Xây dựng phương pháp phân tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ raman

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH
THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2015


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH
THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
Ths. Đặng Thị Ngọc Lan
Nơi thực hiện:
1. Viện kiểm nghiệm thuốc TW
2. Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội



HÀ NỘI - 2015



LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến
PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu và ThS. Đặng Thị Ngọc Lan đã trực tiếp
hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình để tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ ở Khoa kiểm nghiệm
nguyên liệu- Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã hướng dẫn tận tình
trong thời gian tôi làm thực nghiệm, hoàn chỉnh nghiên cứu này tốt nhất.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất
đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa
luận này.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo
và cán bộ nhân viên Trường đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo
và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt thời gian học dưới
mái trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình đã luôn
ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015

Sinh viên


Nguyễn Thị Thùy Linh


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về thuốc giả 3
1.2. Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol 5
1.2.2. Danh pháp 5
1.2.2. Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol 6
1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman 7
1.3.1. Lịch sử phát triển 7
1.3.2. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman 9
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman 12
1.3.4. Ưu nhược điểm của quang phổ Raman 13
1.3.5. Một số ứng dụng của quang phổ Raman trong thực tiễn 17
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 18
2.1.1. Nguyên vật liệu 18
2.1.2. Thiết bị 18
2.2. Nội dung nghiên cứu 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1. Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng
trong nghiên cứu 21
3.1.1. Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Isoniazid 21
3.1.2. Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất

Ethambutol 24


3.2. Kiểm tra chất lượng của các mẫu viên nghiên cứu 27
3.3. Kết quả và bàn luận 27
3.3.1 Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Isoniazid 27
3.3.2 Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Ethambutol 36
3.3.3 Bàn luận 45
3.4. Ứng dụng khảo sát các chế phẩm trên thị trường 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
Kết luận 49
Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC













DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CT Công thức
FT Fourier Transform Biến đổi Fourier

NIR Near Infrared Hồng ngoại gần
IR Infrared Hồng ngoại
S/N Signal-to-noise Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại-khả kiến
TLTK Tài liệu tham khảo
TT Thuốc thử


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Bảng Nội dung Trang
1 Bảng 1.1 Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013 3
2 Bảng 1.2
Tỉ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ
năm 2009-2013
3
3 Bảng 1.3 Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009-2013 4
4 Bảng 3.1 Công thức bào chế viên nén Isoniazid 21
5 Bảng 3.2 Công thức bào chế viên nang Isoniazid 23
6 Bảng 3.3 Công thức bào chế viên nén Ethambutol 24
7 Bảng 3.4 Công thức bào chế viên nang Ethambutol 26
8 Bảng 3.5
Tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ chuẩn
Isoniazid
32
9 Bảng 3.6
Các đỉnh đặc trưng của viên chứa hoạt chất Isoniazid thực
chế tạo
33
10 Bảng 3.7
Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh

đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa Isoniazid
34
11 Bảng 3.8
Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh
đặc trưng của phổ các thuốc chứa Isoniazid
34
12 Bảng 3.9
Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh
đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa 50%
Isoniazid
36
13 Bảng 3.10
Tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ chuẩn
Ethambutol
41
14 Bảng 3.11
Các đỉnh đặc trưng của các viên chứa hoạt chất
Ethambutol thực chế tạo.
42
15 Bảng 3.12
Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh
đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa Ethambutol
43
16 Bảng 3.13
Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh
đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa 50%
Ethambutol
44
17 Bảng 3.14 Bảng kết quả đo phổ Raman của chế phẩm khảo sát có 47

chứa Isoniazid so với thư viện phổ đã thiết lập.
18 Bảng 3.15
Bảng kết quả đo phổ Raman của chế phẩm khảo sát có
chứa Ethambutol so với thư viện phổ đã thiết lập
48

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Hình Nội dung Trang
1 Hình 1.1.
Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích
đến mẫu
10
2 Hình 1.2
Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes m, n, r: các mức
năng lượng
11
3 Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman 12
4 Hình 2.1
Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng
Renishaw
18
5 Hình 3.1 Phổ Raman chuẩn của Isoniazid 28
6 Hình 3.2 Phổ Raman của viên nang placebo Isoniazid CT4 28
7 Hình 3.3 Phổ Raman của viên nang placebo Isoniazid CT2 29
8 Hình 3.4 Phổ Raman của viên nén placebo Isoniazid CT1 29
9 Hình 3.5 Phổ Raman của viên nén placebo Isoniazid CT3 30
10 Hình 3.6 Phổ Raman của viên nang Isoniazid CT4 30
11 Hình 3.7 Phổ Raman của viên nang Isoniazid CT2 31
12 Hình 3.8 Phổ Raman của viên nén Isoniazid CT1 31
13 Hình 3.9 Phổ Raman của viên nén Isoniazid CT3 32
14 Hình 3.10 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Isoniazid CT4 35
15 Hình 3.11 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Isoniazid CT1 35
16 Hình 3.12 Phổ Raman chuẩn của Ethambutol 37
17 Hình 3.13 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT1 37

