An
Hình 3.6. Sắc ký đồ alcaloid toàn phần của cây Cổ an ở bước sóng 254 và 366nm
Hình 3.7.Hình ảnh chồng píc của sắc ký đồ của hệ 4 ở bước sóng 366nm
Hình 3.8. Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 1
Hình 3.9. Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 2
Hình 3.10. Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 3
Hình 3.11. Đồ thị khảo sát độ pha loãng của mẫu AR7
Hình 3.12. Đường chuẩn định lượng berberin mẫu AR7 ở độ pha loãng 400
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. So sánh một số tham số của HPTLC và TLC.
Bảng 2.1. Địa điểm và ngày thu hái 3 mẫu cây Cổ an.

Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml).
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu.
Bảng 3.2. Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn
Bảng 3.3. Kết quả sắc ký đồ các dịch chiết alcaloid toàn phần ở hệ 4 ở bước sóng
366nm.
Bảng 3.4. Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn.
Bảng 3.5. Khảo sát độ pha loãng của dung dịch thử.
Bảng 3.6. Kết quả bán định lượng berberin ở mẫu AR7 ở độ pha loãng 400 lần
Bảng 3.7. Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ
Bảng 3.8. Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin có trong nhiều loài thực vật bậc
cao, được sử dụng lâu đời trong các nền y học truyền thống. Ngoài các tác dụng
thường được biết đến như tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng đơn bào, hạ huyết áp,
v.v, ngày nay y học hiện đại đã phát hiện thêm các tác dụng mới của berberin như
điều trị ung thư, tiểu đường, v.v[2], [17], [33].
Trên thế giới đã xác định được 150 loài có chứa berberin thuộc 23 chi và 7
họ[7]. Ở Việt Nam đã xác định được các chi cho berberin gồm Coscinium, Cyclea
(Menispermaceae), Berberis, Podophyllum, Mahonia (Berberidaceae), Euodia,
Toddalia (Rutaceae), Coptis, Thalictrum (Ranunculaceae) và một số chi họ
Papaveraceae. Tuy nhiên việc khai thác tràn lan đã khiến các nguồn dược liệu chứa
berberin ngày càng trở nên khan hiếm và có nguy cơ cạn kiệt.
Cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae)
là một loài cây được đồng bào dân tộc sử dụng nhiều làm thuốc chữa bệnh. Trên thực
tế, qua điều tra tại thực địa, nghiên cứu nhận thấy đây là một nguồn dược liệu chứa
berberin quý hiếm.

Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước- nhiệm vụ quỹgen "Đánh giá tiềm năng
di truyền một số nguồn gen dược liệu chứa Berberin ở Việt Nam", thực hiện đề tài
“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa họcvà độc tính cấp của cây Cổ an
(Arcangelisia flava (L.) Merr.)” với những mục tiêu sau:

1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của mẫu cây Cổ An (Arcangelisia flava (L.)
Merr.).
2. Định tính thành phần hoá học và thành phần alcaloid chính trong dược liệu
bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
3. Bán định lượng berberin trong cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.)bằng
phương pháp HPTLC.
4. Thử độc tính cấp của cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.) trên chuột.
2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CỦA CHI ARCANGELISIA
BECCARI
1.1.1 Phân loại chi Arcangelisia Beccari
Arcangelisia là một chi trong họ Tiết dê (Menispermaceae), được lấy tên của
nhà thực vật học người Italia Giovani Arcangeli (1840-1921), có tên thường dùng là
Dây hoàng liên hoặc Cổ an [8].
Chi Arcangelisia có 4 loài, phân bố ở Châu Á: 3 loài ở Đông Nam Á và một
loài ở Trung Quốc. Ở Việt Nam, có 1 loài [8], phân bố chủ yếu ở vùng thấp tỉnh
Đồng Nai [9].
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi ArcangelisiaBeccari
Cây dây leo lớn hóa gỗ. Lá có cuống dài, phiến lớn; gân gốc 3-5; gân lá hình
chân vịt, gân giữa mang mỗi bên 1-2 gân. Cụm hoa chùm ở nách lá, phân nhánh hình
bông. Hoa đực có 6 lá đài mà 3 cái ngoài nhỏ, 3 cái trong hơi lớn hơn các cánh hoa;
cánh hoa 3; nhị 9-12, chỉ nhị không rõ, bao phấn dính nhau thành hình đầu, có 4 thùy
ít phân biệt, mở ngang. Hoa cái có bao hoa như hoa đực; lá noãn 3, mỗi cái chứa 2

