Một số yếu tố thường gặp trong kiểm nghiệm dược liệu bằng kính hiển vi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
— C 5 3 ★ B O —
NGUYỄN THANH HUYỀN
MỘT SỐ YẾU TỐ THƯỜNG GẶP TRONG KIỂM NGHIỆM
• • •
DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHÓA 2002-2007)
Người hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian thực hiện
: TS. Nguyễn Viết Thân
: Bộ môn Dược Liệu
: 09/2006 đến 05/2007
HÀ NỘI, THÁNG 05 NĂM 2007
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình hoàn thành khóa luận này tôi đã nhận được sự hướng
dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ thầy cô và bạn bè.
Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Viết Thân
Người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình làm thực
nghiệm và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, kỹ thuật viên trong Bộ môn Dược
liệu, các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phòng đào tạo cùng toàn thể các thầy
cô giáo, cán bộ trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi
hoàn thành khóa luận.
Đồng thời tôi xin được cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan
tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2007
Sinh viên
Nguyễn Thanh Huyền

Trang
Đặt vấn đề 1
Phần l:Tổng quan 3
1.1. Lịch sử phát triển của kiểm nghiệm dược liệu

3
1.2. Phân loại tạp 5
1.2.1. Côn trùng 6
1.2.2. Nấm mốc 7
1.2.3. Hạt phấn 10
1.2.4. Các yếu tố khác 11
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 13
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

13
2.1.1. Nguyên liệu 13
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 13
2.2. Kết quả thực nghiệm

14
2.2.1. Hình ảnh các yếu tố tạp thường gặp trong kiểm nghiệm dược 14
liệu bằng kính hiển v i
2.2.2. Sơ bộ điều tra tạp trên dược liệu 41
2.2.3. Kiểm nghiệm mẫu tìiuốc có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường 44
Kết luận và đề xuất 45
Tài liêu tham khảo
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỂ
Hiện nay trên thị trường đã và đang lưu hành ngày càng nhiều sản
phẩm thuốc đông y được sản xuất theo phương thuốc cổ truyền. Tuy nhiên

chất lượng của các loại thuốc này vẫn đang còn là câu hỏi lớn cho các nhà
quản lý. Đảm bảo chất lượng của thuốc cần phải có sự kết hợp chặt chẽ trong
các khâu từ kiểm tra nguyên liệu ban đầu, giám sát quy trình sản xuất, kiểm
định thành phẩm, bán thành phẩm Do vậy việc kiểm tra dược liệu ban đầu
là rất quan trọng.
Như ta đã biết, mục đích của kiểm nghiệm dược liệu là xác định tính
đúng và chất lượng của chúng. Tứih đúng và chất lượng của dược liệu cần phải
được đánh giá thông qua sự kết hợp của các phương pháp: cảm quan, phương
pháp hiển vi và hóa học.
Từ xưa ông cha ta đã có câu:
Tam đại lương y
Bất vi hoàn tán
Tức là dù rất giỏi (làm lương y đến 3 đời) nhưng vói loại thuốc bao gồm
hỗn hợp các thành phần đã tán nhỏ thì cũng không cách nào nhận biết được.
Tuy nhiên, sự rấ đòi của kính hiển vi và phương pháp kiểm nghiệm dược liệu
bằng hiển vi đã làm thay đổi quan niệm này.
Kiểm nghiệm bằng kính hiển vi có ưu điểm là không chỉ nhận biết được
dược liệu đơn thành phần mà còn phát hiện được sự có mặt của dược liệu
trong hỗn hợp.
về nguyên tắc, phương pháp này được tiến hành sau khi kiểm
nghiệm sơ bộ bằng cảm quan và trước khi áp dụng các phương pháp hóa học
hay thử tác dụng sinh lý đối vói một dược liệu.
Trong quá trình kiểm nghiệm bằng kính hiển vi, ta không chỉ thấy được
đặc điểm đặc trưng để nhận biết dược liệu mà còn gặp những đặc điểm lạ có
nguồn gốc khác nhau hay các yếu tố hữu hình như nấm mốc, côn trùng. Sự có
mặt của những đặc điểm này có thể là dấu hiệu của lẫn tạp dược liệu hay dược
liệu kém chất lượng.
Các đặc điểm tìm thấy này nếu được nghiên cứu kỹ lưỡng có thể là
những yếu tố rất quan trọng để đánh giá chất lượng dược liệu. Do đó để tạo cơ
sở cho việc kiểm định dược liệu có hiệu quả hơn chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Một sô'yếu tố thường gặp trong kiểm nghiêm dược liệu bằng kính hiển Vỉ”.
Mục đích của đề tài nhằm góp phần nâng cao hiệu quả kiểm nghiệm
dược liệu bằng phương pháp hiển vi.
Nội dung đề tài bao gồm:
- Phát hiện các yếu tố thường gặp trong kiểm nghiệm dược liệu bằng kính hiển vi
- Mô tả và nghiên cứu đặc điểm các yếu tố
- Lập danh sách các yếu tố tạp trong 1 số dược liệu nhất định
- Kdểm định một số mẫu thuốc trên thị trường
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1 Lịch sử phát triển của kiểm nghiệm dược liệu
Từ thời xa xưa con người đã tìm cho mình thức ăn, vị thuốc trong cây cỏ
và tập phân biệt cây độc. Đầu tiên các hiểu biết này được truyền miệng, sau
được ghi lại, và trong các nền văn minh cổ xưa nhất còn tồn tại dấu tích dùng
cây làm thuốc. Khối tri thức về dược liệu trên thế giới cứ thế dần phát triển,
đáng chú ý là Teophorat viết cuốn lịch sử cây cỏ mô tả chính xác về thực vật,
Dioscorid (người Hy Lạp) thống kê 500 vị dược liệu nguồn gốc thực vật, động
vật và khoáng vật trong cuốn “Dược liệu học” (De Materia medica) [2], [17].
Khoảng đầu thế kỷ xvn, ngành dược liệu với nhiệm vụ là xác định,
kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm được tách khỏi ngành y. Người ta bước
vào giai đoạn khoa học dựa trên quan sát và thực nghiệm Cùng với tập lịch sử
đại cương về dược liệu (1675) của Pome và quyển khảo luận phổ cập về dược
liệu đơn (1697), người ta thu được kiến thức chính xác hơn về giới thực vật.
Việc mô tả và phân loại dược vật được phát triển mạnh mẽ đặc biệt bởi các
nhà khoa học Pháp. Các công trình này có ảnh hưcmg sâu sắc đến bộ môn
dược liệu là xác định thực vật 1 cách chính xác, đây cũng chính là điểm xuất
phát cơ bản của môn học này [17].
Đặc biệt, khi nhà khoa học Dragendorff tìm ra thuốc thử định túih alcaloid
trong cây, kiểm nghiệm Dược liệu thực sự bước sang môt trang mới. Hóa học
đã bắt đầu được đưa vào kiểm nghiệm dược liệu. Sau này, một hình thái mới
của việc nghiên cứu được nảy nở vói sự phát triển của môn sinh lý. Tương

