Xây dựng phương pháp xác định ciprofloxacin và ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ

1


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN
TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



HÀ NỘI - 2015



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN
TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. DS.Lê Xuân Kỳ
2. DS.Nguyễn Thị Hạnh
Nơi thực hiện :
Viện công nghệ dược phẩm quốc gia
HÀ NỘI – 2015



LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn DS. Lê Xuân Kỳ, người đã tận tình
hướng dẫn và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Dương Thị Vân, DS. Nguyễn Thị Hạnh đã
nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em hoàn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người
đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện
đề tài và viết khóa luận
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa
phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà
Nội,Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề
tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động
viên em hoàn thành khóa luận.


Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

TRẦN THỊ LOAN


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 3
1.1. NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON 3
1.1.1. Vài nét về quinolon 3
1.1.2. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4
1.2. KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ 5
1.2.1. Sắc ký lỏng 5
1.2.2. Khối phổ
(Mass Spectrometry)
7
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13
2.2.1. Hóa chất 13
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 14
2.3. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.3.1. Nội dung nghiên cứu 14
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẰNG LC-MS/MS 19
3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khối 19
3.1.2.Khảo sát điều kiện LC 21
3.1.3. Quy trình phân tích 26
3.2.XỬ LÝ MẪU 28

3.3. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 29
3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống 29
3.3.2. Tính đặc hiệu của phương pháp 31
3.2.3. Độ tuyến tính 33
3.2.4.Giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD) 36
3.2.5. Độ đúng 38
3.2.6. Bàn luận 41

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 44




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ACN
BP 2010
C18
CIPRO
DAD
OFLO
IS
HPLC
LC - MS/MS


MeOH

MS
MW
ppm
ppb
LOD
LOQ
SPE
R(%)
SD
RSD

Tiếng Anh
Acetonitril
The Bristist Pharmacopoeia 2010
Octadecyl carbon chain

Diode array detector

Internal standard
High perform liquid chromatography
High perform liquid chromatography –
Tandem Mass Spectrometry

Methanol
Mass Spectrometry
Molecular Weight
Parts per million
Parts per billion
Limit of Detection
Limit of Quantitation

Dispersive Solid Phase Extraction
Recovery
Standard Deviation
Relative Standard Deviation
Tiếng Việt
Acetontril
Dược điển Anh 2010
Gốc octadecyl
Ciprofloxacin
Detector chuỗi diod
Ofloxacin
Chuẩn nội

Sắc ký lỏng hiệu nâng cao
Sắc ký lỏng ghép khối phổ
hai lần
Methanol
Khối phổ
Khối lượng phân tử
Một phần triệu
Một phần tỷ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Chiết pha rắn
Hiệu suất thu hồi
Độ lệch chuẩn
Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Đặc tính của các quinolon nghiên cứu………………………………….
Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất- thuốc thử - chất chuẩn 13
Bảng 3.1. Điều kiện phân mảnh của ciprofloxacin, ofloxacin và IS 20
Bảng 3.2. Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình pha động 22
Bảng 3.3.Điều kiện LC-MS 28
Bảng3.4. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích
của kháng sinh so với chuẩn nội 30
Bảng 3.5. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính 34
Bảng 3.6. Giá trị LOD và LOQ của phương pháp 37
Bảng 3.7.Kết quả khảo sát độđúng và độ lặp lại của phương pháp 39





DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức chung quinolon………………………………………………
Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2. Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 5
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS
7
Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba
10
Hình 3.1.Sơ đồ phổ khối của các chất phân tích 20
Hình 3.2. Kết quả sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu 24

Hình 3.3. Kết quả sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 26
Hình 3.4.Các sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 33
Hình 3.5.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (CIPRO/IS) và nồng độ
CIPRO (ng/ml) 35
Hình 3.6:.Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc tỉ số diện tích pic (OFLO/SI) và nồng độ
OFLO (ng/ml) 36
Hình 3.7.Sắc ký đồ xác định LOQ 38
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc sử dụng kháng sinh gia tăng tình trạng kháng kháng sinh đang là hậu quả
nghiêm trọng. Bên cạnh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát đang trở thành vấn đề thời sự
của ngành y tế, trong đó việc nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý thì
một lý do khác đang được quan tâm là sự tồn tại dư lượng kháng sinh và những chất
chuyển hoá của chúng trong môi trườngvì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải
ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp
chúng phát triển những gen kháng thuốc. Hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc
kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi
trường được bắt đầu từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế kỷ 20 và rất được quan
tâm tại các nước phát triển. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các
kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến.
Song song với việc nâng cao chấtlượng chăm sóc và khám chữa bệnh cho
nhân dân, lĩnh vực sản xuất thuốc được đặc biệt chú trọng. Hiện cả nước có khoảng
gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ
chủng loại:kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và
vitamin…Kháng sinh nhóm quinolon có phổ kháng khuẩn rộng trên trực khuẩn
Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh
nhiễm khuẩn tại nước ta. Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất
nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên nang, bột

pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh nhóm quinolon
trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Tới
thời điểm hiện nay, ở Việt Namnghiên cứu xác định dư lượng các kháng sinh trong
nước thải đang còn hạn chế chưa có nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh
quinolon trong nước thải của cơ sở sản xuất dược.
2

Vì vậy để góp phần kiểm soát nồng độ dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon,
chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định Ciprofloxacin và
Ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu:
1. Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS) để
xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng LC-MS/MS
2. Thẩm định phương pháp định lượng Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước
thải
3

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1. NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON

1.1.1. Vài nét về quinolon [10]
 Công thức cấu tạo chung của các quinolon:

Hình 1.1. Công thức chung quinolon
 Phân loại và phổ tác dụng
Có nhiều cách phân loại quinolon: phân loại dựa trên phổ và chỉ định lâm sàng,
phân loại dựa vào phân tử có hoặc không có fluor. Ngày nay, các quinolon được
phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:
- Thế hệ I: Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), đặc biệt vi khuẩn gây bệnh
đường tiết niệu Enterobacter. Không tác dụng trên Pseudonomas aeruginosa. Chỉ
định trong nhiễm khuẩn tiết niệu chưa biến chứng.

- Thế hệ II: Phổ rộng với Gram (-), kể cả P.aeruginosa.Tác dụng trên một số
Gram (+), bao gồm cả Staphylococcus pneumoniae, trừ Streptococcus
pneumoniae.Tác dụng trên một số vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma,
Chlamydia. Có nhiều chỉ định như nhiễm khuẩn tiết niệu có hoặc không có biến
chứng thận, sinh dục, tiền liệt tuyến, da và mô mềm).
- Thế hệ III: Phổ rộng với Gram (-), một số cả trên P.aeruginosa phổ mở rộng
trên Gram (+), cảS. pneumonae và các vi khuẩn đã kháng penicillin. Phổ mở rộng
trên vi khuẩn không điển hình.Viêm phổi mắc phải cộng đồng, viêm xoang cấp và
4

đợt cấp của viêm phế quản mạn Gatifloxacin được cấp phép dùng cho nhiễm trùng
tiết niệu và lậu.
- Thế hệ IV: Phổ rộng với Gram (-), cả P.aeruginosa. Mạnh với Gram (+),
đặc biệt S.pneumoniae. Phổ mở rộng với các vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn không
điển hình. Chủ yếu dùng với nhiễm khuẩn đường hô hấp, ngoài ra, còn dùng với
nhiễm khuẩn ổ bụng, vùng chậu.
 Cơ chế tác dụng
Các quinolon đều ức chế ADN gyrase, là enzym mở vòng xoắn ADN, giúp cho sự
sao chép và phiên mã, vì vậy ngăn cản sự tổng hợp ADN của vi khuẩn. Ngoài ra
còn tác dụng cả trên mARN nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Các quinolon
đều là thuốc diệt khuẩn.
1.1.2. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu [4], [5], [7]
Chúng tôi lựa chọn nghiên cứu một số kháng sinh quinolon, các chất này có
Bảng 1.1. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu

Ciprofloxacin.HCl
C
17
H
18

FN
3
O
3
.HCl
Ofloxacin
C
18
H
20
FN
3
O
4

MW 367,8 336.1
CTCT
.HCl


Tính
chất
Dạng base là bột kết tinh màu vàng
Nhạt, tan một phần trong H
2
O (1
g/25 ml), tan rất ít trong MeOH, rất
Tinh thể hình kim, không màu,
chảy ở khoảng 255
o