noãn; đầu nhụy mập dày, có 3 góc. Quả hạch có vân lăn tăn hoặc bị gặm, hình trứng
–trụ, có một rãnh vòng quanh, mặt ngoài có lông. Vỏ quả ngoài dai, vỏ quả trong
cứng. Hạt có nhiều phôi nhũ quanh phôi; lá mầm nhỏ, không thẳng [8], [34].
1.1.3. Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam
1.1.3.1. Arcangelisia loureiri(Pierre) Diels– Vẩy đắng, Dây hoàng liên, Cổ sơn
long
Dây leo to hóa gỗ, cành già có khía. Lá đơn, mọc so le, hình trứng tròn hoặc
hình bầu dục rộng, dài 8-12 cm, rộng 6-10cm, đầu nhọn, gốc gần bằng ngang; gân
gốc 3-5; cuống lá phình ở gốc và ở ngọn, dài 3-8 cm. Cụm hoa chùm, ở nách lá trên
các nhánh già. Cụm hoa đực nhỏ, dài 8cm, phân nhánh hình bông, không cuống, lá
bắc hình tam giác; lá đài ngoài 3, 3 gần hình thuyền; nhị 9 hướng ngoài, rất ngắn.
3

Cụm hoa cái dài 30-50cm. Hoa cái có 6 phiến bao hoa, hình tròn dài hẹp, đầu mút
hướng ra sau; nhị thoái hóa nhỏ, dạng vẩy; lá noãn 3; không có vòi nhụy; đầu nhụy
rộng, có 3 góc.Quả hạch hình tròn dài, về sau có màu vàng, ở đỉnh có dấu vết của đầu
nhụy, mặt ngoài có lông mềm.
Phân bố ở Malaysia, Indonesia(Sumatra), Việt Nam và Nam Trung Quốc. Ở
nước ta cũng chỉ gặp tại tỉnh Đồng Nai (Bảo Chang, Cát Tiên) [8].
1.1.3.2. Arcangelisa flava (L.) Merr – Dây Hoàng Liên, Cổ An
Dây leo to; gỗ vàng tươi, mủ vàng; nhánh non không lông, đen, cũng như
cuống lá. Phiến to hay trung, kích thước 10-25 x 4,5-19cm, dai cứng, không lông,
gốc tròn hay hình tim, gân 5 từ gốc; cuống 3-15cm, phù 2 đầu. Chùm tụ tán 10-50cm;
hoa đực nhỏ, 3 lá đài ngoài, 3-3 lá đài trong, tiểu nhụy lép như vảy, 3 tâm bì. Trái
xoan, dài 2 cm, vàng, trên đế hoa phù rộng.
Phân bố: Loài phân bố ở Thái Lan, Việt Nam và Nam Trung Quốc, ở nước ta
chỉ gặp ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai. Thu hái quanh năm, rửa sạch, thái lát, phơi khô
[9].
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Theo nghiên cứu của Thornber (1970), alcaloid nhân isoquinolin gồm

palmatin và jatrorrhizinvà alcaloid berberin đã được ghi nhận phân lập từ
Arcangelisa flava (L.) Merr [31].
Cấu trúc hóa học của một số chất phân lập từ Arcangelisa flava (L.)
Merr.được xác định bởi phương pháp phân tích phổ bằng phổ cộng hưởng từ hạt
nhân và đo khối phổ[20] gồm palmatin, jatrorrhizin và berberin được mô tả trong
hình 1.1:
4


