Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số tạp chất alkaloid có mặt trong mẫu heroin bằng sắc ký khí và điện di mao quản ( CE )

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM VĂN KIÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỤNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
MỘT SỐ TẠP CHẤT ALKALOID có MẶT TRONG
• • •
MẪU HEROIN BẰNG SẮC KÝ KHÍ
VÀ ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC 2001-2006)
Người hướng dẫn :GVCTRẦNTÍCH
THS. NGUYỄN XUÂN TRưìỉNG
Nơi thực hiện : BỘ MÔN HÓA PHÂN TÍCH
VIỆN KHOA HỌC HÌNH s ự
Thời gian thực hiện : 2-5/2006.
- -
Hà Nội, Tháng 5-2006
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, cùng với sự nỗ lực cố gắng
của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn
bè, và người thân.
Nhân dịp hoàn thành khóa luận, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến :
GVC. Trần Tích.
ThS. Nguyễn Xuân Trường.
Là những người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm đề
tài.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm 0fn các thầy cô, cán bộ, kỹ thuật viên Bộ
môn Hóa Phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội, lãnh đạo Trung tâm giám
định ma túy - Viện khoa học hình sự - Bộ Công an đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các phòng ban của trường Đại học Dược Hà Nội
đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Hà Nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên
Phạm Văn Kiền
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Một số nét chung về mẫu heroin và vấn đề phân tích mẫu heroin

3
1.1.1. Mẫu heroin 3
1.1.2. Tình hình phân tích mẫu heroin trên thế giới và ở Việt Nam 6
1.2. Đại cương vê sắc ký khí
7
1.2.1. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí 7
1.2.2. Những khái niệm và phương trình cơ bản của sắc ký khí 8
1.2.3.Phương thức làm việc của sắc ký khí 10
1.3. Đại cương về điện di mao quản

11
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản

11
1.2.2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản động học micelle (MEKC)

15
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
18
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 18

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 19
2.2. Kết quả thực nghiệm 20
2.2.1. Phương pháp sắc ký khí 20
2.2.2. Phương pháp điện di mao quản 32
2.3. Bàn luận kết quả 37
2.3.1. Phương pháp sắc ký khí 37
2.3.2. Phương pháp điện di mao quản 37
PHẦN 3: KẾT LUẬN 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHU LUC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
3-MAM
3-Mono Acetyl Morphin.
6 -MAM
6 -Mono Acetyl Morphin.
AC Acetylcodein.
CH
Capillary Electrophoresis.
CGE
Capillary Gel Electrophoresis
CIEF
Capillary Iso-Electric Focusing
c rip
Capillary Iso-Tacho-Phoresis.
CMC
Critical Micellary Concentration.
CZE
Capillary Zone Electrophoresis.
DAD Diode Array Detector.
DAM Diacety Imorphin.

EFF
Electric Field Force.
EOF Electro - Osmotic Flow.
FID Flame Ionization Detector.
GC Gas chromatography.
HPLC High Pressure Liquid Chromatography.
IS
Internal Standard.
LT
Lượng thêm.
MEKC
Micellary Electro-Kenetic Capillary.
RSD Độ lệch tương đối.
SD
Độ lệch chuẩn.
'l'B
Trung bình.
S11
Số thứ tự.
TH
Thu hồi.
TLTH
Tỉ lệ thu hồi.
SDS
Sodium Dedocyl Sulfat.
ĐẶT VÂN ĐỂ.
Ma tuý là hiểm hoạ của nhân loại. Heroin là chất ma tuý phổ biến nhất
hiện nay ở nước ta (chiếm trên 80% số vụ ma tuý các loại) và việc buôn bán
này đang có xu hướng diễn biến rất phức tạp.
Để có một chiến lược vĩ mô nhằm phòng ngừa từ xa, cũng như trấn áp loại