C, kém
phân hủy, ít tan trong nước và
5

khó tan trong ethanol
Dạng dùng phương pháp này là
muối khan pha trong hỗn hợp dung
môi MeOH : H
2
O (4:1)
ehanol.
Dược
động
hoc
Hấp thu nhanh và dễ dàng qua đường tiêu hóa, sinh khả dụng khoảng
70-95%, phân bố rộng khắp các mô và dịch cơ thể.Thải trừ chủ yếu
qua thận, thời gian bán thải từ 3h đến 10h và kéo dài hơn nếu bệnh
nhân suy thận

1.2.KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ
Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận
phát hiện là detector khối phổ.Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình
dưới đây:
Chân không





Hình 1.2 : Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS

1.2.1.Sắc ký lỏng [1]
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động làm
chất lỏng.Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch.Khi tiến
hành chạy sắc ký ,các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha
tĩnh.Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của
các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác
nhau.Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau
a.Pha tĩnh.
Sắc ký

lỏng

Ion hóa
Bộ phận
tích khối
Detector / Lưu
giữ số liệu
6

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ từ 3-7 m.Trong phần
tổng quan này chúng tôi đi sâu trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật
phổ biến nhất.Tùy theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân
bố được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
b.Pha động
Trong HPLC, pha động l
à các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc
dung dịch đệm được hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù
hợp.

Yêu cầu:

-
Độ tinh khiết cao

-
Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh

- Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm,lọc).


Pha động thành hai loại:
-

Pha động có độ phân cực cao: Có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để
phân tích các chất hữu cơ cần thêm các dung môi khác để làm giảm độ phân cực
như MeOH, ACN…
-

Pha động có độ phân cực thấp bao gồm các dung môi ít phân cực như
cyclopentan,n-pentan, n-hexan, CCl
4…



Có 2 cách dùng pha động để rửa giải:
- Đẳng dòng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình chạy
sắc ký.
- Gradient: Tỷ lệ hỗn hợp dung môi thay đổi trong quá trình chạy sắc ký. Chế độ
gradient này phù hợp với mẫu phân tích chứa nhiều thành phần với khả năng

phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ phân giải.
Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn
góp phần vào khả năng ion hóa của chất.
7

1.2.2.Khối phổ
(Mass Spectrometry) [1]
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry- MS) là phương pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên
sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc
từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn
đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác
định được khối lượng của ion đó được.

Chân không cao










Hình 1.3: Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS
1.2.2.1.Nguyên tắc
Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một
ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu
ESI, APCI hoặc APPI. Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion

để đưa vào bộ phân tích khối. Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ
có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm nhờ
tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng
tại bộ phận phát hiện ion. Từ đóxác định các chất.
Nguồn ion
Phân tích
khối
Detector
Phổ khối
Xử lý và
lưu giữ
liệu
Tránh ion phân tích va chạm
với ion trong không khí
8

1.2.2.2.Cấu tạo
a.Nguồn ion
Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn
phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích
bằng các phần tử mang năng lượng cao.Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị
hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo
thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ).
Việc tăng tốc được thực hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng
ion hóa các ion phân tử có tốc độ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được
thực hiện bởi một điện trường phụ để khi vào phần phân tích khối (mass analyzer)
là một dòng ion tập trung, đồng nhất. Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử
dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (Electrospray
ionization-ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure
chemicalionization-APCI).Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion

hóa phun điện tử (ESI).
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền
nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion
đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ
thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học
như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như
polythylenglycol.
Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và
sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích
điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung
môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng.
Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để
từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn
sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất
9

nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển
thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong
kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung
dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của
chất điện ly và pH của dung dịch.
Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm


Loại hình thành ion dương :


Phù hợp nhất cho chất phân tích có tính base


Thường hình thành nên ion [M+H]
+



Cũng có thể hình thành ion [M+nH]
n+
[M+ Na]
+



Loại hình thành ion âm :


Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại thuốc có tính acid


[M-H]
-
[M-nH]
n-

b.Bộ phận phân tích khối(Mass analyzer):
Các ion hình thành ở nguồn ion hoá có khối lượng m và điện tích z (tỷ số
m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối
được coi là quả tim của máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z
khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường
trước khi đến đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.
Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phận phân tích

tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phận phân tích thời gian bay.Bộ phân tích
khối ba tứ cực được sủ dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây cũng là
kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống
để các ion bay qua.Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dông một
chiều (DC) và điện thế tần số (RF).Các tứ cực được đóng vai trò như bộ lọc
khối.Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao
động phụ thuộc vào tỉ số m/z và trường RF.Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp
mới có thể đi qua được bộ lọc này.
10

Bộ phân tích khối ba tứ cực gồm ba tứ cực được ghép nối với nhau
Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z
nhất định từ nguồn ion chuyển đến dể chuyển đến Q2.Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp
suất cao các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N
2
, Ar,
He.Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ
hơn(ion con).Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion
do Q1 chuyển đến.Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3.Bộ tứ
cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận
phát hiện.



Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba

c. Bộ phận phát hiện
(detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối
củathiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối
phổ tạo ra một tínhiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được
khuếch đại hoặc tạo ra một dông do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát
hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (
electron multiplier
) và bộ phận
phát hiện nhân quang (
photomultiplier
). Bộ phận phát hiện nhân electron là một
trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề mặt dinot
làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp
theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộ
phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu
11

đập vào một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các
electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon.
Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị
nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt
trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.
1.2.2.3.Một số kỹ thuật ghi phổ

 Quét toàn phổ (Full Scan)
Khi thao tác với chếđộ scan, MS sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổđồ
toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận
danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với MS tứ cực chập
ba, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan
MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con
cho tín hiệu ổn định và bền nhất.

 Selected Ion Monitoring (SIM)
Trong chếđộ SIM, MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất
cần xác định. Phổđồ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đãđược lựa chọn trước đó, do
vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với MS
tứ cực chập ba, chếđộ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân
mảnh khi đã biết ion mẹ.
 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với MS tứ cực chập ba, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2
kỹ thuật ghi phổ MS/MS có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lậpđó, trong các mảnh
ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng
nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM
thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất,
phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các
12

ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu
dò để phát hiện.
1.2.2.4.Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường có lẫn nhiều thành phần phức tạp, hàm
lượng chất cần phân tích rất thấp. Để làm giàu mẫu trong nghiên cứu này chúng tôi
đã sư dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách chiết mẫu.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
- Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được
với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho
vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
- Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc
hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp

phụ. Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy
cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp.
- Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương
đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có
điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu.
- Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu
qua cột khoảng 3ml/phút.
- Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi
cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.
- Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra
khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh. Tốc độ này phụ
thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc
độ khoảng 1ml/phút

13

CHƯƠNG2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh nhóm
Ciprofloxacin, Ofloxacin không sản xuất các kháng sinh này ít nhất 7 ngày, kiểm
tra bằng LC-MS/MS không phát hiện có Ciprofloxacin, Ofloxacin.
- Các chất phân tích: Ciprofloxacin, Ofloxacin
2.2.HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1.Hóa chất
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất- thuốc thử - chất chuẩn
Tên chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn Hàm
lượng
Hóa chất,
thuốc thử
Acetonitril Merck (Đức) Dùng cho HPLC

Methanol Merck (Đức) Dùng cho HPLC
Acid hydroclorid
đặc
Trung Quốc 36,36%

Na
2
EDTA Merck (Đức)
Nước cất Siêu tinh khiết
Acid formic Merck (Đức) Dùng cho HPLC



Chất chuẩn
Ciproloxacin 13C3
(IS)
USA( Mĩ) 99,99%

Ciprofloxacin
hydroclorid
Viện kiểm
nghiệm TW
SKS: 0212029.02 93,47%

Ofloxacin Viện kiểm
nghiệm TW
SKS: 010087.02 99,99%


14

2.2.2.Thiết bị, dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS
(Mỹ)
- Cột Agilent SB C18 (1,8 µm; 2,1×50 mm) (Mỹ)
- Bộ chiết pha rắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, Oasis(Mỹ)
- Thiết bị siêu aamUltrasonic Cleaner Set, Wisd(Hàn Quốc)
- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)
- Máy lọc hút chân không
- Màng lọc 0,45µm Cellulose acetat, Sartorius (Đức)
- Cân phân tích AB204 (chính xác đến 0,1 mg)
- Cân Mettler Toledo (chính xác đến 0,01 mg)
- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N
2
Pierceb Reacti- Therm/ # 18822, Mỹ
- Máy lọc nước siêu tinh khiết
- Tủ lạnh
- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích: bình định mức chính xác 10 ml, pipet
chính xác và các dụng cụ thủy tinh.
2.3. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu bao gồm :
 Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng
Ciprofloxacin, Ofloxacin trong nước bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC-
MS/MS).
 Thẩm định phương pháp :
 Độ thích hợp hệ thống.
 Độ đặc hiệu của phương pháp.
 Khoảng tuyến tính.
 Độ đúng.

