Nghiên cứu chiết xuất piperin từ hồ tiêu

Bộ YTÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LẠI THỊ NHUNG
NGHIÊN CỨU CHỊẾT XUẤT
PIPERIN TỪ HỒ TIÊU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sl
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện:
Bộ môn công nghiệp dược
T R r '0 : v f ĩ D i ỉ
m:(jr ¿lẴ'

T H I.';
^93y

tháng

năm 2i
Số ĐKCB: '

.
HÀ NỘI-2011
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận này, tôi đã nhận được sự
hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè.
Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết on sâu sắc tới :
TS.Nguyễn Văn Hân
Người thầy đã dành cho tôi sự giúp đỡ quý báu. Tôi cũng xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, anh chị
kỹ thuật viên ở Bộ môn Công nghiệp dược, các thầy cô trong Ban giám hiệu,

Phòng đào tào cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ trong trường đại học Dược
Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm on gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá
trình học tập và thực hiện khóa luận này
Hà Nội, tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Lại Thị Nhung
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, sơ Đồ
ĐẶT VấN Đ ề 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về piperin
2
1.1.1. Cấu tạo hóa học, tính chất piperin 2
1.1.2 Tác dụng sinh học của piperin 3
1.2. Tổng quan về hồ tiêu 4
1.2.1. Đăc điểm thực vật 4
1.2.2. Phân bố, trồng hái và chế biến 4
1.2.3. Thành phần hóc học 5
1.2.4.Tác dụng, công dụng 6
1.3. Một số nghiên cứu chiết xuất pipein từ hồ tiêu 6
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

8
2.1 Nguyên liệu và thiết bị
8
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 8
2.1.2. Máy móc, thiết bị 8
2.2. Nội dung nghiên cứu 9

2.2.1. Xác định hàm lượng piperin trong hat hồ tiêu đen, vỏ hồ tiêu đen, hồ
tiêu sọ 9
2.2.2. Lựa chọn dung môi 9
2.2.3. Kích thước tiểu phân dược liệu 9
2.2.4. Các phương pháp tinh chế 10
2.3. Phương pháp thí nghiệm 10
2.3.1 Phương pháp chiết xuất 10
MỤC LỤC
2.3.2. Phương pháp định lượng piperin

10
2.3.3. Công thức tính toán 11
2.3.4. Các phương pháp tinh chế

12
2.3.6. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 12
CHƯƠNG 3 : THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

13
3.1. Sự phân bố piperin trong quả hồ tiêu 13
3.2. Chọn dung môi chiết 14
3.3. Ảnh hưởng hưởng kích thước tiểu phân dược liệu

15
3.4 Tinh chế piperin

17
3.4.1 Phương pháp 1
17
3.4.2 Phương pháp 2 19

3.4.3 PhưoTig pháp 3 21
3.4.4 Phương pháp 4 24
3.4.5 Kết quả và nhận xét 25
3.6. Kiểm tra sản phẩm 26
3.6.1 Tính chất 26
3.6.2 Các dữ liệu phổ 26
KÉT LUẬN VÀ KIỂN NGHỊ 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Bảng 1 : Sự phân bố piperin giữa vỏ, hạt của hồ tiêu và hồ tiêu sọ 13
Bảng 2 : Hiệu suất piperin chiết được của các dược liệu kích thước khác
nhau 16
Bảng 3 : Hiệu suất piperin thu được theo các phương pháp tinh chế. 25
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẺ, sơ Đồ
Hình 1: Hình ảnh hồ tiêu đen và hồ tiêu trắng 5
Hình 2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng của các dung dịch chiết 14
Hình 3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của độ mịn tới hiệu suất chiết 16
Hình 4 : Sơ đồ các bước tinh chế piperin theo phương pháp chung 18
Hình 5: Sơ đồ các bước tinh chế bằng acid acetic 20
Hình 6; Sơ đồ các bước tinh chế dùng n-hexan để kết tủa piperin 22
Hình 7: Sơ đồ các bước tinh chế dùng ethanol 96% có thêm 10% NaOH để
tủa piperin 24
Hình 8: Hình ảnh piperin thô và tinh khiết 26
Hình 9: sắc ký đồ của piperin Phụ lục 1
Hình 10: Phổ IR của piperin Phụ lục 2
Hình 11: Phổ cộng hưởng tìr hạt nhân proton 'H-NMR của piperin Phụ lục 3
Hình 12: Phổ khối lượng (MS) của piperin Phụ lục 4
ĐẶT VẤN ĐỀ
•

