Nghiên cứu áp dụng phương pháp anthrone để xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN MAI LINH
NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ANTHRONE ĐỂ XÁC
ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOGEN TRONG GAN CHUỘT
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHÓA 2001-2006)
Người hướng dẫn: Ths.Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện:
Thời gian:
Bộ môn Hóa sinh
Trường Đại Học Dược Hà Nội
Tháng 05/2005 đến 05/2006
Hà Nội, tháng 05 năm 2006.
_
_
LỜI CẢM ƠN
Tôi xỉn bày tỏ lời cảm ơn chân thành tói Thạc sĩ Phùng Thanh
Hương - Giảng viên bộ môn Hóa sinh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và làm khóa luận.
Tôi xỉn gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô đã cho tôi những
kiến thức quý báu trong thời gian học tâp tại trường. Tôi cũng xin cảm ơn
sự giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi của các thầy cô và các
kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Dược Hà Nội dành cho
tôi trong qúa trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân và
bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôỉ trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên: Nguyễn Mai Lỉnh
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ

1
PHẦNI TỔNG QUAN 3
1.1 GLYCOGEN 3
1.1.1 Cấu trúc 4
1.1.2 Chức năng 4
1.1.3 Tính chất 4
1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật 5
1.2 NHỮNG BÁT THƯỜNG TRONG CHỮYEN HÓA GLYCOGEN 10
1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCOGEN 15
1.3.1 Phương pháp tách glycogen ra khỏi mô để định lượng 15
1.3.2 Định lượng trực tiếp glycogen trong mô 17
PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

20
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20
2.1.2 Hóachất7 T 20
2.1.3 Máy móc thí nghiệm
21
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 21
2.2 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

24
2.2.1 Xây dựng đường chuẩn giữa nồng độ glucose và mật độ quang24
2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng glycogen trong mô gan chuột 25
2.2.3 So sánh với phương pháp chiết tách glycogen bằng kiềm :

29
2.2.4 Xác định tính lặp lại của phương pháp 30
2.2.5 Xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột bình thường 32

2.2.6 Xem xét mức độ tổng họp glycogen từ glucose ngoại sinh

32
2.3 BÀN LUẬN


.
7.

.7.

34
PHẦN III KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
DANH SÁCH NHỮNG CHỮ VIÉT TẮT
GIP
Glucose - 1 - phosphat
G6P
Glucose - 6 - phosphat
TCA
Acid tricloacetic
TPNH
Dạng khử của triphosphopyridin nucleotid
TPN^
Dạng oxy hóa của triphosphopyridin nucleotid
UDPG
Uridine diphosphate glucose
ƯTP
Uridine triphosphate
ĐẶT VẤN ĐÈ
•

Hiện nay bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid ngày càng phát
triển, trong đó bệnh đái tháo đường đang ở giai đoạn bùng nổ dịch tễ trên
phạm vi toàn cầu. Để chẩn đoán và đánh giá hiệu quả điều trị của những bệnh
này, cần phải phân tích được các chỉ số hóa sinh liên quan.
Glycogen là dạng dự trữ chính của glucid ở hầu hết mọi tế bào. ở gan, sự
thoái hóa glycogen không chỉ để cung cấp glucose cho bản thân tổ chức này
mà còn tạo một lượng lớn glucose cung cấp cho máu ngoại biên đi nuôi các tổ
chức khác. Vì vậy, ngoài vai trò dự trữ, glycogen ở gan còn có ý nghĩa quan
trọng trong điều hòa đường huyết, ở tổ chức cơ, khi tế bào phải hoạt động
mạnh và kéo dài, sự tiêu hao năng lượng đòi hỏi phải được cung cấp một
lượng lớn glucose. Ngoài nguồn glucose do máu mang đến, glycogen dự trữ ở
cơ phải được thoái hoá rất mạnh để tạo thành glucose cho quá trình đốt cháy ở
cơ [2,5]. Do đó glycogen là một chỉ số hóa sinh quan trọng, đánh giá được
hàm lượng glycogen là một chỉ tiêu trong quá trình chẩn đoán những bệnh
liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid, đặc biệt là những bệnh rối loạn dự
trữ glycogen.
Mặt khác việc nghiên cứu các thuốc điều trị ngày càng trở nên cấp
thiết. Muốn đánh giá hiệu quả, tìm hiểu tác dụng cũng như cơ chế của những
thuốc đã, đang và sẽ sử dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển
hóa glucid, việc xác định các chỉ số hóa sinh liên quan là rất cần thiết. Trong
đó glycogen là một chỉ số hóa sinh thể hiện mức độ dự trữ glucid ở các tổ
chức trong cơ thể. Thực tế cho thấy rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới
về cơ chế và tác dụng của những thuốc tác động trên chuyển hóa glucid như :
đái tháo đường, bệnh dự trữ glycogen đã tập trung tìm hiểu tác động lên
mức độ dự trữ, tổng hợp và thoái hóa glycogen[37,38].
Hiện tại ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến vấn đề này . Với
mong muốn tìm được một phương pháp định lượng glycogen trong mô gan dễ
thực hiện, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nước ta để làm cơ sở cho những
nghiên cứu và chẩn đoán, chúng tôi tiến hành đề tài với những mục tiêu sau :
1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình định lượng glycogen