quan giữa cấu trúc hóa học của các thành phần và tác dụng đã trở nên hiển
nhiên vào cuối thế kỷ XIX.
Như vậy, dần xuất hiện 3 mặt hoạt động của môn Dược Liệu: Kiểm
nghiệm dược liệu bằng thực vật, nhiều khi đã đủ để xác định dược liệu, khảo
sát thành phần hóa học và nhất là các hoạt chất, khảo sát tác dụng sinh lý là
việc kiểm tra việc sử dụng trong điều trị.
Môn dược liệu bắt đầu phát triển ở Việt Nam từ khi các nhà khoa học
Pháp đưa môn này vào trong chương trình học ở trường Đại học Đông Dương.
Nhờ đó ngành dược liệu của Việt Nam được kế thừa khối lượng tri thức của
các nhà khoa học, thực vật học Pháp mà lúc này kiểm nghiệm bằng hiển vi đã
đạt trình độ cao. Hơn nữa, Việt Nam có quan hệ thân thiết với các nước xã hội
chủ nghĩa khác như Nga, Bungary, Hungary nên ngành Dược liệu nước ta
cũng được kế thừa thành tựu khoa học của các nước này với kiểm nghiệm hóa
học đã bắt đầu phát triển. Từ sau cách mạng tháng 8-1945 đến nay, nhà nước
rất quan tâm đến việc phát triển Y học cổ truyền. Đặc biệt GS. TS. Đỗ Tất Lợi,
tác giả cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, được coi như là cầu
nối của Y Dược học hiện đại và Y Dược học dân tộc.
* Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi:
Đầu thế kỷ XX, môn Dược liệu được phát triển gần như chỉ theo hướng
thực vật. Đầu tiên việc mô tả dược liệu đơn thuần chỉ là hình thái. Việc mô tả
không đơn thuần đề cập đến các dược liệu mà còn nói đến giả mạo. Sau đó
người ta đưa các đặc điểm vi học vào việc nhận thức và giám định [17].
Bao giờ phần này của môn Dược liệu cũng là cơ bản vì nếu không xác định
thực vật một cách chính xác thì không có khảo sát hóa học và sinh lý cố giá trị [17].
Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là muốn kiểm định được dược
liệu thì cần phải biết trước các dược liệu đó có đặc điểm gì. Nếu trong quá
trình kiểm nghiểm có các đặc điểm lạ thì chúng bị coi là tạp.
Được phát minh bởi nhà khoa học Leeuwenhoek vào thế kỷ xvn và bắt
đầu được đưa vào sử dụng từ đầu thế kỷ xvni, kính hiển vi sau đó được áp
dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm dược liệu. Khi đó, các đặc điểm quan sát thấy

