Ứng dụng phương pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật Elisa (Enzyme-link imunosorrbent assy)

ứng dụng phơng pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol
trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật Elisa (enzyme Link
imunosorrbent assay)

Th Khang, Phan Thanh m, Dng Th Thu Anh, o c Ho.
Phũng Phõn tớch Thc n v sn phm chn nuụi

1. Đặt vấn đề
Clenbuterol v salbutamol l nhng cht thuc nhúm Agonits cú tỏc dng
lm gión ph qun. õy l mt dc phm s dng ủ ủiu tr hen suyn trờn
ngi, cỏc trng hp viờm phi d ng trờn nga v viờm ủng hụ hp trờn bũ.
Ngi ta khỏm phỏ rng khi dựng liu cao cỏc cht Agonits theo ủng ming,
thuc cú th to ra mt s gia tng nhanh chúng v rừ rt s tng khi c ủng thi
lm gim khi lng m. Cỏc nh chn nuụi ủó phỏt hin ra tỏc dng k diu ny
ca Clenbuterol v Salbutamol nờn ủó b sung vo trong thc n gia sỳc, gia cm
nhm to ra nhng con vt cú quy tht nc hn v tng trng nhanh hn nhm thu
li nhun cao (Eshaq v cng s, 2003). Tuy nhiờn, ngi ta ủó phỏt hin ra s tn
d ca Clenbuterol v Salbutamol trong tht v ph tng, ủc bit l gan ca nhng
con vt ủc nuụi bng thc n cú cha cỏc cht ny v ủó gõy nh hng ủn sc
kho ngi tiờu th (Yu v cng s., 2004). Hin nay M, Canaủa, v cỏc nc
trong liờn minh chõu u ủó cm s dng cỏc cht thuc nhúm beta Agonits. Vit
Nam, B Nụng nghip v PTNT cng ủó ra quyt ủnh s 54/2002/Q-BNN ngy
20 thỏng 06 nm 2002, cm s dng cỏc cht thuc nhúm Agonist trong thc n
chn nuụi. Tuy nhiờn vic s dng bt hp phỏp cỏc cht cm nh Clenbuterol v
Salbutamol vn cú trờn th trng thc n chn nuụi nc ta. Trờn th gii ủó cú

nhiu phng phỏp phõn tớch hin ủi, chớnh xỏc ủ xỏc ủnh Clenbuterol v
Salbutamol trong thc n chn nuụi bng sc ký khớ khi ph (Hasnoot v cng s ,
1994 ; He v cng s ., 2005) nhng vi chi phớ rt cao. Ngoi ra, phng phỏp
ELISA cng ủó ủc s dng rng rói ủ xỏc ủnh cỏc cht d lng thuc tr sõu,
ủc t nm mc (Skerritt,1998). Vit Nam, vic kim tra cỏc cht cm trong
thc n chn nuụi gp rt nhiu khú khn do cha ủc trang b thit b hin ủi ủ






th xỏc ủnh chớnh xỏc cỏc cht ny trong thc n chn nuụi v cha cú mt bỏo
cỏo no v phng phỏp phõn tớch Clenbuterol v Salbutamol trong thc n chn
nuụi. Nội dung của đề tài là ứng dụng quy trình phân tích của nhà sản xuất bộ kít
chuẩn Clenbuterol và Salbutamol của hãng BIOO SCIENTIFIC - M bằng phơng
pháp ELISA để xác định sự có mặt của các chất Clenbuterol và Salbutamol trong
thức ăn chăn nuôi. Phơng pháp của nhà sản xuất đa ra là định lợng các chất
Clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi. Tuy vậy độ chính xác của kết
quả phân tích còn phu thuộc vào kỹ năng và thiết bị thí nghiệm và thành phần của
mẫu thí nghiệm. Mc ủớch ca nghiờn cu ny l ủỏnh giỏ ủ n ủnh v ủ chớnh
xỏc ca phng phỏp phõn tớch ELISA ủ xỏc ủnh cỏc cht Clenbuterol v
Salbutamol trong thc n chn nuụi.
2. Vật liệu và phơng pháp thực hiện
2
. V t liu nghiờn cu
i tng nghiờn cu:
- Mu thc n chn nuụi, nhng sn phm ủ b sung vo trong thc n
chn nuụi.
- Hoỏ cht :

+ S dng 2 loi b kit chun Salbutamol v Clenbuterol ca hóng BIOO
SCIENTIFIC - M . Trong mi b kit chun ny cú mt khay ủng 96 ging ủó
ph cht ủc bit (khỏng nguyờn) v cht chun Salbutamol hoc Clenbuterol ủó
ủc pha sn theo cỏc nng ủ khỏc nhau v cỏc hoỏ cht ủ thc hin xột nghim
ELISA.
+ Cỏc hoỏ cht ủ x lý mu ban ủu trc khi tin hnh xột nghim trờn
ELISA nh acetonitrile, ethyl acetate, n-hexan l nhng hoỏ cht tinh khit ca
MERCK(c). Nc ct dựng ủ pha loóng l nc ct 2 ln.
a ủim
Phũng phõn tớch thc n v sn phm chn nuụi - Vin Chn Nuụi.
Thi gian
T thỏng 4 ủn thỏng 9 nm 2006.
2.2. Phng phỏp thc hin
Cỏch b trớ thớ nghim