theo phương pháp Anthrone.
2. Lựa chọn được một quy trình định lượng glycogen hợp lý.
3. Ảp dụng quy trình đã lựa chọn để xác định hàm lượng glycogen ở
gan của chuột bình thường khi đỏi và sau khi uống glucose.
PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 GLYCOGEN.
Glycogen là một polysaccharid, dạng dự trữ cơ bản của glucose trong tế
bào động vật. Glycogen được tìm thấy dưới dạng các hạt nhỏ, phân bố khắp
nơi trong nguyên sinh chất của tế bào động vật. xế bào gan chứa hàm lượng
glycogen cao nhất ( 6-8% khối lượng tươi), ở cơ, glycogen có hàm lượng
thấp hơn ( 1% khối lượng cơ), nhưng tổng lượng glycogen trong cơ cao hơn ở
gan do khối lưọng cơ chiếm một phần đáng kể trong cơ thể. Một lượng nhỏ
glycogen được tìm thấy ở thận, và lượng nhỏ hơn nữa được tìm thấy ở tế bào
thần kinh não và bạch cầu.
Ngoài ra glycogen còn được tìm thấy trong thực vật, nấm mốc và nấm men
bia. [32,1,2]
G ỉycoge n
Hình 1: Một đoạn phân tử glycogen
1.1.1 cấu trúc
Mỗi phân tử glycogen là một polymer gồm khoảng 10000 tới 120000 gốc
a - glucose liên kết với nhau. Phân tử glycogen có nhiều mạch nhánh, mỗi
nhánh gồm khoảng 1 đến 12 đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết a
(1-^4) glycosid trong mạch và các liên kết a (1—>6) glycosid ở điểm nhánh.
Trọng lượng phân tử từ 2,7.10^ - 3,5.10^ dalton. [32,1]
c HsO« CHjOM
H J
-
0. H H ,.ị

0, H

H ổH H 0H I
OH CHjCtH éẻ»
glycogen
CHjCtH i CHj CH^DH CHjOH
ị

0 H H 4|—

'0 H H J— o H M J— 0 H
8h ^ 0^
N OH ả" OH M OH H OH
4^o„
ŨH
Hình 2: cấu trúc phân tử glycogen
1.1.2 Chức năng
Glycogen là dạng dự trữ để sẵn sàng biến đổi thành glucose, nguồn
năng lượng cơ bản cung cấp cho mọi hoạt động của tế bào khi cần thiết.
Glycogen có nhiều ở gan và cơ, với 2 chức năng cơ bản đặc trưng cho từng
loại tổ chức, ở cơ, glycogen được sử dụng như một nguồn nhiên liệu ( nguồn
cung cấp adenosin triphosphat ATP) cho quá trình co cơ. ở gan, glycogen
giữ vai trò duy trì hằng định nồng độ glucose trong máu. Khi dư thừa năng
lượng (sau bữa ăn), gan thu lượm glucose và các chất dinh dưỡng để tổng
họp thành glycogen dự trữ. Ngược lại, khi đường huyết thấp, gan chuyển
glycogen thành glucose. Vì vậy glucose luôn sẵn có để cung cấp cho các mô
không có khả năng tổng hợp carbonhydrat như não, cơ, hồng cầu và để điều
hòa glucose trong máu [2,5,17]:.
1.1.3 Tính chất
- Glycogen tan trong nước, không tan trong ethanol.
- Dạng bột trắng có [a] : +196° tới +197°.
- Không phản ứng với dung dịch Fehling, phản ứng với lod tạo sản

phẩm có mầu từ nâu đến tím. [32]
1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật.
1.1.4.1 Thoái hóa glycogen [2,5,23].
Quá trình thoái hóa glycogen bao gồm những giai đoạn như sau :
*Giai đoan cắt mach thẳng:
Glycogen phosphorylase xúc tác phản ứng cắt gốc glucose tận cùng ở đầu
không khử của mạch thẳng glycogen:
Glycogen (n mắt xích) + Pi ^ Glycogen ( n . 1 m ắ t x í c h ) + GIP
Phản ứng xảy ra tương tự như phản ứng thủy phân cắt liên kết a (1-^4)
glycosid với sự tham gia của phosphat vô cơ (Pi) tạo thành a-D-glucose-1-
phosphat và phân tử glycogen mất một gốc glucose. Quá trình này được lặp
lại nhiều lần, tách dần từng gốc glucose dưới dạng a-D-glucose-l-phosphat
cho tới khi mạch đang thoái hoá còn 4 đơn vị glucose tại điểm nhánh a (1-^6)
thì dừng lại.
*Giai đoan cắt mach nhánh : Giai đoạn này có sự tham gia của enzym
cắt nhánh (debranching enzyme) với 2 hoạt tính:
• Oligo a (1—>6) -a (1—>4) glucan transferase: chức năng vận chuyển
một chuỗi 3 gốc glucose từ nhánh tới một đầu không khử của một
nhánh khác cạnh nó và gắn lại bằng liên kết a (1—>4) glycosid.
• a (1—>6) glucosidase: (chức năng cắt nhánh) cắt gốc glucose còn lại tại
điểm nhánh a (1-^6), giải phóng glucose dưới dạng tự do.
Phản ứng cắt nhánh cho phép enzym glycogen phosphorylase tiếp tục hoạt
động để đi đến thoái hóa hoàn toàn phân tử glycogen .
1
Ufen k é t ÍX> ịiA i
a ««s * ĩ -OÍ'i<^ii iit^»i:.t:
■■ o <
Oeí %ợo /n > S
* •
m