tội phạm này tận gốc, cần phải có những thông tin xác thực để trả lời các câu
hỏi: ma tuý được sản xuất ở đâu, sản xuất như thế nào, đã dùng tiền chất nào,
được phân phối, vận chuyển như thế nào, ? Do vậy, truy nguyên nguồn gốc
heroin ở Việt Nam là một đòi hỏi thực tiễn và cấp bách trong công cuộc phòng
chống ma tuý .
Heroin là dạng bán tổng hợp từ morphin (qua một bước acetyl hóa),
morphin được tinh chế từ thuốc phiện. Thuốc phiện chứa nhiều alkaloid, trong
đó có các alkaloid chính là: Morphin, codein, noscapin, papaverin, thebain.
Mẫu heroin trên thị trường thường là hỗn hợp các thành phần, ngoài thành
phần chính là heroin còn có các alkaloid khác, đó là: Morphin, codein, 6 -
MAM, 3-MAM, acetylcodein, papaverin, noscapin Tùy theo nguồn gốc của
nguyên liệu (morphin thô) và phương pháp điều chế heroin khác nhau mà hàm
lượng các tạp này khác nhau [19]. Các mẫu heroin thu được ở Việt Nam
thường gồm có các tạp chất chính là: Morphin, acetylcodein, 6-MAM. Do vậy
việc định lượng đồng thời 4 alkaloid; Heroin (nguyên chất), morphin,
acetylcodein, 6 -MAM là một vấn đề quan trọng để truy nguyên nguồn gốc
Heroin.
Hiện nay, ở Việt Nam chưa có phương pháp nào định lượng đồng thời 4
alkaloid trên.
Phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp điện di mao quản đã được ứng
dụng trong phân tích mẫu heroin ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, đem
lại kết quả định lượng tốt. [7], [10]
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành khóa luận tốt nghiệp:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số tạp chất alkaloid có
mặt trong mẫu heroin bằng sắc ký khí và điện di mao quản (CE)” nhằm
mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp và triển khai kỹ thuật sắc ký khí mao quản định
lượng đồng thời 4 alkaloid (heroin, morphin, acetylcodein, 6-MAM) trong
mẫu heroin.
- Bước đầu xây dựng phương pháp điện di mao quản vào việc xác định

đồng thời 4 alkaloid trong mẫu heroin.
Phần 1: TỔNG QUAN.
1.1. MỘT SỐ NÉT CHƯNG VỀ MẪư HEROIN VÀ VAN ĐỀ p h â n t í c h
MẪU HEROIN.
1.1.1.Mẫu heroin.[19], [20]
Những năm 70 của thế kỷ trước, dạng tổng hợp diacetyl morphin từ
morphin (được tinh chế từ thuốc phiện) được công bố vào năm 1874. Năm
1898, công ty Bayer đặt tên thương mại cho sản phẩm này là heroin. Vào
những năm đầu của thế kỷ XX, heroin được các giáo sư y học sử dụng một
cách rộng rãi và đặc biệt được dùng để thay thế cho codein và morphin trong
điều trị lao phổi và một số bệnh về đường hô hấp khác. Sau Hội nghị thế giới
về ma tuý năm 1925, thanh tra quốc tế bắt đầu hạn chế cung cấp heroin và bắt
đầu từ đó có sự sản xuất lậu heroin.
Heroin là dạng bán tổng hợp của morphin (qua một bước acetyl hóa). Tuỳ
theo tác nhân acetyl hoá khác nhau mà hình thành con đường bán tổng hợp
khác nhau:
a, Morphin + anhydrid acetic — > diacetyl morphin
b, Morphin + acetyl clorid — > diacetyl morphin
c, Morphin + acid Trifluoroacetic — > diacetyl morphin
d, Morphin + ethylidene diacetate — > diacetyl morphin
e, Demethyl hoá codein — > morphin (+ anhydrid acetic).
Morphin được tinh chế từ thuốc phiện. Thuốc phiện (opium) là sản phẩm tự
nhiên thu được từ nhựa quả cây thuốc phiện (Papaver somniferum L.).
Morphine cũng được thông báo tìm thấy ờ các cây Papaver setigerum;
Papaver decaisnei và Papaver rhoeas. Trong thuốc phiện thô các thành phần
chính bao gồm: mảnh thực vật, chất nhựa, các sterol, các alcol triterpenoid,
acid béo, alcol, polysaccharid và trên 30 alkaloid khác nhau. Trong đó có 5
alkaloid chính được chia thành 2 nhóm theo cấu trúc hoá học: cấu trúc nhân
phenanthren (gồm morphine, codeine, thebaine) và nhân benzylisoquinolin
(gồm narcotine, papaverine). Alkaloid thứ sáu được đề cập gần đây là