Hình 1.1.Công thức hóa học của một số chất được phân lập từ
Arcangelisa flava (L.) Merr.
Một số alcaloid khác như columbamin, dehydrocorydalmin, homoaromolin và
thalifendin cũng được phân lập từ thân của Arcangelisa flava (L.) Merr.[32].Nhiều
hợp chất furanoditerpen gồm fibraurin, 6-hydroxyfibraurin, fibleucin, chasmantin,
palmalin, columbin, jateorin, isojateorin và tinopylon đã được phân lập từ các cây họ
Tiết dê(Menispermacea). Theo Toshinobu Kunii và cộng sự, bốn hợp chất
furanoditerpen mới bao gồm 6-hydroxyarcangelisin, 2-dehydroarcangelinisinol,
tinophylol và 6-hydroxyfibleucin đã được phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr.
[21].
Năm 2011, theo Toshisada Suzuki và các cộng sự, hai hợp chất furanoditerpen
mới là 2a,3a-epoxy-2,3,7,8 a-tetrahydropenianthic acid methyl ester và 2a,3a epoxy-
2,3-dihydropenianthic acid methyl ester đã được phân lập và phát hiện từ rễ của
Arcangelisiaflava (L.) Merr.[30].
5


Hình 1.2. Công thức hóa học của các furanoditerpen được phân lập từ
Arcangelisia flava (L.)Merr
(1): 2a,3a-epoxy-2,3,7,8 a-tetrahydropenianthic acid methyl ester;
(2): 2a,3a epoxy-2,3-dihydropenianthic acid methyl ester.

Các thử nghiệm sinh học bằng cất phân đoạn dịch chiết nóng từ thân cây đã
giúp phân lập palmatin, berberin, jatrorrhizin, dihydroberberin và 20-hydroxyecdyson
từ Arcangelisia flava (L.) Merr.trong đó 3 chất đầu tiên đã được biết đến là thành
phần của Arcangelisa flava (L.) Merr.còn jatrorrhizin, dihydroberberin và 20-
hydroxyecdyson là những sản phẩm tự nhiên được phân lập lần đầu tiên[24].

Hình 1.3.Công thức hóa học của dihydroberberin (4) và 20-hydroxyecdyson (5)
6

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC
Dịch chiết methanol của Arcangelisia flava (L.) Merr.cho tác dụng chống oxi
hóa trung bình với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ở liều EC
50
là
25-55µg/ml. Dịch chiết methanol, chloroformcho tác dụng gây độc tế bào đối với
tôm mặn (brine shrimp) và dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với liều LC
50
và IC
50
giá
trị lần lượt là 210-278 và 8-12µg/ml [20].
Hoạt tính kháng khuẩn của Arcangelisia flava (L.)Merr. được đánh giá thông
qua phương pháp khuếch tán đĩa với dịch chiết nước của Arcangelisia flava
(L.)Merr., sử dụng 3 vi sinh vật:Salmonella typhii, Staphylococcus aureus và
Trichophyton rubrum. Kết quả, cho hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt với 3 chủng vi sinh
vật trên[18]. Đối với Aeromonas hydrophila, cũng bằng phương pháp khuếch tán đĩa
trong môi trường thạch, trong các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether,
methanol, aceton và nước từ thì dịch chiết Chloroform của Arcangelisia flava
(L.)Merr.cho hoạt tính kháng cao nhất với vòng ức chế đường kính 17,25mm [23].
Năm hợp chất furanoditerpen được phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr.

gồm 2a,3a-epoxy-2,3,7,8a-tetrahydropenianthic acid methyl ester; 2a,3aepoxy-2,3-
dihydropenianthic acid methyl ester; Fibraurin; fibleucin và 2b,3a-dihydroxy-
2,3,7,8a-tetrahydropenianthic acid-2,17-lactonecho tác dụng chống nấm với Trametes
versicolor và Fomitopsis palustris[30].
Khi đánh giá hoạt tính in vitro kháng Plasmodium falciparum, Arcangelisia
flava (L.) Merr.là một trong sáu cây thuốc cho hoạt tính kháng Plasmodium
falciparum tốt (IC
50
từ 0.4 đến 8.6 g/ml) với tác dụng chọn lọc đặc hiệu [25].
Các chất phân lập được từ Arcangelisia flava (L.) Merr.gồm palmatin,
berberin, jatrorrhizin, dihydroberberinvà 20-hydroxyecdysonđược đánh giá tác dụng
ức chế sự phát triển của ký sinh trùng Babesia gibsoni gây bệnh lê dạng trùng
(babesiasis ) trong điều kiện nuôi cấy 1 tuần. Bốn chất đầu đã cho tác dụng ức chế có
ý nghĩa lâm sàng ở nồng độ 1 đến 100µg/ml, trong khi 20-hydroxyecdyson chỉ có tác
dụng ức chế khi ở nồng độ 100µg/ml [24].