.
m

< i i
.
€ i

<II>
1
ịỉiycữii^rì p#>0 Sjsỉ?i^'ytà«e
Hình 3: Thoái hóa glycogen
*Giai đoan biến đồi glucose-l-phosphat (GIP) thành glucose
ở các tổ chức, GIP được đồng phân hóa để tạo GÓP nhờ enzym
phosphoglucomutase. Đây là phản ứng thuận nghịch :
Erư^me-SmOPO^
Enr^tne-S^MC^H
Enrrme-Ser-OPO/“
H m
glucore«! "phosphate gíuco$e-6-pỉiCỊsphate
Hình 4: Phản ứng biến đổi GIP GÓP
ở gan và thận có một enzym đặc biệt glucose-6-phosphatase có khả năng
thủy phân gốc phosphat của GÓP tạo glucose tự do đi vào máu để tới các tế
bào của tổ chức.
1.1.4.2 Tổng hợp glycogen [2,5,23]
Quá trình tổng hợp glycogen xảy ra ở mọi tổ chức nhưng mạnh nhất ở gan
và xương. Quá trình tổng hợp glycogen bắt đầu từ nguyên liệu GÓP, sản phẩm
do phản ứng phosphoryl hóa glucose xúc tác bởi hexokinase (ở cơ) và glucose
kinase (ở gan) tạo thành .
D-glucose + ATP ^ D-glucose - 6 - phosphat + ADP
Mặt khác một phần lớn GÓP là sản phẩm của con đường tân tạo glucose ở

gan. G6P được đồng phân hóa thuận nghịch thành GIP nhờ
phosphoglucomutase:
Glucose - 6 - phosphat Glucose - 1 - phosphat
Tiếp theo là phản ứng then chốt nhất trong quá trình tổng họp glycogen:
phản ứng tạo UDP- glucose (UDPG) xúc tác bởi UDPG pyrophosphorylase:
UTP + Glucose - 1 - phosphat ^ UDP- glucose + PPi
Phản ứng này xảy ra theo chiều tạo UDPG vì pyrophosphat bị thủy phân
rất nhanh thành orto phosphat nhờ pyrophosphatase.
Ư D P -G lucose Pỵrophosp ho rỹlase
Hình 5: Phản ứng tạo UDPG
UDPG là “chất cho” gốc glucose trong quá trình tổng họp glycogen dưới
tác dụng của glycogen synthase. Đến đây có thể xảy ra hai trường hợp:
•Trường hợp có sẵn chuỗi glucan
Enzym glycogen synthase: xúc tác việc chuyển gốc glycosyl từ UDPG tới
gắn vào đầu không khử (C4) của một phân tử glycogen gồm n gốc glucose có
sẵn để tạo thêm một liên kết mới a (1-^4) glycosid, nghĩa là tạo thành
glycogen có n +1 gốc glucose.
glycogen („ gốc) + UDP-glucose -> glycogen („+1 góc) + UDP
Khi tạo được thêm ít nhất 6 gốc glucose, enzym gắn nhánh : amylo(1^4 -
1—>6) - transglycosylase hay glycosyl (4 ^ 6 ) - transferase có tác dụng vừa
cắt đứt liên kết a (1^4) glycosid của đoạn glycogen vừa mới tạo ra, vừa
chuyển đến gắn vào OH ở C6 của gốc glucose trên cùng một chuỗi hay một
chuỗi khác tạo ra một điểm nhánh mới a (1^6) glycosid trong quá trình tổng
họp glycogen .(Hình 6)
Sau đó mạch nhánh mới tạo thành lại được kéo dài ra nhờ tác dụng của
glycogen synthase dẫn đến tạo các liên kết mới a (1^4) glycosid. Quá trình
trên được lặp lại nhiều lần làm cho số lượng mạch nhánh tăng lên dần cho đến
khi đạt được một phân tử glycogen có cấu trúc phù hợp với nhu cầu.
Tác dụng sinh học của sự gắn nhánh là làm cho phân tử glycogen dễ tan
hơn và số đầu không khử tăng lên, do đó phản ứng được nhiều hon với