18 Hình 3.14 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT2 38
19 Hình 3.15 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT3 38
20 Hình 3.16 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT4 39
21 Hình 3.17 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT1 39
22 Hình 3.18 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT2 40
23 Hình 3.19 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT3 40
24 Hình 3.20 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT4 41
25 Hình 3.21 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Ethambutol CT3 43


26 Hình 3.22 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Ethambutol CT1 44
27 Hình 3.23
Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Isoniazid với phổ
chuẩn
46
28 Hình 3.24
Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Ethambutol với phổ
chuẩn
46
29 Hình 3.25 Phổ Raman của một số chế phẩm khảo sát 48

1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc giả, thuốc kém chất lượng đang là một vấn đề lớn trong xã hội, nó
không chỉ gây thiệt hại về kinh tế, gây khó khăn cho ngành công nghiệp dược
mà nguy hiểm hơn, nó còn là mối hiểm họa với nhiều người bệnh. Thuốc giả
không chỉ làm kéo dài quá trình điều trị, gây biến chứng mà còn gây tử vong.
Thuốc giả phong phú về chủng loại, đa dạng về nguồn gốc xuất xứ, chúng
ngày càng được sản xuất tinh vi hơn, trà trộn vào từng cửa hàng, hiệu thuốc,
và những năm gần đây, thuốc giả còn đi vào cả bệnh viện thông qua đấu thầu.
Nhiều trường hợp, thuốc giả đã đến tay bệnh nhân hoặc thậm chí được bán hết
rồi mới có quyết định thu hồi, đình chỉ.
Việc ngăn ngừa và bài trừ thuốc giả đang là một vấn đề cấp bách với cơ
quan chức năng. Vì tình hình thuốc giả ngày càng diễn biến phức tạp, số
lượng thuốc trên thị trường ngày càng lớn, các phương pháp phân tích truyền
thống thì cho kết quả chính xác nhưng tốn rất nhiều thời gian Có một
phương pháp phân tích quang phổ trong ngành Dược còn khá mới mẻ là
phương pháp phổ Raman. Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30

của thế kỷ trước nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật nên nó còn phát triển
khá chậm. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ về công nghệ laser, phổ
Raman ngày càng phát triển và có rất nhiều ưu thế, đặc biệt được ứng dụng
vào việc phát hiện nhanh thuốc giả trong ngành Dược. Với ưu điểm nổi bật là
phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng, phổ
Raman đang được khai thác và đưa vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, một trong
số đó là công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc với độ tin cậy,
chính xác cao.
Isoniazid và Ethambutol là các thuốc chống lao thiết yếu. Chương trình
chống lao Việt Nam luôn cung cấp đầy đủ, liên tục thuốc chống lao có chất
lượng. Tuy nhiên các thuốc này dễ bị làm giả vì tung ra thị trường dễ tiêu thụ.
2


Mặt khác số lượng các thuốc này lớn nên dễ trà trộn vào thị trường mà cơ
quan quản lý khó kiểm soát được hết. Vì vậy rất cần các biện pháp phát hiện
nhanh để kiểm soát chất lượng thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị,
nâng cao sức khỏe cộng đồng. Nhằm nâng cao chất lượng thuốc chống lao,
nhóm nghiên cứu chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp phân
tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ Raman” với 2 mục tiêu:
1. Xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản của 2 hoạt chất Isoniazid và
Ethambutol.
2. Xác định khoảng dao động về vị trí và cường độ của các giá trị dịch
chuyển Raman dưới ảnh hưởng của một số tá dược thường dùng trong
viên nén và viên nang để xây dựng quy trình định tính các viên nén có
hoạt chất trên.