narceine, nhưng trong phần lớn các trưòfng hợp thì nồng độ của nó thấp hofn
năm alkaloid kia. Ngoài ra trong thuốc phiện còn có acid meconic hàm lượng
thay đổi khác nhau tuỳ theo loại thuốc phiện. Trong quá trình bán tổng họfp
heroin từ morphin không tinh khiết thì sẽ tạo thành các tạp alkaloid trong mẫu
heroin. Trong đó:
- Acetyl hóa morphin tạo thành heroin, 3-MAM, 6 -MAM.
- Acetyl hóa codein tạo thành acetylcodein.
Trong mẫu heroin gặp ở Việt Nam, ngoài diacetyl morphin hay gặp các tạp
alkaloid là: Morphin, acetylcodein, 6 -MAM.
Dưới đây là một số tính chất vật lý của 4 alkaloid: Công thức hóa học,
công thức cấu tạo, nhiệt độ nóng chảy, độ hòa tan.
13.1.1. Heroin (dmmorphin, diacetylmorphin, acetomorphin). [8 ], [19]
Nhiệt độ nóng chảy (°C):
C H 3C 0 0
N-CH3
Công thức phân tử: C2JH23NO5.
Trọng lượng phân tử: 369.40.
Base HCl (IH2O)
173 243-244
Độ hòa tan Base HCl
Nước không tan dễ tan
Methanol tan dễ tan
Ethanol tan tan
Chloroform dễ tan dễ tan
Hằng số phân ly: pHg = 7,6
1.3.1.2. Morphin (morphium, morphia, duromorph, nepenthe, dolcotin) [8],
[19]
Nhiệt độ nóng chảy (°C):
Base HCICSHP)
247 - 249 200

Độ hòa tan Base HQ
Nước rất khó tan tan
Methanol tan
Ethanol it tan it tan
Chloroform rất khó tan không tan
Công thức phân tử: C17H19NO3
Trọng lượng phân tử: 285.34
Hằng số phân ly: pHa = 8,0 và 9,9
13.1.3. 6-Acetylmorphin (O^-Monoacetylmorphin, 6-0-Acetylmorphin)[8],
[19]
Nhiệt độ nóng chảy (°C):
Base HCKSHP)
201 265-267
Base HCl
rất khó tan tan
Độ hòa tan
Nước
Methanol
Ethanol
Chloroform
tan
tan
tan
tan
tan
tan
Công thức phân tử: C19H21NO4.
Trọng lượng phân tử; 327.37
Nhiệt độ nóng chảy (°C):
1.31.4. Acetylcodein (6-Acetylcodein) [8], [19]

Công thức phân tử: C20H23NO4.
Trọng lượng phân tử: 341.41
Base
HCKIHP)
133 345
Độ hòa tan Base HCl
Nước
rất khó tan tan
Methanol tan
tan
Ethanol tan tan
Chloroform
tan tan
1.1.2. Tình hình phân tích mẫu Heroin trên thê giới và ở Việt Nam.
Trên thế giới hiện nay có ba kĩ thuật được sử dụng để xác định các tạp chất
chính trong mẫu Heroin:
- Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao - HPLC [13], [14]: Từ những năm
1986, HPLC cột pha đảo được sử dụng để định lượng heroin và các tạp chất
alkaloid. Phương pháp này hạn chế khi phải phân tích các mẫu có nồng độ các
chất cách nhau quá xa, dẫn tới việc vượt qua giới hạn tuyến tính của detectơ.
Hơn nữa, về mặt kinh tế cần phải dùng nhiều dung môi có độ tinh khiết cao và
thời gian phân tích dài. Nếu giảm thời gian phân tích thì độ đúng và độ chính
xác của morphin bị hạn chế, do nó rửa giải quá sớm gần thời gian chết của cột.
Phương pháp này đã được ứng dụng tại Mỹ từ 1986, nhưng đến năm 2003
được thay thế bằng phương pháp Điện di mao quản.
- Kĩ thuật sắc ký khí - GC [6 ], [10], [11], [12], [15], [16], [17], [18]: Từ
năm 1982, phương pháp sắc ký khí được ứng dụng để phân tích các tạp chính
trong mẫu heroin. Năm 1992 phương pháp này được nghiên cứu trên mẫu dẫn
xuất hoá. Có hai loại pha tĩnh được sử dụng nhiều là 100% dimetyl siloxan và
5% diphenylmetylsiloxan. Nói chung, GC cho khoảng phát hiện rộng, hầu hết