glycogen phosphoĩylase và glycogen synthase.
8
*JOf» < >
"À
UOí»
< > <"">
•€> <z> o> o <:> <::> o c> o o o o <r> o c>
í«kí>«<»>ỵc &*VÍ1».S>«
o
o
< , '
c>
o
< > 'C :> < > 'C > < >
Ol-YCOOEN
Hình 6: Quá trình sinh tổng hợp glycogen
• Trưòng hợp không có sẵn chuỗi glucan (ở thời điểm xa bữa ăn khoảng
18-24 giờ, toàn bộ glycogen dự trữ đã được tiêu thụ hết);
Mở đầu cho quá trình tổng họp glycogen cần phải có một chất mồi protein gọi
là glycogenin ( M - 37284) : chất này được tìm thấy ở đầu khử của các phân
tử glycogen . Quá trình tổng hợp diễn biến theo 5 giai đoạn:
Giai đoan 1: một gốc glucose từ UDPG gắn vào gốc Tyr 194 của glycogenin
nhờ xúc tác của protein-tyrosin -glucosyl transferase.
Giai đoan 2: tạo phức hợp của glycogenin đã gắn glucose với glycogen
synthase theo tỉ lệ 1:1.
Giai đoan3:kéo dài chuỗi glucan tới khi chuỗi gồm 7 gốc glucose hay nhiều
hơn. Mỗi gốc glucose mới gắn vào đều đi từ ƯDPG và đó là những phản ứng
tự xúc tác thông qua glucosyl transferase của glycogenin.
Giai đoan4: Glycogen synthase tách dần khỏi glycogenin.
Giai áoan5: Hoàn thành phân tử glycogen nhờ phối hợp tác dụng của

glycogen synthase và enzym gắn nhánh (glycogen branching enzyme). Cuối
cùng, glycogenin vẫn gắn vào một đầu của phân tử glycogen đã được tạo
thành.
1.2 NHỮNG BẤT THƯỜNG TRONG CHUYỂN HÓA GLYCOGEN
Những bất thường trong chuyển hóa glycogen được coi là bệnh về dự trữ
glycogen, do di truyền khuyết thiếu hoặc sai lệch cấu trúc enzym tham gia
chuyển hóa glycogen. Sự thiếu hụt enzym dẫn đến những bất thường về cấu
trúc hoặc hàm lượng glycogen trong các tổ chức.
Gl^pgl
Lysosom e
V -
Kìnast
Glycogen and IX.
Branching P h o s p h o is e (GSD Vỉ: «a n
Phosphorylase ịO SŨ V) cơ
'Bểbmnéĩi n
trong gan
Glticose^B-Phosphata $e
(GSD I)
Gkicose-6-Phosphâte
ĩrânsporler CGSD ỈB|
Glucose
I
Pho s phogìy comulase
> f
• Gìmm^S*P
- 1 - ^
Fnictose-4#
A
máu

Hình 7: Vị trí các enzym liên quan đến các typ bệnh dự trữ glycogen
Sự thiếu hụt một enzym chuyển hóa glycogen ảnh hưởng chủ yếu đến dự trữ
glycogen tại gan với biểu hiện quan trọng nhất là hạ đưòng huyết, do không
10
huy động được glucose vào máu khi đói. ở tổ chức cơ, vì không thể cung cấp
đủ glucose cho quá trình đốt cháy tạo năng lượng dẫn đến khó vận động và
tập luyện [7,14].
Những ảnh hưởng cụ thể phụ thuộc vào từng loại enzym riêng. Bệnh lí về
dự trữ glycogen được chia thành những typ bệnh sau;
Typ 0: Thiếu hụt enzym tổng hợp glycogen tại gan (glycogen synthase):
Kết quả là giảm dự trữ glycogen tại gan và dẫn đến tình trạng hạ đường
huyết lúc đói và tăng đường huyết sau bữa ăn. Bệnh thường xuất hiện ở trẻ
nhỏ và trẻ sơ sinh với các biểu hiện; hạ đường huyết mạnh đi kèm với nhiễm
xeton. Mặc dù ăn vào sẽ làm giảm nhẹ các triệu chứng, nhưng dẫn đến kết
quả là tăng đường máu và acid lactic máu sau bữa ăn. ở bệnh nhân typ 0,
trạng thái hạ đường huyết xảy ra trong vòng vài giờ sau bữa ăn vì dự trữ
glycogen gan và con đường tân tạo đường không đủ duy trì đường huyết bình
thưòng. Tăng đường huyết và mức lactac máu sau khi ăn là do con đường
tổng hợp glycogen bị giới hạn, nên quá thừa glucose sẽ ưu tiên chuyển thành
lactac bởi con đưòng đường phân.[7,l 1]
Typ I : Bệnh Von Gierkes do thiếu hụt enzym glucose-6-phosphatase:
Glucose - 6 - phosphatase là enzym xúc tác cho phản ứng cắt nhóm
phosphat của G6P để giải phóng glucose tự do giúp duy trì đường huyết bình
thường. Bệnh nhân mắc chứng bệnh này không có khả năng giải phóng
glucose từ glycogen, dẫn đến không thể duy trì hàm lượng glucose trong máu
trong vòng vài giờ sau bữa ăn, vì vậy sẽ bị hạ đường huyết. Mức đưòng huyết
thấp sẽ gây ra chứng đói mãn tính, mệt mỏi và dễ nổi cáu, đặc biệt ở trẻ nhỏ.
Những bệnh nhân typ I có khả năng dự trữ glucose dưới dạng glycogen,
nhưng không thể thoái hóa glycogen tạo glucose như bình thường. Vì vậy để
điều hòa đưòtig huyết, các hormon, acid lactic, triglycerid tăng lên trong