- X©y dùng ®−êng chuÈn cña Clenbuterol vµ Salbutamol dùa trªn 6 loại
nồng ñộ chất chuẩn (Salbutam dmol hoặc Clenbuterol) khác nhau: 0 ppb; 0.05ppb;
0.15ppb; 0.5ppb; 1.5ppb; 4.5ppb. Đường chuẩn của mỗi chất ñược xây xựng dựa
trên 5 nồng ñộ chuẩn trên và % hấp thụ tối ña của mẫu tương ứng với 6 nồng ñộ
trên
- Chất chuẩn Clenbuterol và Salbutamol ñược thêm vào mẫu trắng ở các
nồng ñộ khác nhau : 1ppb; 2ppb; 3ppb; 4ppb. Mỗi mức nồng ñộ thêm vào mẫu
trắng ñược lặp lại 10 lần.
- So sánh kết quả phân tích của 3 mẫu thức ăn chăn nuôi ñược phân tích
bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ(GC-MS) tại phòng thí nghiệm - Bộ Nông

nghiệp của Malaysia và phương pháp ELISA tại phòng phân tích Viện Chăn Nuôi.
Nguyên lý c
a ph ng pháp
Dùa trªn nguyªn lý cña ph¶n øng kh¸ng thÓ – kh¸ng nguyªn. Kháng nguyên
ñược cố ñịnh trên bề mặt của giếng phân tích. Kháng nguyên tự do (chất cần phân
tích) và một lượng kháng thể cố ñịnh ñược cho vào. Kháng nguyên tự do(chất cần
phân tích) và kháng nguyên cố ñịnh sẽ cạnh tranh ñể bám vào kháng thể. Lượng
kháng nguyên tự do càng nhiều thì lượng kháng thể bị kháng nguyên cố ñịnh giữ
lại càng ít. Sau khi rửa trôi các chất còn dư, dùng một kháng thể thứ 2 có ñánh dấu
enzym ñể phát hiện lượng kháng thể ban ñầu bị giữ lại. Bằng phản ứng tạo màu và
phép ño cường ñộ mầu tại bước sóng 450nm và cường ñộ màu này tỷ lệ nghịch với
nồng ñộ chất cần phân tích. Từ ñó suy ra lượng kháng nguyên tự do (chất cần phân
tích) là bao nhiêu.
Quy trình th
c hi n
X
lý mẫu







Thêm 8 ml Acetonitrile và 1ml
Ethyl acetate. Làm ñồng ñều hỗn
hợp trong 3 phút.

Ly tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 6 ml
dung dich lớp trên vào ống nghiệm mới

Thêm 1 ml n-
hexan và 1ml 1x PBS.
Làm ñồng ñều hỗn hợp trong 1 phút


Ly tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 50 µl phần dung dịch lớp
dưới ñem phân tích trên ELISA ở bước sóng 450 nm.

Trộn ñều mẫu, nghiền qua mắt sàng
1mm Cân khoảng 1.g mẫu.

3

















(ppb
)

2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập ñược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học, phân
tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm Minitab version 14.0 for Window 2000,
sử dụng mô hình thống kê tuyến tính tổng quát (GLM)
. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn
Mỗi bộ kit chuẩn của từng chất Clenbuterol hoặc Salbutamol có 96 giếng
ñược phủ sẵn kháng nguyên và các hoá chất cần thiết ñể thực hiện xét nghiệm
ELISA. Nếu một số lượng mẫu lớn (khoảng 40 mẫu) có thể thực hiện trong thời
gian ngắn (4h) như vậy số lượng mẫu phân tích nhiều sẽ giảm chi phí phân tích và
tiết kiệm thời gian.
B¶ng 1.
ết qu thu h i c a các ch t chuẩn ñược thêm vào mẫu tr ng

n
Kết quả thu ñược
(ppb)
% thu hồi của
chuẩn

R.S.D (%)
Nồng ñộ Clenbuterl

(ppb)
m SE m SE
1 10 0.724 0.015 72.40 1.5 6.35
2 10 1.459 0.029 72.95 1.45 6.30
3 10 2.29 0.024
76.33

0.8 3.33
4 10 2.969 0.014
74.23
1.70 7.83

Qua kết quả bảng 1 trên ta thấy hiệu suất thu hồi của chất Clenbuterol ở các
mức thêm vào mẫu trắng từ 1- 4 ppb ñã ñạt kết quả từ 72.40% ñến 76.33 % và ñộ
lệch chuẩn (R.S.D) nhỏ hơn 10%. Như vậy, các kết quả hoàn toàn trong khoảng
cho phép chấp nhận ñược.
B¶ng 2
. ết quả thu h i của ch t chuẩn ñược thêm vào mẫu tr ng
Nồng ñộ
Salbutamol

n
Kết quả thu ñược
(ppb)
% thu hồi của
chuẩn
R.S.D
(%)
(ppb)

(ppb)

(ppb) m SE m SE
1 10 0.71 0.011 70.80 1.15 5.15
2 10 1.40 0.044
70.05
2.18 9.85
3 10 2.39 0.072 79.67 2.46 9.55
4 10 3.22 0.056
80.50
1.38 5.44

Qua kt qu bng 2 trờn, ta thy hiu sut thu hi ca cht Salbutamol
cỏc mc thờm vo mu trng t 1- 4 ppb ủt t 70.05% ủn 80.50 % v ủ lch
chun (R.S.D) nh hn 10%. Nh vy, cỏc kt qu ủ ủỏnh giỏ ủ n ủnh ca
phng phỏp hon ton trong khong cho phộp ca phõn tớch.
Bảng 3.
sỏnh kt qu phõn tớch gi a phng phỏp v .