các tạp chất trong mẫu Heroin được phân lập và xác định. Phương pháp có thể
tự động hoá cho độ lặp lại tốt. Thời gian phân tích nhanh so với HPLC và hiện
nay vẫn là một trong những phưoỉng pháp phân tích hoá lý hiện đại được ứng
dụng nhiều nhất trong qui trình định lượng các tạp chất trong mẫu Heroin.
- Kĩ thuật điện di mao quản - CE [6 ], [7]: Được tiến hành với cả hai loại:
Điện di mao quản vùng (CZE) và điện di mao quản động học micelle
(MEKC). Đây là phương pháp mới, có nhiều ưu điểm về độ phân giải, thời
gian phân tích, do đó có thể được ứng dụng nhiều trong tương lai.
Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu nào về các tạp chất chính
trong mẫu heroin ở Việt Nam được công bố. Do vậy, chúng tôi tiến hành định
lượng đồng thời các tạp chất chính trong mẫu Heroin bằng 2 phương pháp sắc
ký khí và điện di mao quản như hai mục tiêu của khóa luận đã nêu trên.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂ SẮC KÝ KHÍ.[1], [4]
1.2.1. Thiết bị sắc ký khí.
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và
detector. Nhờ có khí mang chứa trong bom khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ
buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình
sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau,
các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó, chúng được chuyển thành tín hiệu
điện. Tín hiệu này được khuyếch đại rồi chuyển sang máy vi tính. Các tín hiệu
được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu giữ kết quả (máy ghi hoặc
máy in).
Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi
là pic. Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng (định tính) cho chất cần
phân tách. Còn diện tích hoặc chiều cao của pic là thước đo định lượng cho
từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
7
Hình 1: Thiết bị sắc ký khí.
1.2.2. Những khái niệm và phương trình cơ bản của sắc ký khí.
1.2.2.1. Sự lưu giữ.

- Thcd gian từ khi bơm mẫu đến điểm cực đại của pic được gọi là thời gian
lưu giữ toàn phần (thường gọi là thời gian lưu) Ir, nó bao gồm cả thcd gian chết
tợ (chúứi là thời gian lưu của một cấu tử trơ đối với pha tĩnh) và thời gian lưu
thật (còn được gọi là thòi gian lưu hiệu chỉnh)
t \ .
- to
- Thể tích lưu hiệu chỉnh
VN = VV-j = t’R.Fc.j
: Thể tích lưu.
j : Hệ số Martin.
Fc: Lưu lượng dòng hiệu chỉnh.
- Hằng số phân bố K:
K= ^ X ^ =kxp
no V l
n: Số mol của chất tan.
V : Thể tích toàn thể của pha tĩnh trong cột tách,
k : Hệ số dung lượng (k = — = — ), là đại lượng biểu diễn mối
no to
tương quan giữa thòi gian của chất tan lưu lại trong pha tĩnh trong pha động.
8
p :Tỷsốpha(VcA^L).
1.2.2.2. Năng suất cột tách.
- Năng suất tách của cột sắc ký được thể hiện qua số đĩa lý thuyết n:
n =
/ \2
IR
v ơ y
Ir : Thời gian lưu của chất tan.
ơ : Độ lệch chuẩn của pic sắc ký.
Trường hợp lý tưỏỉng, pic sắc ký có dạng hình Gauss.

/ \
2
n = 5,545 .
tR
= 16.
tR
^WbJ
W|^ : Độ rộng pic tại một nửa chiều cao.
Wị, : Độ rộng pic tại đáy pic.
1.2.23. Hiệu quả cột tách.
- Độ phân giải Rs của hai cấu tử Q và Q+j:
2(ti> tp )
_ _ K ( x ^ ) K ( x )
Rs =
Wb_+Wk .
D(x+1) U(x)
- Số phân tách TZ:
TZ = - 1
1,177
1.2.2.4. Phương trình Van Deemter.
2 ỵ D g
h = 2Ằdp + +
8 kidf
-u
u 7r'(l+ki/DF
h : Độ cao của pic
u : Tốc độ trung bình của dòng khí mang.
X : Độ không đồng nhất của chất nhồi cột.
dp : Đường kính trung bình của hạt chất mang.
ỵ : Hệ số Labyrinth về đưòtig đi của khí trong cột.

Dq: Hệ số khuyếch tán phân tử trong pha khí.
Dp: Hệ số khuyếch tán phân tử trong pha lỏng.
kj : Hệ số dung lượng.
dị ; Độ dày của lớp phim pha tĩnh trên chất mang.
1.2.3. Phương thức làm việc của sắc ký khí.
1.2.2.1. Detector.
Có 5 loại Detector thường được kết nối để làm việc với thiết bị GC là:
- Detector dẫn nhiệt.
- Detector ion hóa ngọn lửa.
- Detector cộng kết điện tử.
- Detector Nitơ-Phospho.
- Detector quang kế ngọn lửa.
* Dựa trên cơ sở trang thiết bị của phòng thí nghiệm và yêu cầu của đề tài,
chúng tôi lựa chọn detector ion hóa ngọn lửa (FID): Nguyên tắc làm việc dựa
trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trường khi
có chất cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất
hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của
không khí để tạo thành các ion trái dấu tương ứng.
Các ion này được chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của
ngọn lửa (thế hiệu giữa hai bản điện cực này khoảng 205-300V).
Dòng ion đó được giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (10*-10*^n) và
độ giảm hiệu điện thế này được khuyếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số
lượng của ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu
tố sau:
- Cấu trúc hình học của detector.
- Tỷ lệ thành phần hydro/không khí.
10
- Nhiệt độ của ngọn lửa.
- Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định.
1.2.2.2. Khí mang.