Piperin là một alcaloid có nhân piperidin trong các cây thuộc họ hồ tiêu. Hàm
lượng piperin có ở một số cây như; khoảng 6% đến 9% trong pỉperi nigrum
(hồ tiêu), 4% trong pỉper longum (tiêu lá tím) và 4,5 % trong piper
retroỷractum.
Piperin ngày càng được dùng nhiều trong ngành dược, do piperin làm tăng
khả năng hấp thu của nhiều thuốc do đó tăng sinh khả dụng của thuốc. Piperin
còn có tác dụng chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư
Việt Nam đang được đánh giá là nhà cung ứng hạt tiêu lý tưởng nhất với giá
cả và chấtt lượng hết sức cạnh tranh. Hạt tiêu Việt Nam có mặt ở gần 80 nước
và vùng lãnh thổ, chiếm 50% sản lượng xuất khẩu toàn cầu hạt, tiêu Việt Nam
đã khẳng định vị trí sổ 1 thế giới. Việt Nam hoàn toàn có thể chủ động trong
nguồn nguyên liệu sản xuất piperin. Nhằm góp phần nghiên cứu quy trình
chiết xuất piperin từ hồ tiêu, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu chiết
xuất piperin từ hồ tiêu” với những mục tiêu sau :
1. Khảo sát lựa chọn dung môi và một số thông số quy trình chiết
xuất.
2. Xây dựng phương pháp đơn giản, hiệu quả để tinh chế piperin.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về piperỉn :
1.1.1 Công thức hóa học, tính chất của piperin:
Công thức cấu tạo:
Tên khoa học:
(2E, 4E)-5-(1,3-benzodioxol-5y 1)-1 -piperidin-1 -yl penta-2,4-dien-1 -one
Tên khác: 1-piperoylpiperidin
Công thức phân tử: C17H19NO3
Khối lượng phân tử: 285.34 g/mol.
Tỉnh chất: Piperin là một chất kết tinh hình kim, màu vàng nhạt, không mùi,
vị rất cay (pha loãng 1/200 000 vị còn cay). Piperin hầu như không tan trong
nước (40mg/l ở 18“C), tan trong ethanol tuyệt đối (1 gam piperin tan trong
15ml alcohol), tan tốt trong methanol, 1 gam piperin tan trong l,7ml

chloroform, 36 ml ether, tan trong benzen và acid acetic băng. Piperin có tính
base yếu pKa= 12,22 ở 18“c.
Nhiệt độ nóng chảy: 130 °c.
Dung dịch piperin trong Ethanol 96° có cực đại hấp thụ 342-345 nm [5], [15],
[18].
1.1.2 Tác dụng sinh học của pỉperỉn.
Piperin lần đầu tiên được biết đến vào thể kỷ 19, piperin đã được biết
đến trong một khoảng thời gian dài. Piperin đã đang được nghiên cứu tìm ra
nhiều tác dụng;
Piperin kích thích hoạt động của trypsin và chymitĩypsin, làm tăng tiết
acid mật, tăng hoạt động của lipase tụy, piperin có tác dụng kích thích tiêu
hóa.
Piperin ức chế khối lượng dịch vị, độ acid dạ dày và pepsin. Do đó,
piperin có tác dụng bảo vệ chống lại các viêm loét dạ dày.
Piperin có tác dụng chống co thắt do chặn kênh canxi [17
Piperin được biết đến là một chất điều trị một số bệnh ung thư . Do
Piperin ức chế các cytokin chuyên được sản xuất khối u và ức chế các tín hiệu
hoặc thông tin liên lạc giữa các tế bào ung thư, làm chậm sự tăng trưởng của
k
hối u và sự lây lan của ung thư [16’.
Piperin tác dụng chống oxy hóa do làm giảm mức độ peoroxy hóa lipid
và sự hình thành gốc tự do với sự gia tăng đồng thời các hoạt động của các
chất chống oxy hóa ezym (Superoxide dismutase, catalase và glutathione
peroxidase) và chất chống oxy hóa không enzym (vitamin E và vitamiii C).
Piperin ức che được các enzym tham gia vào chuyển hóa sinh học của
nhiều thuốc. Tham gia vào phản ứng giáng hóa thuốc hay còn gọi là phản ứng
pha I (như phản ứng oxy hóa thuốc qua sự xúc tác của cytochrom P450).
Piperin tham gia vào phản ứng pha II (còn gọi là phản ứng liên hợp) kết
quả của tác động của piperin trên hai pha này là làm tăng tích lũy của các
thuốc, giúp đào thải chậm, làm tăng hiệu lực, có khi tăng độc tính. Do đó