1.4. CÔNG DỤNG
Ở Thái Lan,gỗ
cây đư
và trừ tiêu chảy. Rễ đư
ợ
Ở Indonesia đượ
c s
dùng như thuốc bổ [30]
.
Ở Việ
t Nam, theo kinh nghi
có độc, có tác dụ
ng thanh nhi
[11].

1.5. SƠ LƯ
ỢC VỀ BERBERIN
1.5.1
.
Công th
ức hóa học v
Công thức phân tử: C
20
Công thưc hóa học:
Tên khoa học:5,6
dihydro
anthracen clorid dihydrat
Lý tính:
Tinh thể hay b
ột kết tinh m
dạng base là 145
o
C (b
ị phân hủy).
ethanol, khó tan trong eth
trong nư
ớc sôi, tan trong
mu
ối sulfat dễ tan trong n
đối nên không có đ
ồng phân quang học
7
cây đư
ợc dùng để lợi tiêu hóa, bổ huyế
t, làm

ợ
c dùng làm thuốc nhuận tràng [9].
c s
ử dụng truyền thống để điều trị số
t rét, b
.

t Nam, theo kinh nghi
ệm dân gian, cây Cổ an có v
ị
ng thanh nhi
ệt giải độc, lợi kinh, trị số
t, giúp ho, ch
ỢC VỀ BERBERIN

ức hóa học v
à tính chất
20
H
18
NO
4
Cl. 2H
2
O; Phân tử l
ư
dihydro
-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-
azoniaindeno(5,6
anthracen clorid dihydrat

[6].
ột kết tinh m
àu vàng, không mùi, có v
ị rất đắng. Độ chảy khi ở
ị phân hủy).
D
ạng base tan chậm trong n
ethanol, khó tan trong eth
er. D
ạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong n
ớc sôi, tan trong
ethanol, th
ực tế không tan trong chloroform v
ối sulfat dễ tan trong n
ư
ớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol.Berberin không có C bất
ồng phân quang học
[15].
t, làm
thuốc điều kinh
t rét, b
ệnh lỵ, sốt và được
ị
đắng, tính bình, hơi
t, giúp ho, ch
ống bướu [9],
ư
ợng: 407,9.

azoniaindeno(5,6

-a)
ị rất đắng. Độ chảy khi ở
ạng base tan chậm trong n
ước, hơi tan trong
ạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong n
ước, dễ tan
ực tế không tan trong chloroform v
à ether. Dạng
ớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol.Berberin không có C bất
8

Hóa tính:
Hóa tính của N
+
: berberin có tính chất như một base yếu, tạo muối bằng cách
thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà
muối tạo thành giống muối hydroxyd kim loại, đồng thời có sự tạo thành phân tử
nước.


Hóa tính của Oxy: berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, N
không bền vững, dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal.
Hóa tính của mạch kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho
các hydro alcaloid không màu[15].
1.5.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng
Berberin có tác dụng kháng khuẩn, được dùng chủ yếu trong các bệnh rối
loạn đường tiêu hóa [27].
Ngoài ra berberin với liều nhỏ có tác dụng kích thích tim, làm giãn mạch
vành, với liều lớn ức chế hô hấp, làm ức chế trung khu hô hấp trong khi tim vẫn đập.
Berberin còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê, lợi mật, kháng lợi niệu, đối với đường

huyết lúc đầu có tác dụng tăng cao và sau đó thì hạ. Berberin đem khử hóa cho
tetrahydroberberin có tác dụng an thần và mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [3].
Berberin gần đây đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về tác dụng hạ
đường huyết và cho thấy hiệu quả tương đường với metformin, cơ chế hoạt động bao
gồm việc ức chế aldose reductase, làm giảm đường và ngăn ngừa sự kháng insulin.
Berberin làm giảm mạnh lượng cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid và xơ vữa
9