máu. Chất béo cũng được dự trữ trong gan cùng với glycogen làm cho gan to
lên [11,14].
11
Typ II: Bệnh Pompe do thiếu hụt acid Maltase (enzym acid alpha-1,4-
glucosidase): Pompe là người đầu tiên mô tả bệnh này khi ông pháp hiện ra
một bé gái 7 tháng tuổi bị chết sau cơn cơ tim to tự phát.
Acid alpha-glucosidase là một enzym thủy phân của lysosom, cần thiết để
thoái hóa một phần nhỏ (1-3%) glycogen trong tế bào . Vì thế con đường
thoái hóa chính của glycogen ít bị ảnh hưởng ở typ II, cấu trúc glycogen
không bị bất thường và tình trạng hạ đường huyết không xảy ra. Tuy nhiên,
thiếu hoạt động của enzym này sẽ gây ra sự tích tụ glycogen trong lysosom và
tế bào chất. Sự tích tụ này có thể làm ảnh hưởng đến những chức năng thông
thường khác của tế bào dẫn tới tổn thương tế bào, và gây ra rối loạn toàn bộ tổ
chức, làm cho các cơ quan này to hơn bình thường . Những cơ quan hay bị
tổn thương nhất trong typ bệnh này là tim, xương và cơ hô hấp [12,30],
Typ III: Bệnh Cori do thiếu hụt enzym cắt nhánh :
Năm 1928, Snappes và van Creveld đã mô tả 2 bệnh nhân mắc bệnh này .
Cả 2 bệnh nhân đều có triệu chứng gan to và giảm khả năng huy động
glycogen dự trữ trong gan. Năm 1953, Forbes mô tả trường họp thứ ba mắc
bệnh và thấy rằng glycogen trong cả gan và cơ đều có cấu trúc không bình
thưÒTig. Illingworth và Cori tách glycogen từ mô ra và phát hiện thấy phân tử
glycogen này có mạch nhánh phía ngoài cực ngắn. Cori đặt tên cấu trúc này
là 1 dextrin giới hạn, và ông đã dự đoán nguyên nhân là do thiếu enzym cắt
nhánh. Năm 1964 van Creveld với sự giúp đỡ của Huijing đã chứng minh
được sự thiếu hoạt động của enzym cắt nhánh glycogen ở những bệnh nhân
này[8].
Hạ đường huyết là triệu chứng lâm sàng cơ bản của typ III. Đó là kết quả
của sự thiếu phân hủy glycogen do thiếu enzym cắt nhánh. Vì vậy chỉ có một
phần nhỏ glucose được tách ra, bệnh nhân gặp phải các cơn hạ đường huyết
ngay cả sau bữa ăn nhẹ. Các chỉ số hóa sinh trong máu thay đổi như: đường

huyết thấp, tăng cao hàm lượng glycogen trong hồng cầu, tăng các loại lipid.
12
Sinh thiết gan thấy tăng cao hàm lượng glycogen có cấu trúc bất thường và
thiếu enzym cắt nhánh. Sinh thiết cơ thấy lắng đọng glycogen có cấu trúc bất
thường[7,14].
Để điều trị bệnh typ này thì việc ăn thường xuyên và chế độ ăn giầu
protein là cần thiết [14].
Typ IV : Bệnh Andersen do thiếu hụt enzym gắn nhánh :
Chức năng của enzym gắn nhánh là tạo ra các điểm nhánh tự nhiên
trên phân tử glycogen trong suốt quá trình tổng họp glycogen. Những điểm
nhánh này rất quan trọng đối với cấu trúc vững chắc và khả năng hòa tan
trong tế bào của phân tử glycogen. Thiếu enzym này làm cho phân tử
glycogen có chiều dài bất thường, có ít nhánh hơn vì vậy phân tử glycogen có
cấu trúc giống với amilopectin.
Sự có mặt của glycogen không thể hòa tan gây ra phản ứng lạ đối với
cơ thể dẫn đến tổn thương tế bào và rối loạn chức năng của các tổ chức, ở typ
bệnh này, triệu chứng hạ đường huyết không phải là biểu hiện chủ yếu. Bệnh
nhân mắc bệnh này có những rối loại tại gan, sau đó tiến triển thành xơ gan,
tăng huyết áp tĩnh mạch cửa là đặc trưng của typ bệnh này. Những biến
chứng về tim có thể gây ra giãn cơ tim, làm tổn thương tim. ở hệ thần kinh,
giycogen bất thường có thể làm suy yếu khả năng nhận thức và rối loạn cả
thần kinh cơ và thần kinh nội tạng [3,7].
Typ V: Bệnh McArdle do thiếu enzym phosphorylase cơ:
Bệnh McArdle là do thiếu enzym phosphorylase cơ (alpha-1,4-glucan
orthophosphate glucosyl transferase ), làm cho cơ không có khả năng giải
phóng glucose từ glycogen.
Năm 1951, McArdle đã phát hiện 1 phụ nữ 30 tuổi phải chịu đựng
những cơn đau sau khi tập luyện. Mức lactac trong máu tĩnh mạch của bệnh
nhân này tăng sau khi bị chứng thiếu máu cục bộ do hoạt động. Năm 1959
Schmid và Mahler đã chứng minh được sự thiếu hoạt động của enzym