được các nhà khoa học, thực vật học vẽ lại. Dù các hình ảnh này được vẽ tương
đối tỉ mỉ và đã phần nào mô tả chính xác các đặc điểm nhưng chúng vẫn mang
tính chất chủ quan và phụ thuộc nhiều vào người vẽ [11].
Ngày nay, do yêu cầu về độ chính xác ngày càng cao cùng với sự phát
triển của khoa học kỹ thuật, máy ảnh đã được đưa vào sử dụng trong kiểm
nghiệm dược liệu với mục đích chụp lại những hình ảnh quan sát được. Do
vậy, hình ảnh thu được là hoàn toàn khách quan và chính xác. Hiện nay, máy
ảnh được sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau như: máy kỹ thuật số gắn
vào kính hiển vi, camera với một đầu được gắn với máy tính nhằm lưu lại ảnh
chụp các đặc điểm dưới dạng file ảnh [14].
Khoa học kỹ thuật phát triển đã đưa vào sử dụng nhiều loại kính hiển vi
khác nhau. Nếu trước đây các nhà khoa học chỉ sử dụng kính hiển vi sinh học
trong kiểm nghiệm vi học, thì ngày nay nhiều loại kính khác đã được ứng dụng
như kứứi hiển vi phân cực dùng để soi tinh thể dựa trên sự bất đẳng hướng về
mặt quang học của chất, kứứi hiển vi so sánh nhằm so sánh các mẫu khác nhau
về mô học hay hóa học, kính hiển vi điện tử giúp thu được hình ảnh không gian
3 chiều của đặc điểm hay yếu tố cần nghiên cứu. Ngoài ra, người ta còn sử
dụng 1 hệ thống các kính hiển vi nối với nhau để chia sẻ hình ảnh hay chuyển
hình ảnh từ kính hiển vi ra projector để phục vụ công tác giảng dạy [14].
1.2. Phân ỉoại tạp
Do có nguồn gốc từ thực vật và động vật nên dược liệu rất dễ bị nhiễm các
loài nấm mốc, sâu bọ. Hơn nữa, trước khi đưa dược liệu vào kho bảo quản, dược
liệu ttong quá trình thu hái, vận chuyển cũng không tránh khỏi khả năng bị lẫn
tạp như bụi bẩn hay thành phần của các dược liệu khác.
ĩQứ kiểm nghiệm một dược liệu bất kỳ bằng phương pháp hiển vi ta cần
biết đặc điểm các yếu tố của dược liệu đó theo các tài liệu chính thống. Trong
quá trình kiểm nghiệm nếu phát hiện có đặc điểm không thuộc về dược liệu
thì đó là tạp.
Các tài liệu phân chia tạp theo nhiều cách khác nhau, trong khóa luận này
chúng tôi phân chia các yếu tố tạp trong dược liệu theo nguồn gốc:

- Côn trùng (trứng, sâu non, nhộng, thành trùng).
- Nấm mốc (cây nấm, bào tử, sợi nám).
- Hạt phấn.
- Các yếu tố khác: giọt dầu Parafin, vân kính.
Như vậy, với khái niệm về tạp như trên, có những thành phần không phải
lúc nào cũng là tạp. Ví dụ ở một số tài liệu phấn hoa trong mật ong (Mel)
được coi là tạp, trong khi ở những tài liệu khác phỗứi hoa lại chúứi là đặc điểm
của mật ong.
1.2.1. Côn trùng
Dược liệu thường có tinh bột và các chất dinh dưỡng khác như Aavonoid,
saponin Trong điều kiện bảo quản với nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, dược
liệu là môi trường sống của rất nhiều loại côn trùng. Do vậy, dược liệu bị
nhiễm côn trùng là điều khó tránh khỏi.
Khi soi bột dưới kính hiển vi, côn trùng có thể được phát hiện ở nhiều dạng
khác nhau: nguyên dạng hay riêng lẻ từng bộ phận (chân, râu, đầu ), về cấu
tạo, côn trùng có thân chia làm ba phần rõ ràng: đầu, ngực, bụng. Ngực chia
làm 3 đốt, mỗi đốt có 1 đôi chân. Như vậy, từ “côn trùng” chỉ dùng để chỉ các
loài động vật có 3 đôi chân (6 chân); còn một số loài bọ, mạt thường thấy
trong thực phẩm hay dược liệu không được gọi là côn trùng vì chúng có 4 đôi
chân, và thưòfng thuộc Ngành chân đốt (hay Ngành chân khớp), lớp nhện (hay
lớp 8 chân). Song hầu hết các loài chân khớp nhiễm trong dược liệu thuộc lớp
côn trùng]. Trong phạm vi khóa luận này, khái niệm “côn trùng” được
dùng để chỉ những loài chân khớp thuộc lớp côn trùng (6 chân) và lớp
nhện (8 chân) [1], [10], [13], [20].
Côn trùng là sâu hại của hầu hết các loại cây trồng. Theo thống kê chưa
đầy đủ của Hội lương thực thực phẩm Quốc tế (FAO), hàng năm thiệt hại do
sâu bệnh gây ra khoảng 83 triệu tấn lương thực. Điều này cho thấy sức tàn phá
và số lượng đáng kể của côn trùng, đặc biệt trong môi trường thích hợp như
kho lưcmg thực, thực phẩm. Dược liệu với các điều kiện bảo quản tương tự
điều kiện bảo quản lương thực, thực phẩm cũng rất dễ bị côn trùng phá hoại