nhưng cơ chế hoạt động khác biệt với statin làm cho berberin không gây ra tác dụng
phụ điển hình như statin [29].
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tác dụng chống ung thư của berberin, berberin
có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm ung thư vú,
ung thư biểu mô, ung thư tụy, ung thư dạ dày mà không làm ảnh hưởng đến sự phát
triển của các tế bào bình thường ở nồng độ nhất định [26].
1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.6.1. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ
thuật SKLM. Thiết bị HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động như:
máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký
(ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC
Scanner 3,4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [35].
Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không khác nhiều so với sắc ký lớp mỏng
thông thường. Cả hai phương pháp đềulà kỹ thuật tách được tiến hành trên một lớp
mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng
thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha tĩnh
làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha đng
bao gm dung dch cn phân tích đc hòa tan trong mt dung môi thích hp
và đc hút lên bn sc kí bi lc mao dn, (hoc đa lên bn mng bng lc
đy ca máy), tách dung dch thí nghim da trên tính phân ccca các thành
phn trong dung dch [1].

R
f
là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ R
f
. Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân
tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
R
f
= d
R
/
dM
Trong đó:
d
R
: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
10

d
M
: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động
(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
R
f
có giá trị dao động từ 0 đến 1.
Điểm khác biệt cơ bản là kỹ thuật này sử dụng bản mỏng hiệu năng cao có lớp
pha tĩnh mỏng hơn, với bột mịn có kích thước hạt nhỏ hơn, độ đồng đều cao hơn [1].
1.6.2. So sánh giữa HPTLC và TLC
Một số đặc điểm khác nhau giữa hai phương pháp HPTLC và TLC (Sắc ký

lớp mỏng) được mô tả trong bảng 1.1.

11

Bảng 1.1: So sánh một số tham số của HPTLC và TLC
TT Tham số HPTLC TLC
1 Công nghệ Bán tự động Thủ công
2
Độ dày lớp pha tĩnh 5-6µg 10-12µg
3
Chiều cao đĩa lý thuyết 12µg 30µg
4
Hiệu lực tách Cao Thấp hơn
5
Giới hạn phát hiện(Sử dụng
máy đo độ hấp thụ UV-VIS)
100-500pg 1-5 ng
6 Giới hạn phát hiện(Sử dụng
máy quét huỳnh quang)
5-10pg 50-100ng
Ưu điểm của HPTLC so với TLC như sau [10]:
- Khả năng phân tách tốt hơn. Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng
cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản
mỏng cũng tốt hơn.
- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản
mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn.
- Thời gian triển khai ngắn hơn.
- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển
khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các yếu tố về
môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn

chế tới tối đa các thay đổi.
12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1 Mẫu nghiên cứu
Ba mẫu Cổ An AR4, AR7, AR8, thời gian và địa điểm thu hái được mô tả cụ
thể trong bảng 2.1 và phụ lục 3.
Bảng 2.1. Địa điểm và ngày thu hái 3 mẫu cây Cổ an
Mẫu AR4 AR7 AR8
Nguồn gốc
Bến cự - Vườn
quốc gia Cát
Tiên - Đồng
Nai
Vườn quốc gia
Cát Tiên -
Đồng Nai
Đèo Chuối -
Bảo Lộc - Lâm
Đồng
Ngày thu
mẫu
27/01/2013 27/01/2013 28/01/2013
Ngày nộp
mẫu
12/05/2015 12/05/2015 12/05/2015
Số hiệu
phòng tiêu

bản
HNIP/18120/15

HNIP/18121/15

HNIP/18122/15

Mẫu nghiên cứu thực vật được lấy cả thân, lá và cơ quan sinh sản (nếu có),
tiêu bản cây khô được lưu tại phòng Tiêu bản – Bộ môn Thực vật – Trường Đại học
Dược Hà Nội.
Mẫu nghiên cứu hoá học và tác dụng sinh học được lấy phần thân, được thái
nhỏ, sấy khô ở 55-60
o
C, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.
13

2.1.1.2. Hóa chất, vật liệu
Berberin clorid và palmatin clorid chuẩn: Viện kiểm nghiệm, tiêu chuẩn
phòng thí nghiệm.
Dung môi: n-butanol, acid acetic, cloroform, methanol, n-propanol, acid
formic, ethyl acetat, toluen, amoniac, nước cất, EtOH 90%, EtOH 25%, ether.
Các hóa chất và thuốc thử định tính: Bột Magie kim loại, dd HCl đặc, dd NH
3