Có các loại khí mang thường được sử dụng cho sắc ký khí: Hydro, Heli,
Argon, Nitơ. Trong đó, khí Nitơ được sử dụng phổ biến vì có nhiều ưu điểm
như: an toàn, giá rẻ, dễ dàng làm tinh khiết.
1.2.2.3. Cột tách sắc ký khí.
Có hai loại cột: Cột nhồi và cột mao quản.
Cột mao quản hay được dùng nhiều hơn do có nhiều ưu điểm hơn so với cột
nhồi:
- Các hỗn hợp phức tạp được tách với hiệu suất cao hơn hẳn.
- Tách được cả các chất có cấu trúc hóa học rất gần nhau.
- Độ tin cậy cao hơn trong việc nhận biết các cấu tử.
- Độ nhạy phát hiện lớn hơn.
- Giảm thời gian phân tích.
Có hai loại cột mao quản chủ yếu:
- Cột mao quản phim mỏng: Thành trong của loại cột này được tẩm trực tiếp
(mà không cần thông qua một lớp chất hấp phụ xốp) bởi một lớp phim pha
tĩnh mỏng.
- Cột mao quản lớp mỏng: Cột này có thêm một lớp mỏng chất hấp phụ
(đóng vai trò như chất mang) giữa thành trong của cột và lớp phim của pha
tĩnh.
1.3. ĐẠI CƯƠNG VỂ ĐIỆN DI MAO QUẢN.
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản.[2], [5], [8]
Nguyên tắc của các kỹ thuật tách điện di mao quản là dựa trên cơ sở sự di
chuyển của các phân tử chất tan trong ống mao quản trên nền của dung dịch
chất điện ly (có chất đệm pH thích hợp), dưới tác dụng của một điện trường E
11
xác định được cung cấp bởi một nguồn điện thế cao một chiều (10-50kV) đặt
vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển khác nhau của chất tan trong ống mao
quản dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (EFF), và tính chất của
dòng chảy điện thẩm (EOF). Dòng EOF là một loại dòng chảy khối của chất

lỏng trong ống mao quản. Dòng EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của chất
tan trong ống mao quản. Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan,
nghĩa là chất tan di chuyển trong dòng này. Trong Điện di mao quản người ta
thường phân cực mao quản sao cho dòng này hướng về catốt.
Lực điện trường E làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo
một hướng nhất định. Các chất khác nhau có điện tích và độ lớn khác nhau, sẽ
di chuyển theo các tốc độ khác nhau, do đó các chất phân tích được tách ra
khỏi nhau.
1.3.1.1. Các thành phần chính của thiết bị điện di mao quản. [3], [8]
- Mao quản: Là nơi xảy ra quá trình chia tách, thường được chế tạo từ Silica
nung chảy và được bao bề mặt trong bởi các thành phần khác trong các trường
hợp cụ thể, ngoài có phủ một lớp polyme, để làm cho ống mao quản mềm mại,
có thể uốn được và không bị gãy.
- Bộ phận tạo điện trưòfng có điện thế cao: Cường độ điện trường thường >
500V/cm, với trình độ kỹ thuật hiện nay có khả năng tạo điện trường tối đa là
30KV.
- Detector: Thường dùng loại detector ưv , DAD. Ngoài ra còn detector
huỳnh quang, điện hóa, khối phổ.
12
á
■
HP C apillary
Electrophoresis system
Hình 2: thiết bị điện di mao quản.
13.1.2. Các thông số phân tích của điện di mao quản:[3], [8]
* Thời gian điện di (tn,): Là thời gian để chất cần phân tích di chuyển từ
điểm đầu mao quản tới detector.
* Tốc độ điện di; Vgp (cm/s):
V ep =
Li

tm
: Qiiều dài mao quản từ điểm đầu đến Detector.
* Cường độ điện trường: E (V/cm)
E = ^
L
V : Điện thế giữa hai đầu mao quản (V).
L : Tổng chiều dài của cột (cm).
* Độ lưu động điện di; Ịigp (cm^/s).
q : Điện tích của tiểu phân.
r| : Độ nhớt của dung dịch đệm.
r : Bán kính của tiểu phân.
* Mối liên quan giữa tốc độ điện di (Vgp) và độ lưu động điện di (figp):
13
V,
Ld • Lt
E V.T™
* Hiệu lực tách: Biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N):
N =
Ld
với ơ =
2.Pn,.Ld
v.u„
=>N =
ỊLl .V
2 -D.
ơ : Độ phân tán pic.
* Độ phân giải R^:
4^,
ep
l^ep,l