[8], [13].
Trước hết cần tìm hiểu các yếu tố thuận lợi cho sự phát triển của côn
trùng. Các yếu tố đó là:
- Nhiệt độ
Thân nhiệt côn trùng và trạng thái cơ thể của nó thay đổi theo sự thay đổi
nhiệt độ bên ngoài. Khoảng nhiệt độ thuận lợi cho đa số côn trùng là 15°c đến
38°c, tối ưu là 26°c [9],[10], [13].
- Độ ẩm
Côn trùng có kích thước nhỏ, diện tích bề mặt lớn, nên sự bốc hơi nước
của cơ thể cũng lớn. Vì vậy, sự phát triển của côn trùng phụ thuộc rất nhiều
vào độ ẩm của môi trường. Tùy từng loài mà độ ẩm không khí thích hợp có
thể từ 40% đến 100% [9],[10], [13].
1,2.2. Nấm mốc
Tương tự côn trùng, nấm mốc rất dễ phát triển trên các loại dược liệu
(cơ chất) khác nhau do điều kiện sinh sống (không khí, nước, ) gần với
điều kiện bảo quản dược liệu. Việc nghiên cứu tìm ra các yếu tố bất lợi
trong bảo quản dược liệu dẫn tới sự phát triển của nấm mốc rất quan trọng
giúp hạn chế tối đa sự sinh trưởng của khuẩn ti nấm mốc. Các yếu tố bất lợi
đó là:
- Nhiệt độ
Nhiệt độ có vai trò chủ yếu đối với sinh trưởng của khuẩn ti cũng như đối
với sự hình thành và nảy mầm của bào tử. Đa số nấm mốc phát triển trong
khoảng 15°c đến 30°c với nhiệt độ tối thích là 25°c đến 30°c [5], [12], [16].
- Độ ẩm
Sau nhiệt độ, độ ẩm cũng có ảnh hưỏng rõ rệt lên sinh trưởng của khuẩn ti
thể cũng như sự tạo thành và nảy mầm của bào tử. Tùy từng loài mà độ ẩm
thích hợp từ 80% đến 100% [5], [12], [16].
- Các yếu tố khác
Ngoài nhiệt độ và độ ẩm, yếu tố dinh dưỡng và một số các yếu tố khác
cũng ảnh hưởng đến sự phát triển (sinh trưởng và sinh lý trao đổi chất) ở mốc.

Do đó, một số loài mốc chỉ phát triển tối thích trên một số loại cơ chất nhất
định.
Hầu hết nấm mốc sống trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên mức độ không
như nhau: các loài thuộc giống Mucor và Trichoderma đòi hỏi nồng độ O2 cao
hơn, do đó thường sinh trưởng ở bề mặt cơ chất, hay trên bề mặt các dược liệu
[12].
Ngoài ra, thời gian cũng là một yếu tố quan trọng. Dưới điều kiện bất lọi,
thời gian cần cho sự nảy mầm của bào tử hoặc conidi tới 10 ngày, trong khi
gặp điều kiện thuận lợi, thời gian này là 1 ngày [12].
Nguồn mốc trên dược liệu có thể là địa điểm bảo quản (tường, trần, nền
nhà, bao bì ) trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. Từ đó bào tử của
chúng phát tán vào không khí hay được các giọt nước nhỏ, các hạt bụi mang
theo và nhiễm vào dược liệu trong kho một cách dễ dàng. Vì vậy, nếu nhà kho
và môi trường xung quanh được đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt thì chắc chắn
việc nhiễm mốc dược liệu sẽ giảm đi đáng kể.
* Một số loại nấm thường gặp trên dược liệu
Chi nấm cúc Aspergillus là chi nấm rất phổ biến bởi sự có mặt của chúng
trên mọi loại cơ chất khác nhau, sự phát triển của chúng cũng rất nhanh nên
vẫn thường được ví như 1 loại cỏ dại trong phòng thí nghiệm. Hệ sợi và giá
bào tử trần có thể không màu hay màu nâu, xám đen. Giá bào tử trần không
phân nhánh, mọc trực tiếp trên sợi nấm khí sinh hay sợi nấm nằm chìm trong
cơ chất, phần cuối phình to lên được gọi là bọng đỉnh giá. Bọc đỉnh giá có
dạng hình cầu, gần cầu, thuôn dài , trên bề mặt có các tế bào sinh bào tử có
thể có cuống hay không và có thể xếp kín mặt bọng hay 1 phần. Tế bào sinh
bào tử có dạng gần giống cái bình nên thường được gọi là thể bình. Các bào tử
trần được sinh ra từ miệng thể bình này gọi là chuỗi gốc non, tỏa đều ra mọi
phía. Các bào tử trần có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng,
elip, Các loài của chi nấm cúc có nhiều ứng dụng trong đời sống và cũng có
nhiều loài có độc tố và tác hại gây chết người [3], [5],[6].
- Aspergillus niger

Đặc điểm: kích thước của các phân tử có thể thay đổi tùy theo nhiệt độ,
sợi không màu, rộng 30 )jm, cuống đmh bào tử thẳng, cứng, trong, dài 1- 2 mm,
rộng 7, đầu màu nâu, phồng lên thành hình cầu, đường kính 30- 80 |im, dài hay
hình thoi, đôi khi không màu [12], [16].
- Aspergillus fumigatus
Đặc điểm: sợi nấm rộng 2- 3, cuống dửứi vào bào tử ngắn, nhẵn, 300-
500 |am X 2- 8 |am, kéo dài ra bởi 1 đầu hình chùy [12], [16].
- Aspergillus flavas
Đặc điểm: Sợi nấm không màu, cuống đính bào tử không màu, phình ra
đoạn cuối dài 4- 7mm, rộng 10, đầu to màu lục nhạt, hình cầu ngược, đường
kính 30- 40 I^m [6], [9].
- Mucor sp
Đặc điểm: Đặc sắc ở chỗ không có giả căn và thân ngầm. Tử nang binh
(cuống đính bào tử) thường đơn độc và đơn hoặc phân nhánh rất ít đứng thẳng
trên sợi nấm. Bào tử nang hình cầu thành mỏng. Bào tử rất nhiều, hình tròn.
Nang trụ lồi ra nhiều trong bào tử nang. Tiếp hợp bào tử hình cầu nhẵn, sẫm
màu, có dây treo thẳng [6], [9].
- Rhizopus sp
Đặc điểm: Đặc sắc bởi những thân ngầm có những bó giả căn. Cuống tử
nang thường thành bó không phân nhánh, phát sinh ở noi có giả căn. Nang trụ
to, hình bán cầu. Nang trụ ở trong bào tử hình cầu [6], [9].
*Sợi nấm
Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở
đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành 1 đám chằng chịt các sợi. Từng sợi thì
được gọi là khuẩn ti hay sợi nấm (hypha) [5].
Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục, đo đó không có khả năng
quang hçfp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các loại
thức ăn hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ti. Mỗi đoạn khuẩn ti khi rơi vào môi
trường thích hợp sẽ phát triển nhanh chóng thành 1 đám mốc mới. Ngược lại,
trong điều kiện bất lợi (đặc biệt là thiếu nước) thì các đám sợi này không có