3


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về thuốc giả
Tại điều 2 chương 1 của Luật Dược- năm 2005, quy định rõ: Thuốc kém
chất lượng là thuốc không đạt tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký với cơ quan
có thẩm quyền. Thuốc giả là sản phẩm được sản xuất dưới dạng thuốc với ý
đồ lừa đảo, thuộc một trong những trường hợp sau đây: a) Không có dược
chất; b) Có dược chất nhưng không đúng hàm lượng đã đăng ký; c) Có dược
chất khác với dược chất ghi trên nhãn; d) Mạo tên, kiểu dáng công nghiệp của
thuốc đã đăng ký bảo hộ sở hữu công nghiệp của cơ sở sản xuất khác.[6]
Ở Việt Nam, tỉ lệ thuốc kém chất lượng chiếm khoảng 2,5% - 3,3%.
Năm 2013, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tiến hành lấy 39853 mẫu
lấy và phát hiện 1004 mẫu lấy không đạt chất lượng (chiếm 2,52%, thấp hơn
năm 2012 là 0,57%), trong đó có 186 thuốc nhập khẩu và 762 thuốc sản xuất
trong nước.
Bảng 1.1: Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013
Năm 2009 2010 2011 2012 2013
Tỉ lệ (%) 3,33% 3,12% 2,81% 3,09% 2,52%
Nếu tính riêng cho thuốc đông dược, dược liệu thì tỉ lệ này cao hơn nhiều
(6,09% - 9,6%).
Bảng 1.2: Tỉ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ năm
2009 – 2013
Năm Số mẫu lấy Số mẫu không đạt Tỉ lệ mẫu không đạt

2009 5672 518 9,13%
2010 6511 625 9,60%
2011 5801 353 6,09%
2012 6345 524 8,26%
4


2013 8040 576 7,16%
Số lượng mẫu giả được phát hiện trong năm 2013 là 8 mẫu, chiếm 0,02% mẫu
lấy kiểm tra chất lượng.
Bảng 1.3: Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009 - 2013
Năm 2009 2010 2011 2012 2013
Tỉ lệ (%) 0,12% 0,08% 0,09% 0,10% 0,02%
Các loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng phần nhiều là thuốc tân dược như:
thuốc điều trị sốt rét, thuốc chống lao, thuốc tránh thai hỗn hợp, thuốc chống
cúm H5N1, thuốc kháng virus viêm gan và thuốc AIDS; một số thuốc thông
thường, tiêu thụ nhiều như: hạ nhiệt giảm đau, kháng sinh …
Đặc biệt gần đây, thuốc đông y vốn là lĩnh vực được coi là an toàn cũng
đã có dấu hiệu bị làm giả. Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược để
tăng tác dụng tức thì của thuốc đông dược. Nếu thuốc đông dược thành phần
có trộn hoạt chất hoá dược (tân dược) nhưng không công bố trên nhãn hoặc
tân dược mà ghi nhãn là thuốc đông dược, thực chất là thuốc tân dược thì
được coi là thuốc giả. Đây không chỉ là vấn đề riêng của nước ta mà các nước
trên thế giới cũng rất quan tâm. Trong những năm gần đây, ở nước ta, cùng
với sự phối hợp của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm
nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc này.
Trong số đó, bao gồm cả thuốc có hoặc không có nguồn gốc, thuốc sản xuất
trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là chưa được cấp số
đăng ký.
Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi: ví

dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của
thuốc,…
Điển hình, năm 2010, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phát hiện
chế phẩm đông dược “Viên Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng,
5


dung để bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lý, có trộn trái phép Isoniazid
(một chất ức chế men PDE-5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới
98mg/viên. Năm 2011, phát hiện thấy trộn trái phép Sibutramin trong một số
thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm béo như Lishou, Juji hay phát hiện
Dexamethason trong bài thuốc gia truyền bổ tỳ chữa chứng biếng ăn, còi
xương cho trẻ em.
Tháng 3 năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW phối hợp với Quản lý
thị trường đã phát hiện thuốc Zinnat giả và gần đây nhất tháng 4 năm 2012,
Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm - Thực phẩm Hưng Yên đã
phát hiện thuốc tiêm Voltarén
®
75mg giả.
1.2. Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol
1.2.1. Danh pháp [3]
Isoniazid

Tên khoa học: pyridine-4-carbohydrazide
Công thức: C
6
H
7
N
3

O
Khối lượng phân tử: 137,1
Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hay tinh thể không màu, không mùi. Dễ tan
trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, khó tan trong chloroform, rất khó tan
trong ether.