l^ep,2
: Độ lưu động điện di của chất thứ nhất.
: Độ lưu động điện di của chất thứ hai.
: Độ lưu động điện di trung bình của hai cấu tử.
13.1.4. Phân loại: [3], [5]
Phương pháp điện di mao quản được phân loại theo cơ chế tách, gồm các
loại:
- Điện di mao quản thường : CE.
- Điện di mao quản vùng : CZE.
- Điện di mao quản điện động học micelle ; MEKC.
- Điện di mao quản loại gel : CGE.
- Điện di mao quản hội tụ đẳng điện : CIEFL.
- Điện di mao quản đẳng tốc độ : CITP.
1.3.1.5. ưu, nhược điểm của phương pháp điện di mao quản.{?>], [5]
* í/ím điểm.
- Hiệu lực tách cao.
- Yêu cầu lượng mẫu phân tích nhỏ (vài nanogram).
- Tiêu tốn ít thuốc thử và dung môi, dung môi không độc và kinh tế hơn so
với dung môi của HPLC.
14
- Quá trình phân tích không phức tạp, có khả năng tự động hóa trong tách và
phân tích hàng loạt.
* Nhược điểm.
Do điện trở cao của mao quản, làm khó khăn dòng chảy nên thường dễ xuất
hiện hiệu ứng nhiệt Joule, vì vậy phải khống chế nhiệt độ của mao quản để
đảm bảo thu được kết quả tách ổn định.
1.3.2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản động học micelle (MEKC).
Dựa trên cơ sở thiết bị của phòng thí nghiệm và điều kiện phân tích của các
alkaloid trong mẫu heroin, chúng tôi chọn phương pháp MEKC.
1.2.2.1. Nguyên tắc của MEKC. [3], [5], [9]

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phân tử
micelle trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt đóng góp thêm
vào khả năng tách các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly
của quá trình điện di. Sự tách của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật
MEKC là được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt trong dung dịch đệm
điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của
micelle (chuẩn giới hạn hình thành micelle), ví dụ: CMC = 9mM đối với chất
hoạt động bề mặt SDS, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân riêng biệt của
chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành trong ống mao
quản các tổ hợp của các tiểu phân đó. Nó chính là các micelle.
Các Micelle ở đây hoạt động như một pha tĩnh giả. Các phân tử của chất
phân tích được phân bố vào cả trong micelle và cả ngoài micelle theo một cân
bằng động học, có hằng số phân bố Kị xác định, trong những điều kiện nhất
định đã chọn để chạy điện di là mỗi chất tan Xj sẽ có một hằng số phân bố Kị
nhất định. Nếu các Kj của các chất tan khác nhau rõ rệt thì sẽ có kết quả tách
tốt. Độ chọn lọc của hệ pha MEKC có thể thay đổi được thông qua việc thay
đổi nồng độ micelle, thay đổi pH của dung dịch đệm, thêm các chất phụ gia,
thêm dung môi hữu cơ thích hợp vào trong hệ pha của MEKC.
15
Các chất hoạt động bề mặt có thể dùng ở đây như các chất loại cationit, loại
anionit (SDS), các chất ionit kép, loại không ionit hóa (Octylglucoside, n-
Dodecyl-P-maltoside, Tron-X) hay là dùng hỗn hợp của chúng với nhau.
o I
Hình 3: Cấu trúc các micelle và dòng EOF. [9]
1.2.2.2.ứng dụng của MEKC.m, [9]
Kỹ thuật phân tích MEKC được sử dụng cho việc tách cả các chất mang
điện tích và các chất không mang điện tích trong một vùng rộng, kể cả các loại
chất có đặc tính ưa nước và kỵ nước. Nó cũng được sử dụng tốt để tách và
phân tích các chất amino acid, các chất họ nucleotid, các vitamin, các chất loại
hydrocacbon thơm, các dược phẩm, thuốc và các hợp chất sinh học.