khả năng sinh trưởng, bị teo lại tạo ra các hình thù khác nhau.
1.2.3. Hạt phấn
Hạt phấn chỉ có trên dược liệu có nguồn gốc từ hoa, ví dụ Hoa hòe (Flos
Sophorae japonicae), Hồng hoa (Flos Carthami), Sài đất (Herba Wedeliae)
[15].
Hạt phấn rất nhẹ, có thể dễ dàng phát tán ra các ncd khác nhờ gió hay
côn trùng, và do vậy rất dễ nhiễm vào các dược liệu khác. Trong kiểm nghiệm
các bộ phận dược liệu như rễ, thân, lá có thể bắt gặp hạt phấn của chính
dược liệu đó hay dược liệu có nguồn gốc từ hoa khác nhiễm vào. Điều này rõ
ràng sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình kiểm nghiệm, đặc biệt với phương pháp
kiểm nghiệm bằng kính hiển vi.
Đặc điểm chính để phân loại phấn hoa:
a. Hình khối hạt phấn: chia làm 3 nhóm
- Nhóm hạt phấn hình cầu có mặt phẳng xích đạo là hình tam giác như hạt
phấn Dừa cạn.
10
- Nhóm hạt phấn hình cầu có mặt phẳng xích đạo là hình tròn như hạt
phấn Sài đất.
- Nhóm hạt phấn hình cầu dài có mặt phẳng cực có hình bầu dục, mặt
phẳng xích đạo hình tròn như ích mẫu, Cà độc dược [7].
b. Kích thước hạt phấn:
Kích thước hạt phấn rất khác nhau giữa các loài, từ 1 vài Ịim đến 240|am.
ở những họ thực vật ở vị trí tiến hóa càng cao thì kích thước hạt phấn càng
nhỏ, tuy nhiên có 1 số họ có vị trí tiến hóa cao nhưng lại có hiện tượng tăng
kích thước hạt phấn như ở 1 vài chi trong họ Malvaceae, Cucurbiaceae, thì
hạt phấn rất to có thể phân biệt được bằng mắt thường [7].
- Hạt phấn có kích thước bé (10-25|xm) như Nhân trần 17|im.
- Hạt phâh có kích thước ùung bình (26-49|im) như Hương nhu trắng 39^m.
- Hạt phấn có kích thước lớn (50-100)|im như Mò đỏ 78|im [7].
c. Màu sắc hạt phấn:

Hạt phấn có màu trắng, xám, xanh, da cam, tím và vàng ở các mức độ
khác nhau, Màu sắc hạt phấn phụ thuộc vào chất cấu tạo màng, thông thường
là chất sporopollenin có màu vàng nhạt hoặc không màu. Khi xử lý tiêu bản,
chất cấu tạo màng chịu tác động trực tiếp .của các hóa chất nên trở thành màu
vàng hoặc màu vàng sẫm. ở 1 số loài thực vật, màng hạt phấh còn có các sắc
tố như anthocyane, carotenoid [7]
1.2.4. Các yếu tố khác
- Giọt dầu parafin
Parafin là chất lỏng trong, không màu, sánh như dầu.
Các chế phẩm thuốc đông dược, đặc biệt là viên hoàn trong quá trình sản
xuất thường bao bằng một lớp parafin ở ngoài, vừa để tạo độ bóng, tăng tính
11
thẩm mỹ của chế phẩm lại vừa có tác dụng bảo vệ. Do vậy, trong quá trình
kiểm nghiệm chế phẩm bằng kính hiển vi, các giọt dầu parafm thường xuyên
được tìm thấy. Điều này gây bất lợi trong quá trình kiểm nghiệm vì chúng có
kích thước và hình dạng rất dễ nhầm lẫn với các yếu tố cẩn tìm trong bột dược
liệu.
- Vân kính
Với phương pháp hiển vi, kích thước của một vật có thể được phóng to lên
hàng chục, hàng trăm lần, do vậy đối với các dụng cụ thí nghiệm như phiến
kính, lam kính, chỉ với sự nhiễm bẩn dù mắt thường không nhìn thấy nhưng
cũng có thể gây ảnh hưởng lớn đến kết quả kiểm nghiệm dược liệu. Những
loại tạp tìm thấy này có thể là nấm, côn trùng ở những dụng cụ không được
bảo quản và vệ sinh đúng cách, song chủ yếu là do chất liệu và cách thức sản
xuất tạo nên đường vân kính gây ra khó khăn trong kiểm nghiệm.
12
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Mẫu nghiên cứu là dược liệu và các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu

mua ở ngoài thị trường.
+Dược liệu mua tại các hiệu thuốc trên phố Hải Thượng Lãn ông.
+Các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu mua tại các hiệu thuốc tư
nhân: 21 mẫu.
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu.
- Quan sát các yếu tố tạp trong bột dược liệu
+ Quan sát và xác định màu sắc, mùi vị, bước đầu đánh giá về khả năng
nhiễm tạp trong bột dược liệu bằng phương pháp cảm quan .
+ Sử dụng nhiều loại dung dịch lên kính để làm tiêu bản bột dược liệu.
Nước là nguyên liệu được sử dụng chủ yếu để soi bột dược liệu. Ngoài ra còn
dùng ethanol và dung dịch NaOH 0,1N để soi rõ hơn các yếu tố tạp là nấm
mốc. Lấy bột dược liệu đưa vào 1 giọt EtOH 95% đặt sẵn trên lam kính, sau
đó lấy bột ra đưa vào 1 giọt NaOH 10% cũng đặt trên lam. Lấy 2 que nhọn gạt
cho khuẩn ty dàn mỏng rồi đậy lamen lên trên.
Mỗi dược liệu có chứa tạp là nấm đều được tiến hành kiểm nghiệm
với 2 loại môi trường là nước và NaOH (sau khi đã được đưa vào EtOH để
loại bọt khí).
+ Quan sát, mô tả đặc điểm các yếu tố tạp dưới kính hiển vi.
+ Các đặc điểm được chụp lại nhờ hệ thống kính hiển vi Leica gắn với máy
ảnh chuyên dụng Canon Powershot 40.
13
- Cố định tiêu bản bằng nến trong:
Dùng mũi mác lấy 1 lượng nến thích hợp cho lên lam kúứi, hơ phiến
kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nến tan chảy hết và cho 1 ít bột dược liệu
vào. Dàn mỏng bột thật nhanh sau đó đậy lam lên và ép để tạo độ mỏng nhất
định. Tiêu bản để ở nhiệt độ thường cho nguội bớt trước khi đưa lên kính hiển
vi để kiểm nghiệm.
2.2 Kết quả thực nghiệm
2.2.1. Hỉnh ảnh các yếu tố tạp thường gặp trong kiểm nghiêm dược lỉệu
Sau khi kiểm nghiệm các mẫu dược liệu, chúng tôi xin đưa ra hình ảnh và

mô tả các đặc điểm tìm thấy theo cách phân loại ban đầu.
A. Côn trùns
Trong kiểm nghiệm dược liệu ta thường xuyên bắt gặp các loài côn
trùng, bọ cánh cứng nhỏ. Các đặc điểm tìm thấy có thể là hình ảnh toàn bộ cơ
thể côn trùng hay chỉ là 1 phần cấu tạo như chân, râu, cánh, mảnh vỡ đầu,
bụng do các phần khác đã bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản.
^Cánh côn trùng
Cánh côn trùng là phần lồi ra của mảnh bên và mảnh lưng đốt ngực giữa
và đốt ngực sau. Cánh xuất hiện ở côn trùng đã mở rộng phạm vi hoạt động
của chúng. Chức năng của cánh là phát tán, mở rộng phạm vi sinh sống và
điều kiện sinh sống đồng thời còn điều chỉnh thân nhiệt, nhiệt độ trong tổ, tạo
phương tiện tìm kiếm bắt cặp và bảo vệ nhau [18].
Trừ lớp phụ không có cánh và 1 số loài cánh thoái hóa, hầu hết côn trùng
trưởng thành đều có cánh. Cánh 1 số loại côn trùng như muỗi, bướm vàng, bướm
đêm có vảy được xếp thành lớp và rất dễ roi rụng, do vậy nếu dược liệu bị nhiễm
côn trùng thì trong kiểm nghiệm hiển vi rất dễ tìm thấy các đặc điểm này [18] [19].
14
Hình 1: vảy cánh côn trùng
- Hình l.la: vảy cánh bướm dài 0,lmm, hình quạt, có nhiều răng cưa,
cuống dài 0,01mm. Có các đường sọc (song song) trên vảy.
- Hình 1.1 b: Vảy cánh bướm dài khoảng 0,15mm, có cuống ở gốc, phần trên
mở rộng nhưng không xẻ răng cưa. Trên vảy cũng có các vân sọc từ gốc đến
ngọn.
- Hình 1.2: Vảy cánh muỗi có kích thước tương tự như vảy cánh bướm, dài
khoảng 0,1 mm, cũng có cuống và vân sọc trên vảy. Phần trên mở rộng hơn và
không xẻ răng cưa.
^Anten (Râu)
Tất cả các loài côn trùng Có cánh (Pterygota) và côn trùng Không có
cánh (Apterygota) đều có 1 đôi anten ở sát mé trong hoặc phía trước mắt
kép. Anten là đôi phần phụ của 1 trong 3 đốt trước miệng. Anten rất đa