piperin làm tăng sinh khả dụng của nhiều thuốc.
Do đó piperin có tương tác với nhiều thuốc như: Thuốc chống lao isoniazid,
pyrazinamid và rifampicin, thuốc chống cao huyết áp propranolol, thuốc
chống hen theophyllin
Piperin làm tăng sinh khả dụng của cucumin lên 2000%[11]. Sự kết
hợp giữa piperin và curcumin không phải là một trường họp riêng biệt:
piperin còn cải thiện việc hấp thu nhiều phân tử khác có mặt trong thức ăn,
đặc biệt như: chất |3-caroten (tiền vitamin A), selenium, phân tử (-)-
Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) chống ung thư chính có mặt trong trà
xanh.
Tháng 2 năm 2008, các nhà nghiên cứu phát hiện rằng piperin có thể
kích thích tạo màu da khi kết hợp với tia tử ngoại. Nghiên cứu này chỉ ra tác
dụng nữa của piperin là dùng để chữa bệnh bạch tạng.
Ngoài ra piperin được biết đến các tác dụng như chống trầm cảm,
chổng viêm, kháng nấm [12], [15], [16], [17]
1.2 Tổng quan về hồ tiêu.
1.2.1 Đặc điểm thực vật.
Hồ tiêu có tên khoa học: Piper nigrum.L
Họ: Piperaceae
Tên khác: hạt tiêu, cổ nguyệt, hắc cổ nguyệt, bạch cổ nguyệt.
Hồ tiêu là một loại cây leo, thân dài, nhẵn bám vào các cây tựa bằng
những rễ. Thân mang lá mọc cách. Lá giống lá trầu không nhưng dài và thuôn
hơn. Có hai loại nhánh: một loại nhánh mang quả, một loại nhánh mang dinh
dưỡng cả hai loại nhánh đều xuất phát từ kẽ lá. Cụm hoa hình đuôi sóc, mọc
đối lá, khi chín rụng cả chùm. Quả hình cầu nhỏ, có chừng 20-30 quả trên một
chùm, lúc đầu màu xanh lục, sau có màu đỏ, khi chín có màu vàng [3 .
1.2.2 Phân bổ, trồng hải và chê biến.
Hồ tiêu được trồng ở các nước vùng nhiệt đới. Các nước sung cấp
nhiều hồ tiêu Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Philipin, Cambodoa, Brazil, Việt
Nam.