6


Ethambutol hydroclorid

Tên khoa học: (2S,2’S)-2,2’- (ethylenediimino)dibutan -1-ol dihydrochloride
Công thức: C
10
H
26
Cl
2
N
2
O
2
Khối lượng phân tử: 277,2
Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%.
Nhiệt độ nóng chảy khoảng 202
0
C.
1.2.2. Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol [3], [4]

1.2.2.1. Định tính Isoniazid
Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:
Nhóm I: B và C.
Nhóm II: A và C.
A. Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng
ngoại của isoniazid chuẩn hoặc phổ hồng ngoại đối chiếu của isoniazid
chuẩn.
B. Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 2 ml nước, thêm dung dịch nóng của 0,1g
vanilin (TT) trong 10 ml nước, để yên và cọ thành ống nghiệm bằng
một đũa thủy tinh, sẽ có tủa vàng, tủa này sau khi kết tinh lại bằng 5 ml
ethanol 70% và sấy khô ở 100 – 105
o
C, có điểm chảy từ 226 – 231
o
C.
C. Điểm chảy: 170 – 174
o
C (Phụ lục 6.7).
1.2.2.1. Định tính Ethambutol
Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:
Nhóm I: A và D.
Nhóm II: B, C, D.
7


A. Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng
ngoại của Ethambutol hydroclorid chuẩn hoặc phổ hồng ngoại đối
chiếu của Ethambutol hydroclorid chuẩn.
B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch
thử phải phù hợp với vết chính của dung dịch đối chiếu về vị trí, màu

sắc và kích thước.
C. Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 10ml nước, thêm 0,2ml dung dịch đồng
(II) sulfat 12,5 % (TT). Thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd 2M
(TT), dung dịch có màu xanh da trời.
D. Chế phẩm cho phản ứng định tính (A) của ion clorid (phụ lục 8.1)
Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol hydroclorid ở trên
là các phương pháp dùng các phản ứng hóa học và phương pháp sắc ký lớp
mỏng phải sử dụng nhiều dung môi, thuốc thử vừa tốn nhiều thời gian, vừa
độc hại. Ngoài ra phương pháp thường được sử dụng rộng rãi để định tính
là phương pháp phổ hồng ngoại. Phương pháp phổ hồng ngoại rất nhạy với
các chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí vì thế không thể đo
phổ hồng ngoại trong dung dịch nước. Mặt khác, khi đo phổ hồng ngoại
của một hoạt chất trong viên thì phải chuẩn bị mẫu rất phức tạp như hòa
tan, lọc, chiết, tách, bốc hơi đến khô, chứ không thể đo trực tiếp phổ hồng
ngoại trên nền tá dược. Phương pháp phổ Raman là một phương pháp phân
tích hiện đại và mới bắt đầu được triển khai để ứng dụng trong Dược và
phương pháp này đã khắc phục được hạn chế của các phương pháp trên và
có nhiều ưu điểm vượt trội.[5]
1.3. Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman
1.3.1. Lịch sử phát triển. [11], [18]
Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời
làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ,
8


“detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra
một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông,
hiệu ứng Raman. Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện
tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã
giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930. [11]

Theo thời gian, những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc
tán xạ Raman đã diễn ra. Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung vào sự
phát triển nguồn ánh sáng kích thích. Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau
đã được phát triển (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường
độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu. Nhiều năm sau đó, người ta nghiên
cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn
không mang lại hiệu quả như mong muốn. Cho tới tận năm 1962, đã có bước
ngoặt lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn
kích thích cho tán xạ Raman. Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó
chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar
+
(351,1-514,5nm), Kr
+
(337,4-674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào
sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác
động mạnh đến việc thu phổ Raman).[18]
Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển
tương đối chậm. Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang
học. Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự
phát hiện Raman. Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, không hội tụ, muốn ghi
được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một
thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu. Vậy nên,
mặc dù bản chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng
một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá
hủy mẫu chất.[18]

9

Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ
Raman. Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến
bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự
cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các
phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng
rãi hơn. Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ
Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay
đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát
tại thực địa các mẫu cần phân tích.[18]
1.3.2. Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman [11], [18]
Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ
ánh sáng, quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ. Tán xạ này xảy ra do
va chạm giữa các photon và các phân tử. Ánh sáng tới với tần số 
0
trên một
phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h
0
. Ví dụ
nguồn laser có bước sóng 500nm và công suất 1W chứa khoảng 2.5x10
18
photon trong một giây. Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng
như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử.
Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không
thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là
tán xạ Rayleigh. Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số
với ánh sáng tới.
Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử
và trao đổi năng lượng sau va chạm. Nếu phân tử nhận năng lượng h từ
photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h(
0