dạng nhưng cấu tạo cơ bản giống nhau, gồm 3 phần, thường gọi là 3 đốt:
Phần thứ nhất gọi là đốt gốc (scape), phần thứ 2 gọi là đốt cuống (pedicel),
phần thứ 3 gọi là roi (Aagellum). Đốt gốc thường dài và mập hơn các đốt
khác, khớp với vỏ hộp sọ. Phần roi thường chia thành nhiều đốt nhỏ, cấu
tạo biến đổi rất đa dạng tùy từng loài.
Kiểu anten thường khác nhau chủ yếu về cấu tạo và hình thái của phần
roi. Cấu tạo và hình dáng của anten rất đa dạng, nhưng ổn định đối với từng
loài, nên thường được dùng làm đặc điểm phân loại quan trọng.
- Hình 2.1 Anten của bọ cánh cứng dạng khúc gãy.
- Hình 2.2: Roi anten, dạng sợi, đốt cuống, đốt gốc bị mất đi trong quá trình
làm tiêu bản.
*Cỡrt trùng
- Hình 2.3: Côn trùng kích thước trung bình, chiều dài 0,17mm, ngang
0,1 Imm, có 3 đôi chân, mình bao phủ bởi 1 lớp lông
15
- Hình 2.4: Động vật thuộc lớp nhện có 4 đôi chân kích thước trung bình,
chiều dài 0,2mm, mình lớn (con cái mang trứng sau khi thụ tinh).
- Hình 2.5: Côn trùng kích thước lớn, dài Imm, bề ngang 0,3mm. Thân chia
làm 3 phần rõ ràng: đầu, ngực, bụng, ở đầu có 1 đôi râu đầu dạng sợi, một đôi
mắt kép. Ngực chia làm 3 đốt, mỗi đốt có một đôi chân, ở phía bên của đốt
ngực giữa và ngực sau có 1- 2 đôi cánh. Có 8- 11 đốt bụng, mỗi đốt có 1 đôi
lỗ thở (trừ 2 đốt cuối cùng). Lỗ sinh dục và hậu môn phát triển ở phía cuối
bụng.
- Hình 3.1; 3.2; 3.3; 3.4: Động vật thuộc lớp nhện có 8 chân, kích thước lớn.
- Hình 4.1: Động vật phía trên có gai màu đỏ hình vương miện, màu đỏ này mất
dần đi trong quá trình bảo quản tiêu bản, chiều dài cơ thể 0,5mm.
- Hình 4.2: Động vật thuộc lớp nhện có 8 đôi chân.
- Hình 4.3: Côn trùng có 3 đôi chân và được bao phủ bcd lớp lông, kích thước
trung bình, chiều dài cơ thể 0,12mm.
*Chán côn trùng

- Hình 5.1; 5.2; 5.5: Các phần khác nhau của chân côn trùng.
- Hình 5.3: Các đốt bàn chân với gai và vuốt.
- Hình 5.4: Chân côn trùng có giác bám, khoảng cách giác bám khoảng
0,02mm.
- Hình 6.1; 6.2; 6.3; 6.4; 6.5; 6.6: Chân nhảy có đốt đùi dài bằng đốt ống.
Chân nhảy là kiểu chân mà phần nhiều chân ngực sau biến hóa thành, nhất là
đốt đùi trở nên to và mập, đốt chày dài, mảnh.
- Hình 6.7: Chân côn trùng, kích thước trung bình 0,15mm.
- Hình 72: Chân côn trùng với đốt bàn lớn, kích thước 0,0 Imm.
- Hình 7.3: Chân côn trùng, kích thước trung bình, đốt đùi bằng đốt ống dài
khoảng 0,2mm. Đốt chậu bị gãy, đốt bàn bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản.
16
1
- Hình 8.5: Chân côn trùng có các đốt bàn kích thước lớn 0,03mm, có gai
vuốt dài.
- Hình 8.6: Chân côn trùng kích thước trung bình, có đốt ống được nối tiếp với
đốt đùi và đốt bàn đã bị mất đi trong quá trình làm tiêu bản.
- Hình 9.1; 92; 9.3; 9.4: ICiểu chân đi và chạy có cấu tạo gồm 5 phần hay 5
đốt: đốt gốc (coxa), đốt chuyển (trochanter), đốt đùi (femur), đốt ống (tibia)
và đốt bàn (tarsus). Đốt chuyển và đốt bàn thường gồm nhiều đốt nhỏ.
- Hình 9.5: ơiân côn trùng gồm nhiều đốt bàn. Đốt đùi và đốt ống bị mất đi
trong quá trình làm tiêu bản.
*Đầu côn trùng
- Hình 10.1: Đầu côn trùng, kích thước lớn. Đầu là phần trước của cơ thể côn
trùng. Đầu côn trùng điển hình mang một cặp râu, một cặp mắt kép, một hay
nhiều mắt đơn, miệng và chi phụ miệng.
*Trứng và nhộng
Mỗi loại côn trùng có biến thái hoàn toàn, tức là biến thái trong thời kì
hậu phôi trải qua 3 giai đoạn chính: ấu trùng, nhộng và thành trùng. Do vậy
khi kiểm nghiệm dược liệu bị nhiễm côn trùng thì việc bắt gặp côn trùng ở các