ở Việt Nam, phương pháp MEKC mới được áp dụng trong một vài năm trở
lại đây, tại trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2003 mói bắt đầu triển khai kỹ
thuật này với đề tài “Định lượng các vitamin: Bj, B2, Bg, pp trong chế phẩm
thuốc tiêm Bencozym bằng phương pháp Điện di mao quản” Vì vậy, vấn đề
MEKC còn rất mới mẻ về học thuật, kinh nghiệm triển khai phương pháp
MEKC, cần được nghiên cứu tiếp.
1.2.23.Các yếu tố ảnh hưởng.{?>\ [5]
- Điện thế: Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu
ống mao quản. Tuy nhiên, nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng nhiệt
16
Joule tạo ra Gradient nhiệt trong ống mao quản, và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở
từng vùng trong ống mao quản, làm cho các phân tử ngay cả của một chất tan
cũng di chuyển không đồng nhất, dẫn đến sự khuyếch tán khác nhau và làm
mở rộng vùng mẫu.
- Nhiệt độ: Có ảnh hưỏíng đến độ nhót và độ dẫn điện của đệm, vì thế nó ảnh
hưởng tới tốc độ di chuyển. Trong một số trường hợp, nhiệt độ trong ống mao
quản tăng là nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của Protein, làm thay đổi thời
gian điện di và hiệu quả phân tích.
- Cột mao quản: Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính)
góp phần vào thời gian phân tích và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố
(chiều dài hiệu dụng và chiều dài cột mao quản) có thể làm giảm điện trường
và tăng thời gian phân tích.
- Dung dịch đệm:
+ Loại đệm và nồng độ đệm: Đệm thích hợp cho điện di mao quản là đệm
có dung lượng đệm lớn, độ dẫn điện tốt và giảm thấp nhất sự sinh dòng trong
đệm.
+ pH đệm: pH của đệm có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm
thay đổi dòng EOF. Tăng pH của đệm thường gây tăng dòng EOF.
- Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của một
số chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường làm

giảm dòng EOF.
[=. \
L- TIU' \
V
17 :
Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cú u .
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất.
Nguyên vật liệu.
*Các chất chuẩn:
- Diacetylmorphin, morphin, acetylcodein, MAM-6 được cung cấp từ phòng
thí nghiệm Liên Hợp Quốc (UNODC) tại Viên - Áo.
- Chất nội chuẩn: n-ankan C2iH44của hãng Fluka Qiamie AG CH-9471 Buchs,
Switzerland, đạt tiêu chuẩn tinh khiết cho sắc kí khí.
* Các mẫu Heroin thực tế được cung cấp từ Viện khoa học hình sự - Bộ Công an.
* Hóa chất
- Natri tetraborat (Merck).
- Sodium Dodecyl Sulfat (USA).
- Methanol ( Merck).
- Natri hydroxyd (Merck).
* Dụng cụ
- Máy sắc ký khí: Agilent model 6890N.
- Máy điều chế khí Nitơ.
- Bộ tiêm mẫu tự động: Agilent Auto Sampler 7683 Serier.
- Máy điện di: Agilent model CE-G160 AX.
- Máy quang phổ: Unicam ư v 300 (Thermo Spectrum).
- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh).
- Cân phân tích Satorius (Đức), Mettler AE240.
- Máy ly tâm điện Jouan (Pháp).
- Máy siêu âm Branson (Mỹ).

- Máy lắc Labinco.
- Autopipet 10-100, 100-1000 |Lil, màng lọc 0,2p,m.
- Các dụng cụ thủy tinh, bơm tiêm, ống nghiệm, bình định mức.
18
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.1.2.1. Phương pháp sắc ký khí.
* Khảo sát điều kiện phân tích.
-Xử lý mẫu.
- Điều kiện chạy máy.
* Xây dựng phương pháp định lượng hỗn hợp 4 alkaloid trong mẫu Heroin.
- Khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký khí: Tiến hành chạy sắc ký khí
nhiều lần khác nhau ở cùng một dung dịch chuẩn hỗn hợp, đánh giá độ ổn
định của hệ thống sắc ký khí.
- Khảo sát sự tuyến tính của diện tích đã được chuẩn hóa của diacetylmorphin,
morphin, acetylcodein, 6 -MAM vói nồng độ các chất tương ứng.
Pha một dãy dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn riêng lẻ (gọi là dung dịch
chuẩn gốc) và phối hợp các dung dịch chuẩn gốc với các lượng khác nhau để
thu được từng dung dịch hỗn hợp chuẩn ứng với từng điểm chuẩn định lượng.
Tiến hành chạy sắc ký khí, xác định thời gian luu và diện tích pic của từng
alkaloid và chất nội chuẩn. Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ các
alkaloid tương ứng với tỷ số diện tích pic của chúng vói diện tích của chất nội
chuẩn (R).
A a
A is
Aa : Diện tích pic của alkaloid.
Ajs : Diện tích pic của nội chuẩn.
- Khảo sát tính chính xác của phương pháp;
Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phưoíng pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Thêm chính xác một lượng từng chất chuẩn (diacetylmorphin, morphin,