– ) , và tần số
của photon tán xạ khi đó là 
0
– . Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng
h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h(
0
+ )
và tần số của photon tán xạ là 
0
+ . Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng
10


của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman. Và các tán xạ
có tần số 
0
–  và có tần số 
0
+  được gọi tương ứng là “ tán xạ Stokes ” và
“ tán xạ đối Stokes ”. [18], [11]


Hình 1.1. Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu
Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu
hoặc phát xạ.
 Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên
tử.
 Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết
trong phân tử.
Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman ta khảo sát

sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử. Quá trình trao đổi năng lượng
11


có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của
dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo
sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của
các liên kết.
Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes. Tán xạ Stokes xảy ra khi
một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán
xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng
lượng kích thích. Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái
năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số. Vì vậy,
trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes.

Hình 1.2 .Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes.m, n, r: các mức năng lượng
Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi
tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift”. Đối với một chất,
cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo
nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức
thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau. Vì vậy, phân tích phổ
Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu
trúc của chất ấy.[18]
12


1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman
1.3.3.1. Nguyên tắc hoạt động [17],[18]
Mẫu phân tích sau khi được kích thích bởi bức xạ laser sẽ phát ra ánh sáng
tán xạ. Tán xạ Raman được thu lại cùng với các bức xạ khác qua hệ kính hiển

vi và đưa tất cả các bức xạ này cùng vào hệ quang. Hệ quang sẽ phân tách và
loại bỏ các bức xạ tạp, chọn lọc và đưa tín hiệu Raman vào dectector.
Detector ghi lại các tín hiệu Raman, sau đó thông qua bộ phận xử số liệu, các
tín hiệu quang được biến đổi thành tín hiệu điện tử và cho ta phổ Raman của
mẫu phân tích.
1.3.3.2. Nguyên tắc cấu tạo cơ bản [17]
Máy quang phổ Raman được phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản
xuất khác nhau. Nhưng về cơ bản nó bao gồm năm bộ phận sau: Nguồn laser,
bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detector, hệ quang. Hình 1.3 mô tả các bộ
phận cơ bản của máy quang phổ Raman.

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman

13


1.3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp Quang phổ Raman
1.3.4.1. Ưu điểm
 Các phương pháp phân tích thông thường thường hay đi đôi với việc
chuẩn bị mẫu như nghiền, hòa tan, lắc siêu âm, lọc, chiết, tách… đôi
khi rất mất công mà lại còn làm ảnh hưởng đến bản chất của chất phân
tích. Ví dụ như việc nghiền mẫu dẫn đến làm thay đổi một số trạng thái
rắn như trạng thái ngậm nước, dạng đa hình, và các liên kết hydro.
Phương pháp phân tích quang phổ Raman hầu như không yêu cầu việc
chuẩn bị mẫu, vì vậy mà tiết kiệm về thời gian, không cần sử dụng
thêm các dụng cụ bổ trợ khác, tiết kiệm công sức và tiết kiệm chi phí
[5],[11].
 Có thể đo phổ Raman trực tiếp xuyên qua các bao bì đựng, các chai lọ
thủy tinh, các vỏ bao film… mà không cần phải xâm lấn vào các cấu
tạo bên trong mẫu, không làm hỏng cấu tạo của thành phẩm, ảnh hưởng

đến mẫu đo và vì vậy mà không làm gián đoạn hoặc gây hao phí trong
quá trình sản xuất. Điều này rất thuận tiện trong việc theo dõi và kiểm
soát chất lượng sản phẩm trong các khâu của quá trình sản xuất dược
phẩm.[17]
 Phương pháp quang phổ Raman có thể phân tích được chỉ với một
lượng mẫu nhỏ. Điều này rất quan trọng trong việc đánh giá sự đồng
nhất của mẫu đo, phân tích để phát hiện các chất chỉ với một lượng mẫu
nhỏ. Ngoài ra, nó còn có ý nghĩa trong quá trình theo dõi các phản ứng
hóa học, bởi vì ở giai đoạn đầu của phản ứng thì sản phẩm tạo ra là rất
ít và khó để nhận biết được.[11]
 Phép phân tích vừa đơn giản, không phải chuẩn bị mẫu và vừa cho kết
quả nhanh. Điều này giúp tiết kiệm thời gian phân tích, do đó chúng ta
sẽ sớm có kết luận trong các phép phân tích định tính xác định mẫu đo;
14