ở Việt Nam được trồng nhiều ở Phú Quốc, Kiên Giang, An Giang, Đắc
Nông
Hồ tiêu trồng bằng cách giâm cành hoặc bằng hạt. Người ta thường thu
hái quả từ năm thứ 4, hiệu suất cao nhất vào năm thứ 7, 8.
Tùy theo người ta muốn có hồ tiêu đen hay hồ tiêu sọ (hồ tiêu trắng)
mà cách thu hái chế biến có khác nhau.
Để có hồ tiêu đen, người ta hái vào lúc thấy có một vài quả đỏ hay vàng
trên chùm quả, nghĩa là đa số quả còn xanh. Những quả non chưa có sọ khi
phơi khô sẽ giòn dễ vỡ vụn ra. Còn những qua khác khi phơi khô vỏ sẽ nhăn
nheo lại, màu ngả đen do đỏ cỏ tên là hồ tiêu đen.
Hình 1: Hình ảnh hồ tiêu đen và hồ tiêu sọ
Để có hồ tiêu sọ phải hái vào lúc quả đã thật chín, sau đó loại vỏ ngoài
bằng cách chà xát hoặc đem ngâm dưới vòi nước chảy 3-4 ngày, xát để loại
hềt vỏ đen rối phơỉ khô. Loạỉ tiày có màu trắng ngà, ỉt nhăn nheo hơn, ít thơm
hơn (vi lớp vỏ ngoài có chửa tinh dầu đã bị loại đi) nhưng cay hơn [
3], [4 .
ỉ 2.3 Thành phần hỏa học.
Trong hồ tiêu cỏ;
Tinh dầu: 1,2 - 3,5% trong hồ tiêu đen và 1,2 - 2,5% trong hồ tiêu
trắng, tinh dầu màu vàng nhạt hay màu lục nhạt, thành phần chính của tinh
dầu là a và p - pinen sabinen, caren limonen.
Alcaloid; 1,7 - 7,4 % [11], trong đó chủ yếu là piperin (chiếm 90 -
95%) có vị cay (pha loãng 1/200 000 còn vị cay), piperin khi thủy phân sẽ cho
piperidin và acid piperic, chavicin là đồng phân (dạng cis-cis) của piperin
cũng có vị cay, khi thủy phân sẽ cho piperidin và acid chavicic còn có một
lượng nhỏ các chất piperettin, piperylin và piperolein A, piperolein B ít cay
hơn.
Ngoài ra trong hồ tiêu còn có cubelin không có vị cay, chất béo và tinh
bột [3], [4].
1.2.4 Tác dụng, công dụng.

Hồ tiêu với liều nhỏ tăng tiết dịch v ị, dịch tụy, kích thích tiêu hóa làm ăn
ngon. Nhưng liều cao sẽ kích thích niêm mạc dạ dày, gây sung huyết và gây
viêm cục bộ, gây sổt, gây viêm tiết niệu, tiểu tiện ra máu. Hồ tiêu còn có tác
dụng sát khuẩn, diệt ký sinh trùng.
Ngoài công dụng làm gia vị, hồ tiêu được dùng làm thuốc kích
thích tiêu hóa, giảm đau (chữa đau răng), chữa đau bụng, tiêu chảy, cảm
lạnh [3 .
L3 Một số nghiên cứu chiết xuất pìperin từ hồ tiêu.
Hồ tiêu được chiết bằng ethanol 95% trong 2 giờ. Dịch chiết sau đó
được cất thu hồi dung môi thành cao, cao thu được hòa tan trong 10% kali
hydroxyd (KOH) trong ethanol 95% sau đó thêm nước để tạo tủa và để yên
qua đêm, lọc thu lấy tủa và kết tinh lại bằng aceton. Hiệu suất là 3% sản phẩm
[1].
Hồ tiêu được chiết bằng dung môi dicloromethan dùng ete để loại tap
và được tinh chế băng hỗn hợp dung môi aceto:n-hecxan tỷ lệ 3:2. Hiệu suất
5% [10]
Vidal, JP và Richard, H (1987) đưa ra quy trinh chiết dùng cacbon
dioxid + ethanol. Kết quả thu được hiệu suất 42,2% piperin và 16,7 % tinh
dầu [9].
Hans J ( Đức) dùng carbon dioxid siêu tới hạn để chiết. Phương pháp
này cho hiệu suất cao. Nhưng phương pháp này khá tốn kém và vẫn còn dùng
thêm dung môi để kết tinh piperin [8], [9’.
Các nghiên cứu chiết hồ tiêu bằng nước dùng những chất làm tăng độ
tan của piperin trong nước như: sodiumbutyl glycol sulphat, sodium n-butyl
benzen sulphonat [9’
Chiết hồ tiêu bằng dung dịch nước Sulfat của butylglycol trong 2 giờ ở
30”c sau đó thêm nước để piperin kết tủa hết. Hiệu suất thu được là 58.8% độ
tinh khiết của piperin là 98% [9’.
Trần Thị Nga (năm 2010) có đưa ra phương pháp chiết: dùng dung môi
chiết là dicloromethan, kiềm hóa bằng NH4OH 25%, tinh chế bằng diethyl