giai đoạn phát triển khác nhau là hoàn toàn có thể. Tuy nhiên, trong kiểm
nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, trứng, ấu trùng (sâu non) và
nhộng thường bị bỏ qua do hình dạng không đặc trưng, mà chỉ chú ý đến côn
trùng ở giai đoạn phát triển cuối cùng là dạng thành trùng.
- Hình 10.2: Sâu non thoát trứng. Trứng kích thước nhỏ, chiều dài 0,05mm,
bề ngang 0,025mm. Hình ảnh đối xứng 2 bên. Sau khi hoàn thành giai đoạn
phát triển phôi, sâu non phá vỡ vỏ trứng chui ra ngoài. Quá trình này được gọi
là trứng nở. Trứng nở rất đa dạng, có loài chỉ đơn giản là do hoạt động của sâu
/ ế '
17
non bên trong làm cho vỏ trứng bị nứt ở phía trước của trứng. Một số loài khác
trứng có nắp và dễ dàng bị bật ra do hoạt động của sâu non. Một số loài lại
dùng hàm làm rách vỏ trứng chui ra.
- Hình 103: Trứng côn trùng, hình elip, kích thước lớn, chiều dài 0,3mm,
chiều ngang 0,15mm. Hình dạng trứng rất phong phú và phụ thuộc vào từng
loài côn trùng. Trứng có thể hình tròn, ovan, elip, bán cầu hay trái thận.
- Hình 10.4: Côn trùng ở giai đoạn phát triển nhộng, màu vàng đậm đến
nâu, kích thước lớn, dài 0,8mm, rộng 0,4mm.
- Hình 10.5: Côn trùng ở giai đoạn phát triển nhộng, phần kén kéo dài gấp
đôi chiều dài nhộng. Nhộng sống được là nhờ chất dinh dưỡng đã dự trữ từ
giai đoạn sâu non. Bề ngoài tuy không giống thành trùng nhưng nhộng có
nhiều dấu hiệu của thành trùng như mầm cánh, chân, râu, mắt. Trước khi làm
nhộng, sâu non đã đẫy sức, thường làm cho mình một cái tổ gọi là kén. Kén
có thể được làm bằng sợi tơ do tuyến tơ ở môi dưói tiết ra, hoặc bằng mảnh
vụn thức ăn, cành lá khô và chất do tuyến tơ tiết ra dệt thành.
* Ngoài ra, trong quá trình kiểm nghiệm chúng tôi còn phát hiện ra một
số yếu tố lạ khác có đặc điểm động vật {hình 11, hình 12, hình 13, hình 14).
Đặc biệt:
- Hình 11.5: Gốc hình ÙTỊ, có nhiều gai hướng ra phía ngoài, kích thước nhỏ.
- Hình 12.2: Màng bao trong suốt, kích thước 0,017mm, có lông dài gắn

trên màng bao.
- Hình 13.4; 13.5: Một phần cơ thể động vật có các tế bào xếp đều nhau.
❖ Nhận xét - Bàn luận
Các đặc điểm tìm thấy như chân, vảy, cánh, râu, đầu hay mảnh vỡ cơ thể
là cơ sở để xác định yếu tố nhiễm thuộc côn trùng. Đặc biệt, các đặc điểm
chân và râu đôi lúc được coi như là yếu tố quyết định trong nhận dạng côn
18
trùng, góp phần nghiên cứu và đưa ra cách thức bảo quản dược liệu đạt hiệu
quả cao.
Tuy nhiên việc tìm thấy các đặc điểm này cũng chưa hoàn toàn đánh giá
được chất lượng dược liệu. Cần có nghiên cứu kỹ hơn để đưa ra tiêu chuẩn về
tạp cho kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi. Nói cách khác,
chúng ta không chỉ định tính (phát hiện các yếu tố tạp) mà còn cần nghiên cứu
sâu hơn nhằm tìm ra phương pháp định lượng (xác định số lượng) các yếu tố
tạp này trong một lượng dược liệu nhất định.
Chúng tôi bước đầu đề xuất kỹ thuật thiết lập tiêu chuẩn về tạp trong
dược liệu như sau: Cân chính xác a (g) bột dược liệu, hoà vào b (ml) nước, tiếp
đó lấy chính xác 1 thể tích nhất định kiểm nghiệm trên kính hiển vi với bảng
đếm trên vi trường. Quan sát và đếm các đặc điểm lạ trên vi trường. Số lượng
các đặc điểm tìm thấy trên vi trường được coi như là tiêu chuẩn kiểm nghiệm
dược liệu.
Khi kiểm nghiệm 1 dược liệu bất kỳ, kết quả tìm thấy được so sánh với
số lượng đặc điểm tạp theo tiêu chuẩn. Nếu số lượng đặc điểm tạp tìm thấy
trong mẫu dược liệu nhiều hơn so với tiêu chuẩn đề ra thì dược liệu đó không
đạt yêu cầu trong sử dụng. Ngược lại, nếu số lượng tạp tìm được nhỏ hcfn hoặc
bằng vói tiêu chuẩn đề ra thì dược liệu đó được coi như đạt tiêu chuẩn về mặt
nhiễm tạp.
19
Hình 1: l.Vảy cánh bướm
2.Vảy cánh muỗi

Hình 2: l,2.Râu côn trùng
3,4,5.Côn trùng
20
; . *-=5£J^ : - . .
^C?r •' — , ỉ -
z ^ ' ^ : .: .i ^ f í - r é ' ' ị
]ÌKÍ^K
Hình 3: Động vật lớp nhện
^1-
ì
ề
%
''? Ị
x ^ -
■^ \ J,
ĩS->,
r - ^
3 ' %
Hình 4:1 .Động vật có gai màu đỏ
2,3.Côn trung
21
Hình 5: Một số bộ phận của côn trùng
Hình 6: Một số bộ phận của côn trùng
22