acetylcodein, 6 -MAM) vào mẫu thử đã biết nồng độ các alkaloid tương ứng.
Tính phần trăm từng chất chuẩn tìm lại được.
19
* Định lượng một số mẫu heroin thực tế bằng phương pháp sắc ký khí.
2.1.2.2. Phương pháp điện di mao quản:
* Khảo sát điều kiện phân tích:
- Xử lý mẫu.
- Điều kiện chạy máy.
* Khảo sát tìm điều kiện để tách 4 alkaloid trong mẫu heroin.
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM.
2.2.1. Phương pháp sắc ký khí.
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện phân tích.
- Dung môi pha mẫu: Các chất phân tích tan tốt trong methanol, còn chất nội
chuẩn heneicosan tan tốt trong ethylacetate. Hai dung môi này có thể trộn lẫn
vào nhau. Vì vậy dung môi pha mẫu được chọn là hỗn hợp methanol -
ethylacetate (1-1).
- Chọn cột mao quản (pha tĩnh):
4 alkaloid có trong mẫu heroin là: diacetylmorphin, morphin, acetylcodein,
6 -MAM là những chất hơi phân cực, do đó ta phải chọn cột có độ phân cực ít.
Chúng tôi đã tiến hành thực nghiệm với những loại cột mao quản pha tĩnh
khác nhau (DB-1, DB-5, DB-35) với các chế độ nhiệt độ giống nhau. Cuối
cùng, chúng tôi lựa chọn cột mao quản J&W 122-5032 DB-5.
Các thông số của cột:
Chiều dài 30,0 m.
Đưcmg kính trong 250 |im.
Bề dày lớp phim mỏng 0,25 ịim.
Nhiệt độ tối đa của cột 325°c.
Pha tĩnh: 5% diphenylsiloxane 95% dimethylsiloxane
- Detector, trong phương pháp này dùng detector ion hóa ngọn lửa FID.
- Khí mang: Vì ưu điểm là rẻ tiền và an toàn, khí nitơ được lựa chọn làm khí

mang đã đáp ứng được yêu cầu phân tích.
20
- Nhiệt độ:
+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu:
Do các alkaloid này có nhiệt độ bay hoi cao, nên khảo sát nhiệt độ trong
buồng bơm mẫu tại các nhiệt độ: 250, 260, 270, 280, 290°c. Cuối cùng nhiệt
độ trong buồng bơm mẫu tối ưu được lựa chọn là 270°c.
+ Nhiệt độ lò:
Acetylcodein và 6 -MAM là hai chất khó tách ra khỏi nhau đối với sắc ký khí.
Dùng chương trình đẳng nhiệt thì hai chất này không tách ra khỏi nhau được.
Do đó, chọn chương trình nhiệt độ, thì hai chất này tách tốt ra khỏi nhau.
Chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ ban đầu 200°c, tăng 10°c/phút đến 280°c,
giữ đẳng nhiệt 3 phút.
+ Nhiệt độ của Detector: Nhiệt độ của Detector thường được chọn lớn hơn
hoặc bằng nhiệt độ cuối của cột, do đó chọn nhiệt độ của Detector là 280°c.
- Điều kiện bơm mẫu:
Bơm mẫu theo phương pháp không chia dòng, do phương pháp này tránh
được hiện tượng “phân biệt đối xử”.
Qua khảo sát thấy ở tốc độ khí mang 1,3 ml/phút thì hai chất khó tách ra
khỏi nhau nhất là Acetylcodein và MAM-6 đã tách tốt ra khỏi nhau (ứng với
nồng độ mỗi chất 0,5mg/ml thì Rs = 1,3)-
Thể tích tiêm mẫu: 1,0 1^1.
- Chất nội chuẩn: Chọn chất nội chuẩn là heneicosan (C21H44), chất này đảm
bảo được các tiêu chuẩn của chất nội chuẩn.
Qua khảo sát các điều kiện như trên, chúng tôi đưa ra điều kiện chuẩn chạy
sắc ký khí như sau:
- Dung môi pha mẫu: hỗn hợp MeOH/Ethylacetat (1/1).
- Cột mao quản: J&W 122-5032 DB-5.
- Detector; FID, t° = 280°c. Khí đốt; Hydro (40ml/phút) và không khí
(400ml/phút) Khí bổ trợ; Nitơ (30ml/phút).

- Khí mang: Nitơ, đẳng dòng, tốc độ dòng l,3ml/phút
21