đặc, dd NH
3
6N, dd NaOH 10%, dd FeCl
3
5%, dd NaOH đặc, dd acid sulfanilic, dd
NaNO

2
5%, dd NaNO
2
10%, dd anhydrid acetic, dd H
2
SO4 đặc, dd H
2
SO4 1N, dd
Pb(CH
3
COO)
2
30%, dd Pb(CH
3
COO)
2
10%, Na
2
SO4 khan, dd H
2
SO
4
đặc, dd acid
Picric 1%, dd Natri nitroprussiat 0.5%, gelatin 1%, tinh thể Na
2
CO
3
, dd TT Fehling A
và TT Fehling B, dd Ninhydrin 3%, dd TT Mayer, dd TT Bouchardat, dd TT
Dragendorff.

Giấy quỳ, ống mao quản, bản mỏng, ống lưu mẫu, hạt silicagel, bản mỏng
TLC, giấy bóng bọc, giấy dán nhãn.
2.1.1.3. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, khỏe mạnh, giống cái,
do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.
2.1.2. Thiết bị
- Hệ thống chiết xuất: Bình cầu, ống sinh hàn, dây nối.
- Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T.
- Kính lúp soi nổi Nikon ECLIPSE.
- Máy HPTLC Camag bao gồm : thiết bị chấm mẫu Linomat 5, thiết bị khai triển ADC
2, máy soi UV-visualizer.
- Bộ dụng cụ hồi lưu cách thủy: Sinh hàn, giá đỡ kim loại, bình chiết hồi lưu, ống cao
su, bếp đun hồng ngoại.
- Bình chiết hồi lưu.
- Bình triển khai sắc ký.
- Nồi đun cách thủy.
14

- Tủ sấy WiseVen ® WOF.
- Máy đo hàm ẩm Precisa HA60.
- Cân phân tích Shimadzu.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 50, 100 và 200 ml; bình định mức 5 ml, 10 ml, 25
ml, 50 ml, 100 ml; pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Về thực vật
- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu.
- Sơ bộ xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
- Làm tiêu bản vi phẫu thân, mô tả, quan sát đặc điểm cấu tạo giải phẫu.
- Quan sát, mô tả đặc điểm bột dược liệu.
2.2.2. Về thành phần hoá học

- Định tính thành phần hoá học chính trong mẫu nghiên cứu.
- Chiết xuất và định tính alcaloid toàn phần trong các mẫu nghiên cứu.
- Bán định lượng các thành phần alcaloid chính của các mẫu thu thập được.
2.2.3. Về tác dụng sinh học
- Thử độc tính cấp cao đặc thân Cổ an trên chuột nhắt trắng.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
2.3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái
Mô tả các đặc điểm hình thái bằng phương pháp mô tả phân tích. Sử dụng
kính lúp soi nổi hoặc quan sát bằng mắt thường, từ đó mô tả các đặc điểm hình thái
các cơ quan dinh dưỡng (rễ, thân, lá) và cơ quan sinh sản (nếu có)[4], [5].
So sánh các đặc điểm hình thái mô tả được với các đặc điểm ghi trong khoá
phân loại của Thực vật chí Trung Quốc, sơ bộ giám định tên khoa học [34].
15

2.3.1.2. Làm tiêu bản vi học thực vật
Tiêu bản vi học các cơ quan dinh dưỡng của các mẫu nghiên cứu được làm
theo phương pháp cắt và nhuộm kép, sử dụng kính hiển vi quan sát mẫu tiêu bản vi
học, từ đó mô tả các đặc điểm định tính và định lượng về cơ quan giải phẫu của các
mẫu [4].
2.3.1.3. Soi bột
Dược liệu được sấy khô, xay nhỏ, chọn ra các phần bột kích thước nhỏ, mịn
rồi quan sát hình dạng, màu sắc, ngửi, nếm, nhận biết mùi vị của bột. Soi tìm đặc
điểm bột rồi chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn kết camera Nikon DS Fi2 [13].
2.3.2. Nghiên cứu về hóa học
2.3.2.1. Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học
Định tính bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm theo tài liệu Thực tập
dược liệu [13].
2.3.2.2. Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng
(1) Chiết xuất alcaloid