 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện.
15

2.3.2.Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1.Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy không sản
xuất,lọc, điều chỉnh đến pH thích hợp
Bảo quản mẫu saukhi lấy ở 2 – 8
0
C và tiến hành phân tích trong 24h về độ dặc hiệu
và độ đúng chứng minh nước thải không có kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin.
2.3.2.2.Xây dựng các điều kiện sắc ký
Tiến hành chạy thử trên từng kháng sinh CIPRO, OFLO, IS và hỗn hợp kháng
sinh với IS trong dung môi pha động.
 Khảo sát điều kiện khối phổ
Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion
con, lựa chọn ion con để định lượng.
 Khảo sát điều kiện sắc ký :
- Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài,đáp
ứng của chuẩn nội tốt. Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là
Ciprofloxacin 13C3.
- Cột sắc ký Agilent SB C18 (1,8 µm; 2,1×50 mm)
- Chương trình pha động: Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên
pha động ACN (0,1% HCOOH) : H
2
O (0,1% HCOOH) với tỉ lệ tt/tt khác nhau và
chạy chế độ gradient.
- Tốc độ dòng: Thay đổi lưu lượng pha động từ 0,1- 0,3 ml/phút để xác định
được tốc độ phù hợp cho thời gian tối ưu.
- Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi lưu lượng mẫu từ 1- 5 µl để xác định được thể tích

tiêm phù hợp cho sắc ký đồ đẹp, diện tích pic và độ đáp ứng cao.
16


2.3.2.3.Đánh giá phương pháp [11], [14]
 Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trong cùng điều kiện một dung dịch chứa chất
chuẩn kháng sinh và chất chuẩn nội. Đánh giá độ phù hợp của hệ thống thông qua
các chỉ số sau đây:
 Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic của chất chuẩn nội và kháng
sinh (nhỏ hơn 2%).
 Giá trị RSD của tỉ số diện tích pic của kháng sinh/chuẩn nội (nhỏ hơn 2%).
 Tính đặc hiệu
Độ đặc hiệu của được đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu
trắng và mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm kháng sinh nghiên cứu). Tiến hành như sau:
 Dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độđã biết.
 Mẫu trắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo qui trình đã xây dựng.
 Mẫu tự tạo là mẫu trắng có thêm một lượng chính xác các kháng sinh có
nồng độ đã biết và chất chuẩn nội.
Tiến hành xử lý và sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo theo
các điều kiện đã chọn. Trên sắc kí đồ của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời
gian lưu của kháng sinh phải không xuất hiện các píc có các mảnh khối phổ tương
ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn và chuẩn nội. Nếu có đáp ứng
phải nhỏ hơn 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính.
 Độ tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có
sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích
Cách xác định khoảng tuyến tính:
 Từ dung dịch chuẩn gốc của các chất kháng sinh nghiên cứu tiến hành pha
một dãy ít nhất 5 dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ đã xác định trong khoảng

tuyến tính cần khảo sát. Nồng độ chuẩn nội trong mỗi dung dịch chuẩn được giữ
hằng định
17

 Tiến hành sắc kí theo các điều kiện đã chọn.
 Xây dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích pic kháng sinh
chuẩn nội (S
KS
/S
i
) (trục tung Oy) và nồng độ kháng sinh (trục hoành Oz).
 Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax + b và hệ số tương
quan r từ đó kết luận về độ tuyến tính của phương pháp.
 Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích có trong mẫu thử mà ta có
thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần
đáp ứng của mẫu trắng.
Tiến hành xử lý mẫu chuẩn ciprofloxacin và ofloxacin có nồng độ thấp dần và
tiến hành phân tích.
 Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu
có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3
lần so với đáp ứng của tín hiệu của mẫu trắng (S/N =3)
LOD được tính theo giá trị LOQ theo công thức:
 =

3.3

 Độ đúng
Độ đúng là khái niệm chỉ mức độ giữa giá trị trung bình của kết quả thí
nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng μ.

Độ đúng của phương pháp được tiến hành trên mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm một
lượng chính xác kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết). Lựa chọn 3 nồng
độ chất chuẩn thêm vào để khảo sát là nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình
(MQC) và nồng độ cao (HQC). Tiến hành xử lý sắc kí theo các điều kiện đã chọn.