ether hiệu suất được 2,18% [5‘.
Ngoài ra piperin còn được tổng hợp hóa học bằng phản ứng ngưng tụ từ
acid piperic clorid và piperiden. Tuy nhiên trong thực tế piperin không được
hình thành bằng cách này mà dược chiết từ hồ tiêu
Hồ tiêu được chiết bằng dung môi dicloromethan dùng ete để loại tap
và được tinh chế băng hỗn hợp dung môi aceto:n-hecxan tỷ lệ 3:2. Hiệu suất
5% [10]
Vidal, JP và Richard, H (1987) đưa ra quy trinh chiết dùng cacbon
dioxid + ethanol. Kết quả thu được hiệu suất 42,2% piperin và 16,7 % tinh
dầu [9 .
Hans J ( Đức) dùng carbon dioxid siêu tới hạn để chiết. Phương pháp
này cho hiệu suất cao. Nhưng phương pháp này khá tốn kém và vẫn còn dùng
thêm dung môi để kết tinh piperin [8], [9’.
Các nghiên cứu chiết hồ tiêu bằng nước dùng những chất làm tăng độ
tan của piperin trong nước như; sodiumbutyl glycol sulphat, sodium n-butyl
benzen sulphonat [9
Chiết hồ tiêu bằng dung dịch nước Sulfat của butylglycol trong 2 giờ ở
30®c sau đó thêm nước để piperin kết tủa hết. Hiệu suất thu được là 58.8% độ
tinh khiết của piperin là 98% [9].
Trần Thị Nga (năm 2010) có đưa ra phương pháp chiết; dùng dung môi
chiết là dicloromethan, kiềm hóa bằng NH4OH 25%, tinh chế bằng diethyl
ether hiệu suất được 2,18% [5’.
Ngoài ra piperin còn được tổng hợp hóa học bằng phản ứng ngưng tụ từ
acid piperic clorid và piperiden. Tuy nhiên trong thực tế piperin không được
hình thành bằng cách này mà dược chiết từ hồ tiêu
CHƯƠNG 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Nguyên vật liệu và thiết b ị:
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất:
Nguyên liệu :
+ Hồ tiêu sọ, hồ tiêu đen (thu hái tháng 12 tại huyện Cư Jut - tỉnh Đắc

Nông - Việt Nam).
+ Đặc điểm: chọn loại tiêu quả to đều.
- Hóa chất;
+ Piperin chuẩn (viện hóa học, hàm lượng 98%)
+ Ethanol 96%.
+ Methanol.
+ Acid acetic băng
+Natri hydroxid
+ Aceton
+Dicloromethan
+ Nước cất một lần.
2.1.2. Mảy móc, thiết b ị:
- Máy HPLC Shimadzu SPD-MlOAvp với detetor u v (Nhật Bản).
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức).
- Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ).
- Máy khuấy từ, bếp cách thủy, tủ sấy.
- Cân kỹ thuật Sartorius BP2001 s (Đức).
- Màng lọc 0,45 |im.
- Dụng cụ thuỷ tinh: bình định mức, bình cầu, bình gạn, pipet, ống
đong, pipet, cốc có mỏ, ống nghiệm
-Bản mỏng silicagen
- Máy đo phổ hồng ngoại.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV 500 MHz
- Máy đo phổ khối Autospec Premier (USA).
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Ez-Melt (Mỹ).
2.2 Nội dung nghiên cứu.
2.2.1 Xác định hàm lượngpiperin trong hạt hồ tiêu đen, vỏ hồ tiêu đen và
trong hồ tiêu sọ.
Quả hồ tiêu đen gồm có phần vỏ quả và phần hạt. Vì vậy chúng tôi tiến