13
phosphorylase cơ ở một bệnh nhân nữ 52 tuổi. Những đặc trưng của typ bệnh
này được McArdle mô tả bao gồm: không chịu được tập luyện vì chứng đau
cơ, mau mệt mỏi, co cứng cơ khi tập luyện, và tình trạng đau sẽ giảm khi
nghỉ ngơi. Cơ vận động là nhờ vào glucose lấy từ sự phân hủy glycogen do
phosphorylase. Glucose chuyển thành ATP nhờ con đường đường phân. Các
triệu chứng xuất hiện ở typ bệnh này là do không sử dụng được nguồn năng
lượng từ glycogen của cơ. Khoảng một nửa số bệnh nhân phải chịu cơn hoại
tử cơ cấp sau khi tập luyện mạnh. [7,8,14]
Typ VI :Bệnh Hers do thiếu enzym phosphoĩylase gan:
Enzym phosphorylase giữ vai trò quan trọng giúp thoái hóa glycogen
thành glucose. Nếu thiếu enzym này ở gan, glycogen không thể thoái hóa
được thành glucose, và lắng đọng glycogen ở gan làm gan to. ở hầu hết
những bệnh nhân mắc typ bệnh này, enzym khuyết thiếu không hoàn toàn và
sự hình thành glucose vẫn diễn ra. Các triệu chứng lâm sàng của typ bệnh này
tương tự với typ I nhưng nhẹ hơn. Gan có kích thước rất lớn , và hạ đường
huyết nhẹ là những biểu hiện chính [12].
Typ VII: Bệnh Tarui do thiếu enzym phosphofructokinase cơ :
Enzym phosphofructokinase cần thiết để thoái hóa glycogen tạo năng
lượng cho hoạt động của cơ. Bệnh nhân mắc typ bệnh này là do thiếu một
lượng phosphofructokinase ở mô cơ. Thiếu enzym này ảnh hưởng đến quá
trình thoái hóa của glycogen, dẫn đến không cung cấp đủ năng lượng cho cơ
hoạt động bằng con đường thoái hóa glycogen. Bệnh nhân phải chịu những
cơn đau cơ và mệt mỏi khi tập luyện vì suy nhược cơ khi nỗ lực thu năng
lượng. Vì vậy gây ra chứng đau cơ, mỏi cơ, và co cứng cơ[35].
Typ IX: Thiếu hụt enzym phosphorylase kinase:
Bệnh nhân mắc typ bệnh này là do thiếu enzym phosphorylase kinase.
Enzym này điều khiển quá trình thoái hóa glycogen, vì vậy thiếu enzym này
gây lắng đọng glycogen. Những triệu chứng lâm sàng của typ này tương tự
14

với typ VI. Biệu hiện chung là gan to, chậm phát triển cơ vận động, tăng lipid
máu. Mọi triệu chứng đó thường được cải thiện. Phosphoiylase kinase là một
enzym hỗn hợp. Vài typ bệnh do thiếu enzym này đã được xác định, tùy vào
vị trí mô bị thiếu enzym này mà typ bệnh tương ứng là :typ VIII, typ IX, typ
X [15] (hình 7).
1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCOGEN
Cho đến nay các phương pháp định lượng glycogen được chia làm hai
hướng chính là: tách riêng glycogen khỏi mô để định lượng hoặc định lượng
glycogen trực tiếp trong mô.
1.3.1 Phương pháp tách glycogen ra khỏi mô để định lượng
Quy trình chung:
Phá vỡ tổ chức

► Tách glycogen khỏi dịch chiết
mô (1) (2)
Định lượng
’ (3 )’
(1). Phá vỡ tồ chức mô:
Có 2 phương pháp hay được áp dụng là đun sôi mô trong kiềm đặc và nghiền
đồng thể mô với acid tricloacetic.
- Phương pháp thứ nhất (thuỷ phân mô trong kiềm đặc, phương pháp
kinh điển của Pflüger), ưu điểm của phương pháp đun sôi mô trong kiềm đặc
là tổ chức mô được phá vỡ hoàn toàn bằng hóa chất, vì vậy có thể lấy được tất
cả glycogen ra dịch chiết mô. Nhưng nhược điểm của phương pháp này là
không loại bỏ được protein ra khỏi dịch chiết mô. Kết tủa glycogen thu được
có màu nâu nên ảnh hưởng đến màu thực nếu dùng phương pháp so màu. [25]
- Với phương pháp thứ hai (nghiền đồng thể mô với acid tricloacetic)
phương pháp này có ưu điểm là loại bỏ được protein ra khỏi dịch chiết mô.
15
Kết tủa glycogen thu được có màu trắng không làm ảnh hưỏng đến phản ứng