Tờn mu

n
Kt qu phõn tớch ti
Vin Chn Nuụi (ppb)(ELISA)
Kt qu phõn tớch ti
Malaysia (ppb)(GC-MS)
Clenbuterol Salbutamol Clenbuterol Salbutamol
m SEM m SEM m SEM m SEM
Mu s 1 7 0.00 0.00 0.00 0.00
Mu s 2 7 3.074 0.042 5.978 0.059
Mu s 3 7 4.004 0.049 6.524 0.064

Qua kt qu bng 3.2 ta thy mu õm tớnh (khụng cú cht Clenbuterol v
Salbutamol) thỡ kt qu gia 2 phng phỏp phõn tớch thng nht nh nhau. Nhng
2 mu dng tớnh (Cú cht Clenbuterol hoc Salbutamol) thỡ kt qu gia 2
phng phỏp hon ton khỏc nhau. Giỏ tr chờnh lch trung bỡnh gia kt qu ca
phng phỏp GC-MS v ELISA ủi vi Clenbuterol l 2.904 ppb v ủi vi
salbutamlol l 2.52ppb vi p <0.001.Mt khỏc phng phỏp phõn tớch GC- MS
ủc phõn tớch trung tõm phõn tớch xột nghim - Malaysia trờn thit b phõn tớch
hin ủi, chớnh xỏc cú ủ tin cy cao. Nh vy so sỏnh vi kt qu phõn tớch trờn
GC-MS thỡ cỏc kt qu phõn tớch trờn ELISA ủi vi mu dng tớnh khụng cú giỏ
tr ủnh lng chớnh xỏc cht cn phõn tớch
. Kết luận và đề nghị
4.1. Kt lu n






- Phương pháp ELISA ñã xác ñịnh ñược các chất Clenbuterol và
Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và hoàn toàn phù hợp là phương pháp phân
tích thường xuyên trong phòng thí nghiệm về phân tích thức ăn chăn nuôi có ñộ ổn
ñịnh và ñộ chính xác chấp nhận ñược với hiệu suất thu hồi > 65% và ñộ lệch chuẩn
RSD < 10%
- Phân tích bằng phương pháp ELISA phù hợp ñể sàng lọc với số lượng
mẫu lớn, tiết kiệm thời gian chi phí phân tích.
- Các kết quả phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn
nuôi bằng phương pháp ELISA ñược trả lời kết quả chính xác ở dạng ñịnh tính có
nghĩa là có hay không Clenbuterol và Salbutamol.

.2. Đề nghị
Tiếp tục ñược nghiên cứu phân tích các chất cấm khác trong thức ăn chăn
nuôi như nitrofuran, chloramphenicol, cimaterol….bằng phương pháp ELISA.
Tµi liÖu tham kh¶o
1.
Eshaq et al., 2003 Eshq,S.C. Chai,S. Jamokha, G.Aznar and M.K. Hoffman,
Determinationof ractopamin in animal tissue by liquid chromatography- fluorescence and
liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Anal.Chim. Acta 483 (2003), pp. 137-145.
2.
Hassnoot et al .,1994 W.Hassnoot, P.Stouten and A.M.Lommen, Determination of
fenoterol and ractopamin in urine by enzyme immunoassay, Analyst 119 (1994), pp. 2675-
2680.
3.
He et al., 2005 L.M.He, Y.J.Su and H.J.Zhang, Detection of clenbuterol in animal tissues
and feeds by cappilary gas chromatography- mass spectrometry, J.Chin.Mass Spectrom.Sos.26
(2005), pp. 168-172.
4.
Yu et al., 2004 H.X. Yu and S.M. Yang, Advance in detremination of ractopamin residues
in animal tissues end excrements, Chin.J.Vet.Drug 38 (2004), pp. 44- 47.
5.
Limin et al., Yijuan Su, Zhenling Zeng, Yahong Liu and Xianhui Huang, Determination of
ractopamin and clenbuterol in feeds by gas chromatography – mass spectrometry, J. Animal
Feed Science and Technology 3 (2007), pp.316-323.
Skeritt., 1998. Approate 3nalytical Technologies for Monitoring Agrochemical Residues.In
Seeking Agricultural Produce Fee of Pesticide Residues. Internatioanal Workshop held in
Yogyakarta, Indonesia, 17- 19 February 1998. ACIAR Proceeding No.85. ISBN 1 86320 2277,
Canberra Australia.