hành xác định hàm lượng piperin trong từng phần, từ đó chọn nguyên liệu
thích hợp có hàm lượng piperin cao để chiết.
2.2.2 Lựa chọn dung môi chiết.
Nhằm chọn lựa dung môi có khả năng hòa tan piperin, dễ kiếm, có khả
năng thu hồi và ít độc hại. Piperin là một hợp chất có tính base yếu, không
phân cực, tan trong methanol, ethanol cao độ, aceton, dicloromethan Vì
vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát một số dung môi sau : aceton, ethanol 96%,
dicloromethan.
Các tiêu chí so sánh gồm hiệu suất chiết, tính chọn lọc và tốc độ chiết.
2.2.3 Xác định kích thước tiểu phân dược liệu.
Trong chiết xuất việc xác định kích thước dược liệu để chiết cũng rất
quạn trọng. Hạt tiêu có tính chất khá cứng chắc do đó chúng tôi phải xác định
kích thước dược liệu phù hợp để chiết. Kích thước dược liệu thô quá, dung
môi khó thấm ướt dược liệu, hoạt chất khó được chiết vào dung môi. Khi độ
mịn dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa dược liệu và dung môi tăng lên,
theo định luật Pick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời
gian chiết xuất sẽ nhanh hơn. Nhưng khi dược liệu xay quá mịn sẽ gay ra một
số bất lợi cho quá trình chiết [V.
10
Do đó chúng tôi phải xác định kích thước của dược liệu chiết sao cho
thời gian chiết nhanh nhất, bột dược liệu không dính vào nhau để rút dịch
chiết được dễ dàng.
2.2.4 Các phương pháp tinh chế.
Sau khi tìm được dung môi chiết và kích thược dược liệu thích họp để
chiết. Chúng tôi tiến hành tìm các phương pháp tinh chế để tìm ra phương
pháp tốt nhất với các yếu tố : đơn giản, tiết kiệm, hiệu suất cao.
2.3. Phương pháp thí nghiệm :
2.3.1. Phương pháp chiết xuất:
Áp dụng phương pháp chiết xuất; ngâm lạnh.
Các bước tiến hành như sau :

Dược liệu được chia nhỏ đến kích thước thích hợp. Cân và cho vào bình chiết,
thêm dung môi. Sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết và rửa
dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp. Đẻ tăng cường hiệu quả chiết
xuất tiến hành khuấy trộn [1].
2.3.2. Phương pháp định lượng piperỉn :
Piperin được định lưọng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).
Các bước tiến hành như sau :
a. Lựa chọn điều kiện sắc kỷ :
Tham khảo các tài liệu và qua thực nghiệm, điều kiện sắc ký được xác
định như sau :
Cột: DESC Luna 5|im C18
Pha động; methanol tinh khiết dùng để chạy HPLC.
Bước sóng phát hiện: 342 nm.
Tốc độ dòng: 0,8ml/phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột: 51^1.
11
Nhiệt độ buồng cột: 30°c.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn :
Tiến hành : Cân chính xác 20 mg piperin chuẩn cho vào bình định mức
100 mL sau đó thêm ethanol 96% vừa đủ, lắc cho hòa tan hoàn toàn. Thêm
ethanol 96% đến vạch cho đủ thể tích, ta được dung dịch chuẩn 200 |ig/mL.
Lọc qua màng 0,45Ịim [14], [18].
b. Chuẩn bị mẫu thử định lượng:
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 350 mg bột dược liệu cho vào bình
định mức lOOml cho vào khoảng 30 ml ethanol 96% đem siêu âm 30 phút rồi
cho tiếp ethanol 96% tới vạch . Sau đó lọc qua màng lọc 0,45 I^m rồi đem đo
HPLC.
c. Định lượng:
Tiến hành định lưọrng mỗi mẫu 3 lần theo điều kiện sắc ký đã xác định,

lấy kết quả trung bình.
2.3.3. Công thức tính toán:
a. Hàm lượng phần trăm piperin trong hồ tiêu được tính theo công thức:
Trong đó:
m^.a.V^.í .s
x% = —^ T ^ 100%
.s
T c c c
x%: hàm lượng piperin trong hồ tiêu,
rnc: khối lượng piperin chuẩn (gam).
rnx: khối lượng hồ tiêu đem chiết (gam).
S c , St: diện tích peak mẫu chuẩn và mẫu thử.
a: hàm lượng piperin chuẩn (%).
V c , Vt: thể tích của dung dịch chuẩn và thử (ml).
fc , fr: hệ số pha loãng của dung dịch chuẩn và thử
12
b. Hiệu suất chiết xuất :
Hiệu suất quá trình chiết xuất được tính theo công thức sau :
HLp/dỉ
Trong đó :
H : Hiệu suất chiết xuất (%).
HLp/dc : hàm lượng piperin chiết được từ dược liệu .
HLp/dl ; hàm lượng piperin có trong dược liệu
2.3.4. Các phương pháp tỉnh chế piperin :
_Sử dụng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi để loại tạp và kết tinh
piperin.
Loại tạp chất mày bằng than hoạt.
2.3.5 Kiểm tra chất lượng sản phẩm :
a. Đo phồ khối lượng (MS):
Phổ khối lượng được ghi trên máy AutoSpec Premier tại Phòng thí