lên màu sau đó. Nhưng phương pháp này có nhược điểm là tổ chức mô khó
được phá vỡ hoàn toàn vì vậy khó lấy được toàn bộ glycogen ra. Quá trình
nghiền phải được thực hiện nhiều lần.[6].Có thể dùng nhiều hóa chất khác để
loại tạp protein thay cho acid tricloacetic như acid perchloric[25], thủy ngân
nitrat[10]
(2).Tách và tinh chế glycogen từ dich chiết mô:
- Ethanol là dung môi làm kết tủa glycogen vì vậy được lựa chọn để tách
glycogen ra khỏi dịch chiết mô. Ngoài ethanol ra có thể lựa chọn dung môi
khác như methanol. Để kết tủa được triệt để và nhanh hơn nhiều tác giả đề
xuất sử dụng thêm NaCl hoặc LiCl [25],
- Để tinh chế glycogen thu được, có thể dùng nước cất hoà tan glycogen và
cho kết tủa lại bằng ethanol, lặp lại nhiều lần. Good và cộng sự trong nghiên
cứu năm 1932 đã sử dụng than hoạt để tinh chế glycogen[10].
(3). Định lương glycogen sau khi đươc tách ra: Glycogen thu được có
thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau.
a. Glycogen được thuỷ phân thành glucose rồi định lượng glucose bằng
các thuốc thử khác nhau:
- Dùng thuốc thử Anthrone [25, 6]: Nguyên tắc của phương pháp là
glycogen được thuỷ phân thành glucose trong acid sulíìiric đặc ở nhiệt độ cao,
và phản ứng lên màu với thuốc thử anthrone. Đo quang ở bước sóng 620nm.
- Dùng thuốc thử : glycogen cũng được thủy phân thành glucose và sau
đó glucose sẽ phản ứng với tạo màu.
- Dùng các thuốc thử khác như diphenylamin, phenol,
b. Định lượng trực tiếp glycogen bằng thuốc thửlod:
Dựa vào tính chất của glycogen cho sản phẩm mầu nâu đỏ khi phản ứng với
lod. Dùng phép so màu để định lượng glycogen. Nhưng theo Daniel Luzon
Moris, phương pháp này khó ổn định vì màu của phản ứng thu được phụ
16
thuộc không chỉ vào hàm lượng glycogen mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ tiến
hành phản ứng, hàm lượng lod và thậm chí phụ thuộc cả vào nguồn gốc của

mẫu glycogen[19].
1.3.2 Định lượng trực tiếp glycogen trong mô
Glycogen có thể được định lượng trực tiếp trong dịch chiết mô mà không
cần tách riêng hay tinh chế, được tiến hành theo các phương pháp sau;
Phươns pháp 1:
- Định lượng hỗn hợp glycogen và glucose tự do trong dịch chiết mô bằng
cách thủy phân glycogen thành glucose trong acid sulfuric đậm đặc. Glucose
phản ứng với acid sulfuric cho màu hồng. Đo quang ở bước sóng 520nm.
- Sau đó định lượng glucose tự do bằng cách nghiền mô với methanol. Khi
đó glycogen sẽ không tan và được tách riêng ra khi ly tâm. Dùng than hoạt
thêm vào dịch thu được sau ly tâm để hấp phụ những hợp chất khác gây cản
trở phản ứng lên màu nhưng không hấp phụ bất cứ một hexose nào. Sau đó
định lượng glucose bằng phản ứng cho màu hồng với acid sulfuric tương tự
như trên.
- Glycogen đo được sẽ tính theo hiệu số lượng glucose của hai kết quả trên.
[16]
Phươns pháp 2 : Phương pháp enzym :
- nguyên tắc : glycogen được thủy phân nhờ enzym
glycogen + Pi

► glucosse-1 -P (92%)+ glucose (8%)( 1)
glucose-1-P

► glucose-6-p (2)
glucose-6-P + TPH^

► 6-P-gluconolacton + TPNH (3)
Các phản ứng được thực hiện nhờ sự có mặt của các enzym : phosphorylase
a, amylo-l,6-glucosidase, oligo-l,4^1,6-glucan transferase ở phản ứng (1);
Phospho-glucomutase ở phản ứng (2); và glucose-6-P dehydrogenase ở phản