Cân chính xác khoảng 1,0g bột dược liệu. Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi
methanol: acid hydroclorid (100:1). Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết.
Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100:1), chiết lặp lại 2
lần. Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn. Hòa tan trong nước nóng 5
lần, mỗi lần 15ml, lọc lấy dịch chiết. Cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn trong
methanol, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch lắc đều,
lọc qua màng lọc 0,45 µm.
(2) Tiến hành sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị bản mỏng: Dùng bản mỏng Aluminum silicagel GF
254
, hoạt hóa bản
mỏng ở 110
o
C trong 1 giờ, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký.
16

Chuẩn bị pha động: Khảo sát các hệ pha động sau để chọn ra hệ có khả năng
tách tốt nhất để tiến hành định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng.
- Hệ 1: n-butanol: acid acetic: H
2
O (7: 1:20) [6].
- Hệ 2: Chloroform: methanol (9:1)[22].
- Hệ 3: n-propanol:nước:acid forrmic(90:8:0,4)[12].
- Hệ 4: Ethylacetat:n-butanol:acid acetic:nước (1,5:5,5:1,0:2,0)[19], [22].
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch berberin chuẩn và palmatin chuẩn dùng
để định tính alcaloid trong các mẫu nghiên cứu là dung dịch có nồng độ 0,06%.
Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Là dịch chiết alcaloid toàn phần.
(3) Phát hiện vết trên sắc ký đồ
Quan sát bản mỏng đã triển khai bằng cách soi đèn tử ngoại trong thiết bị
TLC-visualizer ở bước sóng 366nm, 254nm. Chụp ảnh kết quả thu được.

2.3.2.3. Bán định lượng alcaloid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng
cao
Bán định lượng berberin, palmatin của mẫu nghiên cứu bằng kỹ thuật sắc ký
lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC). Tiến hành theo các bước sau:
(1) Chiết xuất alcaloid
Tiến hành như phần 2.3.2.2.
(2) Chuẩn bị dung dịch thử
Từ 100ml dịch chiết methanol thu được, pha loãng lần lượt thành các nồng độ
400, 800, 1000, 1250 và 1600 lần.
(3) Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Pha các dãy dung dịch chuẩn Berberin có các giới hạn nồng độ khác nhau như
bảng 2.2.
17

Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)
Nồng độ
(mg/ml)
Br1 Br2 Br3 Br4 Br5 Br6
Dãy 1 0,100 0,200 0,400 0,800
Dãy 2 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500
Dãy
3[14].
0,009 0,018 0,027 0,036 0,054 0,072
Hòa tan chính xác khoảng 0,0216g berberin chlorid chuẩn (83,7%) trong
methanol, chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm methanol vừa đủ tới vạch lắc đều,
lọc. Thu được dung dịch chuẩn nồng độ 0,72 mg/ml.
Pha loãng thành dãy chuẩn có nồng độ tương tương ứng với từng dãy ở trên
(4) Chất hấp phụ: Bản mỏng Aluminum silicagel GF254, kích thước 10x20cm hoạt
hóa ở 110
o

C trong 1 giờ, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
(5) Hệ dung môi khai triển: ethylacetat: n-butanol:acid acetic:nước (1,5:5,5:1:2).
(6) Tiến hành sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trên hệ thống HPTLC Camag: sử dụng
phần mềm Wincat.
+ Phun mẫu bằng máy Linomat 5, thể tích phun mẫu là 3 µl, độ dài vết 6mm, vị trí
chấm cao 0.8mm, cách mép 1.5mm.
+ Triển khai sắc ký trên máy ADC 2 trong điều kiện:
Thể tích dung môi dùng để bão hòa là 25ml, thời gian bão hòa dung môi là 20
phút. Thể tích dung môi dùng để triển khai sắc ký là 10 ml. Chiều dài quãng đường
chạy của dung môi là 80 mm. Thời gian làm khô dung môi sau khi triển khai là 5
phút.
+ Quan sát bản mỏng dưới đèn UV ở bước sóng 254nm và 366nm.