còn trong sản xuất dược phẩm thì việc cho kết quả sớm giúp chúng có
những điều chỉnh kịp thời nhằm được những sản phẩm như ý
muốn.[18]
 Việc đo quang phổ Raman khá là dễ dàng, vì vậy mà việc đào tạo để sử
dụng được một thiết bị quang phổ Raman sẽ rất đơn giản, áp dụng được
cho nhiều loại đối tượng phổ thông khác nhau mà không nhất thiết phải
có kiến thức chuyên sâu. Việc sử dụng dễ dàng như vậy giúp cho máy
quang phổ Raman ngày càng được phổ cập hơn, phương pháp phân tích
phổ Raman được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác nhau hơn,
nhất là trong công tác Hải quan và Pháp y, những ngành cần phải cho
kết quả sàng lọc nhanh, độ tin cậy cao.
 Sự ra đời của thiết bị FT-Raman với độ lặp lại cao tạo điều kiện cho sự
phát triển các đầu thu có khẩu độ lớn, cho phép tia laser tập trung được
vào một lượng mẫu lớn hơn, tín hiệu Raman thu được nhiều hơn, và

chúng ta phân tích được một lượng mẫu lớn hơn khi cần thiết.[17]
 Nước hấp thu tán xạ Raman kém, vì vậy rất thuận tiện cho việc đo phổ
của các chất ở dạng dung dịch trong nước.
 Đầu dò sợi quang sử dụng công nghệ của cáp quang giúp kích thích và
thu tín hiệu Raman ở một khoảng cách xa, ở trong những điều kiện độc
hại, đo mẫu trong lòng của bao bì đựng lớn, điều kiện môi trường có
nhiệt độ cao…
Khi nói đến phổ dao động phân tử, quang phổ Raman và IR luôn có quan
hệ mật thiết với nhau, có tính chất bổ sung cho nhau trong trong các phép
phân tích xác định cấu trúc phân tử. So với phương pháp quang phổ IR thì
phương pháp phân tích phổ Raman có một số lợi thế hơn như sau:
15


 Đối với các hợp chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí, cho
vào ống thủy tinh nút kín rồi thu phổ Raman, trong phổ IR thì ống thủy
tinh cường độ bức xạ IR.[11]
 Đo phổ trong dung dịch nước thì Raman dễ hơn IR, vì nước có tán xạ
Raman rất yếu, trong khi nước cho phổ hồng ngoại mạnh.
 Các máy quang phổ Raman bộ phận kích thích thường trang bị cùng kính
hiển vi, giúp phân tích tập trung hơn nên chỉ cần một mẫu diện tích nhỏ là
có thể thu nhận được phổ, quang phổ hồng ngoại không có tính chất này.
 Nhờ bước sóng laser kích thích ngắn hơn là bước sóng trong vùng hồng
ngoại nên tia laser có khả năng đâm xuyên cao hơn, thu được tín hiệu từ
sâu bên trong mẫu hơn, bên cạnh đó, cũng do nước và thủy tinh không hấp
thu tán xạ Raman mà phương pháp quang phổ Raman có thể dùng để định
lượng chất rắn trong viên, chất lỏng trong dung dịch nước. Phổ IR không
có được điều này và nó chủ yếu là dùng để định tính.[18]
1.3.4.2. Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ
Tuy đã được phát triển từ rất lâu, có rất nhiều ưu điểm như vậy, nhưng chi

phí cho các thiết bị quang phổ Raman còn rất cao, nên nó rất khó để được sử
dụng rộng rãi như một phép phân tích thông thường. Những yếu tố quan trọng
nhất ảnh hưởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tượng huỳnh quang, sự
nóng lên của mẫu đo, sự hấp thu tán xạ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh
hưởng của độ phân cực.
Nếu nền mẫu đo cho huỳnh quang, tín hiệu của phép đo sẽ có những thành
phần huỳnh quang trong đó.
Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện khi bước sóng laser kích thích trùng lặp
với một dải cường độ của mẫu đo. Huỳnh quang thường phủ lên tín hiệu
Raman, nó như là một nền dốc khá phẳng, có thể gây ra một đường nền ảo với
độ nhiễu thấp và làm giảm tỉ lệ S/N của các tín hiệu Raman. Dải bước sóng và