nghiệm Hóa Vật Liệu khoa hóa học của trường đại học Khoa học tự nhiên -
đại học Quốc Gia Hà N ội.
b. Phổ hồng ngoại (IR) :
Sản phẩm tinh khiết được phân tích phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy
phân tich phổ hồng ngoại đo trong vùng bước sóng 4000-500 em'' tại Phòng
phân tích phổ hồng ngoại của Viện hóa học Việt Nam
c.Phỗ cộng hưởng từ hạt nhân (^H-NMR.) :
Sản phẩm được đo trên máy AV 500 MHz tại phòng phân tích phổ
cộng hưởng từ của Viện Hóa học Việt Nam.
d, Đo độ chảy
Sản phẩm được đo độ chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy Ez-Melt.
13
CHƯOnVG 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xác định sự phân bố piperin trong hồ tiêu:
Mục đích : Đe xác định sự phân bố piperin trong vỏ quả hay trong
hạt. Dược liệu được tách thành 2 phần riêng biệt : vỏ quả và hạt.
Trước tiên chúng tôi xác định tỷ lệ khối lượng vỏ quả và hạt: cân 20 g
hồ tiêu đen bóc tách riêng 2 phần vỏ quả và hạt. Cân 2 phần và tính phần trăm
khối lượng.
Xác định sự phân bố của piperin chúng tôi tiến hành khảo sát 3 mẫu
dược liệu như sau ;
Mau 1 : Hồ tiêu sọ.
Mầu 2 : Hạt hồ tiêu đen.
Mau 3 : Vỏ quả hồ tiêu đen.
Tiến hành: cân chính xác khối lượng mẫu (m ~ 2 gam) cho vào bình nón
200 ml rồi cho vào bình 100 ml ethanol 96%, đem siêu âm 30 phút. Sau đó
hút 1 ml dịch chiết pha loãng 6 lần bằng ethanol 96%. Sau đó lọc qua màng
lọc 0,45 ịim rồi đem đo HPLC.
Ket quả thu được như sau :
Bảng 1 : Sự phân bố piperin giữa vỏ quả, hạt của hồ tiêu và hồ tiêu sọ.

Bộ phận dược liệu
Tỷ lệ khôi lượng
(%)
Hàm lượng
piperin (%)
Hô tiêu sọ
7,32
Hồ tiêu đen
Hạt
80,6
6,32
Vỏ quả
19,4
0,17
Nhận xét:
Piperin phân bố chủ yếu trong hạt, hàm lượng piperin trong vỏ quả hồ
tiêu đen là rất ít bằng 1/37 hàm lượng piperin trong hạt.
14
Hàm lượng piperin trong hồ tiêu sọ là 7,32% lớn hơn hàm hàm lượng
piperin trong hồ tiêu đen là 5,13%.
Do đó chúng tôi quyết dịnh sử dụng hồ tiêu sọ làm nguyên liệu để chiết
xuất.
3.2 Chọn dung môi chiết.
Sau khi chọn được nguyên liệu chiết chúng tôi tiến hành lựa chọn dung
môi chiết.
Cách tiến hành: cân 3 mẫu mỗi mẫu 5g bột dược liệu cho vào 3 bình
nón lOOml.
Bình nón 1 cho 20ml ethanol 96%.
Bình nón 2 cho 20ml aceton.
Bình nón 3 cho 20ml dicloromethan.

Các bình để ngâm 3 giờ khuấy trên máy khuây từ, sau đo đem lọc hút
kiệt dịch chiết, lấy 5|il dịch chiết chấm sắc ký lóp mỏng rồi đem soi đèn tử
ngoại. Bã dược liệu lại cho vào ngâm và làm tương tự lần 2, lần 3.
Pha động chạy sắc ký lớp mỏng: n-hexan ; etylacetat = 3:2
Soi u v 254nm.
Kết quả thu được hình ảnh chấm sắc ký lóp mỏng;
»vỉ»
i" - : I