ứng (3).
17 'v /
Định lượng TPNH bằng phương pháp đo huỳnh quang. Hàm lượng glycogen
được so với chất chuẩn.
Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép định lượng trực tiếp được
glycogen có mặt trong mô não với hàm lượng SOịLig, trong gan với hàm lượng
0,3 ụg. [24].
Các phươns pháp khác: Glycogen trong mô có thể được định lượng bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [13] hoặc bằng phương pháp
đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*^C-MRS)[22].
18
Bảngl; Các phương pháp định lượng glycogen
Pflüger
(1905) [34]
Good và cộng sự
(1933) [ÌO]
Moưis
(1948) [34]
Boettiger
(1946) [34]
Seifter và
cộng sự
(1950) [28]
Van Wagtendonk
và cộng sự
(1946) [36]
Van der
Kleij
(1951) [34]
Phương pháp

tách glycogen
từ mô
Phá hủy mô
bằng kiềm,
2h.
Kết tủa
bằng
ethanol
Phá hủy mô bằng
kiềm, 20phút.
Kết tủa bằng
ethanol
Phá hủy mô
bằng kiềm, 20
phút.
Ket tủa bằng
ethanol
Phá hủy mô bằng
kiềm, 2h.
Ket tủa bằng ethanol
Phá hủy mô
bằng kiềm, 20
phút.
Phá hủy mô bằng
kiềm, 2h.
Kết tủa bằng
ethanol
Nghiền mô
vơi TCA.
Tinh chế

glycogen
Rửa bằng
ethanol 66,
85 và 96%
và ether
Không làm
Không làm
Rửa bằng ethanol
66; 85 và 96%
và ether
Không làm Không làm Không làm
Trạng thái lúc
định lượng
Glucose
Glucose
Glucose
Glucose
Glucose Glycogen Glucose
Chuyển thành
glucose
Thủy phân
bằng HCl
(3h)
Thủy phân băng
HCl
(2h)
Trong quá
trình lên màu.
Trong quá trình lên
màu

Trong quá
trình lên màu.
Không
Trong quá
trình lên
màu
Chuẩn độ
cuối
Định lượng
glucose
Đo màu với thuốc
thử Folin Wu.
Đo màu với
thuốc thử
Anthrone.
Đo màu với thuốc
thử diphenylamin
Đo màu với
thuốc thử
Anthrone
Đo màu với thuốc
thử iod
Đo màu với
thuốc thử
acid sulfuric
19
PHẦN II: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
• Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, thuần chủng, trọng lượng 20 - 25g do

Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp, được nuôi bằng thức ăn tổng hợp .
• Chuột cống trắng khỏe mạnh, thuần chủng, trọng lượng 100 - 125g do
Học viện Quân Y cung cấp, được nuôi bằng thức ăn tổng họp.
2.1.2 Hóa chất
• Ethanol
• Thioure
• Anthrone
• Acid tricloacetic
• Acid sulfuric
• Glucose tinh khiết
• Kali hydroxyd
• Thuốc thử Anthrone:
Thêm cẩn thận 180 ml acid sulfuric vào 70 ml nước cất. Đến nhiệt độ
khoảng 80°c thêm vào 2,5g thioure, hòa tan và thêm tiếp 125mg thuốc thử
Anthrone, khuấy cho tan hoàn toàn, để mát. Bảo quản trong tủ lạnh. Không để
lâu quá hai tuần[6].
• Các hóa chất tinh khiết khác.
<♦ Hóa chất do bộ môn hóa sinh cung cấp đạt tiêu chuẩn tinh khiết
hóa học.
20
2.1.3 Máy móc thí nghiệm
• Máy li tâm thường (3000 vòng / phút) (Clay Adams - Anh)
• Máy li tâm lạnh Heraeus sepatech
• Máy đo quang Spectro ƯV-VIS Auto - LaboMed, Inc.
• Máy đo đường huyết One touch Basic (Jonhson & Tonhson).
• Kít đo đường huyết One touch Basic Ợonhson & Jonhson).
• Tủ điều nhiệt.
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu
2.1.4.1 Cơ sở thực nghiệm:
Hiện nay bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid ngày càng phát

triển, đặc biệt bệnh đái tháo đưòng đang ở giai đoạn bùng nổ dịch tễ trên
phạm vi toàn cầu. Để chẩn đoán và đánh giá mức độ những bệnh này đòi hỏi
phân tích được các chỉ số hóa sinh liên quan. Mặt khác việc nghiên cứu các
thuốc điều trị càng trở nên cấp thiết. Muốn đánh giá tác dụng cũng như cơ chế
của những thuốc này cần định lượng được các chỉ số hóa sinh mà thuốc gây
ảnh hưởng. Glycogen là dạng dự trữ của glucose. Việc đánh giá hàm lượng
glycogen là một khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu các thuốc tác
dụng trên chuyển hóa glucid cũng như để chẩn đoán những bệnh liên quan.
Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu xây dựng một phương pháp định lượng
glycogen trong gan chuột dựa trên các phương pháp đã công bố, có sửa đổi,
điều chỉnh và sơ bộ đánh giá mức độ tổng hợp glycogen từ glucose ngoại
sinh.
2.L4.2 Phương pháp nghiên cứu:
<♦ Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng glycogen trong gan:
• Tham khảo các phương pháp định lượng đã công bố.
• Bằng thực nghiệm, khảo sát các điều kiện tiến hành để xây dựng
một quy trình hợp lý dựa theo nguyên tắc: Glycogen được chiết
21