,
♦
II
1
IW
. . ;C' t i i ỉ p C A O
Dich chiết lần 1 Dịch chiết lần 2 Dịch chiết lần 3
Hình 2: Hình ảnh sắc ký lớp mỏng của các dung dịch chiết
15
CH là vết chấm của piperin chuẩn,
c là vết chấm của dịch chiết trong ethanol 96%
A là vết chấm của dịch chiết trong aceton.
D là vết chấm của dịch chiết trong diclomethan.
Nhận xét:
Từ hình ảnh sắc ký lớp mỏng ta thấy với dung môi chiết là aceton dịch
chiết lần 3 còn rất ít piperin. Với dung môi là ethanol 96% và dicloromethan
dịch chiết lần 3 vẫn còn nhiều piperin. Từ kết quả trên chúng tôi đã chọn dung
môi chiết là aceton để có hiệu suất chiết cao, thời gian chiết ngắn. Hơn nữa
trong aceton, hồ tiêu không bị trưong nở nhiều, do đó dịch chiết dễ rút hơn so
với chiết bằng cồn và aceton có nhiệt độ sôi thấp do đo khi thu hồi dung môi
ta đun ở nhiệt độ dưới

60°c không làm phân hủy dược chất.
3.3 Ảnh hưởng của kích thước tiểu phân dược liệu.
Tiến hành: Xay hồ tiêu sọ sau đó phân ra các kích thước dược liệu bằng
các cỡ rây thích họp. Chúng tôi tiến hành với các kích thước;
Mầu 1: < 0,25 mm
Mầu 2: 0,25-1,0 mm
Mầu 3: l,0-l,5m m
Cân mỗi mẫu 2 gam cho vào bình nón 200ml. Sau đó cho vào binh
1 OOml aceton rồi đem khuấy bằng máy khuấy từ. Cứ sau 1 giờ lấy mẫu một
lần, mỗi lần hút Iml mẫu pha loãng 6 lẫn với ethanol 96%, lọc qua màng lọc
0,45 |a.m rồi đem đo HPLC.
Kết quả:
Bảng 2: Hiệu suất piperin chiết được của các dược liệu kích thước khác nhau
16
Thời gian lấy
mẫu
Hiệu suât chiêt
piperin mẫu 1
(<0,25mm) (%)
Hiệu suât chiêt
piperin mẫu 2
(0,25-lmm) (%)
Hiệu suât chiêt
piperin mẫu 3(1-
1,5 mm) (%)
1
79,64
47,81
46,04
2

89,07
52,46
46,45
3
93,44
53,83
49,18
4
94,12
57,24
50,14
5
94,40
59,20
51,64
6
95,08
61,61
54,64
7 95,63
62,98
56,83
8
96,72
69,95
60,38
9 97,00 76,64
75,14
ĐỒ thị;
17

Nhận xét:
Kích thước dược liệu tăng thì hiệu suất piperin chiết được giảm và thời
gian thiết lập cân bằng chiết tăng. Dược liệu có độ min <0,25 mm hiệu suất
chiết đạt 93,44% % chỉ sau 3 giờ. Trong khi đó dược liệu có độ mịn > 0,25
mm hiệu suất chiết chỉ đạt khoảng 75-76% sau 9 giờ chiết.
Từ kết quả thu được để chiết có hiệu suất cao và thời gian chiết ngắn
chúng tôi lựa chọn kích thước dược liệu chiết dưới 0,25mm và chiết trong 3
giờ.
3.5 Tinh chế pỉperin.
Chiết 300g bột hồ tiêu sọ được xay qua rây 0,25 mm. Chiết 3 lần, mỗi
lần chiết với ổOOml aceton trong 3 giờ. Dịch chiết sau 3 lần được gộp lại, đem
cất quay thu hồi dung môi thu được 27 gam cao đặc. Tỷ lệ phầm trăm cao so
với dược liệu là 9%.
Tinh chế để thu được piperin từ cao chiết bằng các phương pháp sau:
3.5. l Phương pháp I:
Ápdụng phương pháp chung để tinh chế alcaloid
Sơ đồ quy trình chiết:
TRUỒNG ĐH Đ U Ộ cllI
m i ]
THlỉmỆM
' I
Ngày íhárig 20ll \
SỐĐKCB:

.2r.6!d.3

'
18
lọc,sấy
Hình 4: Các bước tinh chế piperin theo phương pháp chung