Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện một số chất độc có khả năng gây nhiễm độc hàng loạt trong các mẫu sinh học trên các thiết bị phân tích tại phòng thí nghiệm

Bộ quốc phòng
học viện quân y






Báo cáo tổng kết Đề tài nhánh kc.10-13.04

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện một số
chất độc có khả năng gây nhiễm độc hàng loạt
trong các mẫu sinh học trên các thiết bị
phân tích tại phòng thí nghiệm


Chủ nhiệm ĐTN: PGS. TSKH. Nguyễn Bằng Quyền



thuộc đề tài cấp nhà nớc. M số kc 10.13

xác định nguyên nhân, xây dựng biện pháp dự phòng
và xử trí nhiễm độc hàng loạt

6466-4



Hà nội 10-2004

Tài liệu là kết quả thực hiện nhánh nghiên cứu của Đề tài cấp Nhà nớc
KC10.13 (2001-2004)





1

BKHCN
HVQY
Bộ khoa học công nghệ
Học Viện Quân y




Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài nhánh KC.10.13.04
Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện chất độc
có khả năng gây NĐHL trong các mẫu sinh phẩm
trên các thiết bị tại phòng thí nghiệm

phục vụ cho chẩn đoán điều trị nhiễm độc


PGS. TS. Nguyễn Bằng Quyền








Hà nội - 2004


Tài liệu là kết quả thực hiện nhánh nghiên cứu của Đề tài cấp
Nhà nớc KC10.13



2


Lời mở đầu

Nớc ta là một nớc nông nghiệp đang phát triển, từng bớc hiện đại
hoá và công nghiệp hoá. Cùng với sự phát triển về kinh tế là sự bất ổn của tình
hình chính trị khu vực và toàn cầu, nguy cơ xẩy ra những vụ NĐHL là không thể
dự đoán trớc.
Việc xử trí nhiễm độc và NĐHL đòi hỏi nhiều biện pháp khác nhau, từ

việc dự báo phát hiện sớm nguyên nhân đến công tác dự phòng và xử trí. Các biện
pháp đó cần đợc thực hiện theo những quy tắc và trình tự nhất định.
Vì thế, đề tài KC.10.13.04: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện
chất độc có khả năng gây nhiễm độc hàng loạt trong các mẫu sinh phẩm trên các
thiết bị tại phòng thí nghiệm phục vụ cho chẩn đoán, điều trị nhiễm độc đợc
giao nhiệm vụ thực hiện mục tiêu cụ thể sau đây:
Tạo quy trình phát hiện các loại chất độc trong các vụ NĐHL trong các
mẫu sinh phẩm trên các thiết bị tại phòng thí nghiệm phục vụ cho chẩn
đoán, điều trị nhiễm độc.
Để hoàn thành nhiệm vụ đặt ra, đề tài tập trung thực hiện các nội dụng
chính sau đây:
- Xây dựng phơng tiện và quy trình lấy mẫu và bảo quản mẫu.
-
Xây dựng phơng tiện và quy trình phát hiện nhanh chất độc trong các
mẫu sinh học.







3
Chơng I
Tổng quan
1.1 Nguyên nhân của các vụ NĐHL
Nhiễm độc hàng loạt có thể xẩy ra do các nguyên nhân sau đây:

+ Sự cố hoá học
Hiện nay, có rất nhiều loại chất hóa học đợc sản xuất, bảo quản và vận

chuyển. Các chất hoá học này có thể là sản phẩm hoàn chỉnh nhng cũng có thể
là các tiền chất sử dụng trong công nghiệp hoá chất. Do đó, những tai nạn hoặc sự
cố trong quá trình sản xuất, bảo quản và vận chuyển hoá chất có thể xẩy ra bất
ngờ gây tổn hại về sinh mạng, môi trờng và tài sản. Mức độ nguy hiểm của các
loại hoá chất khi bị rò rỉ phụ thuộc vào các yếu tố sau đây:
- Phạm vi tác dụng.
- Độc tính.
- Lợng hoá chất sản xuất, bảo quản và vận chuyển.
- Độ bền vững ở ngoại cảnh.
Số lợng nạn nhân trong một vụ tai nạn hoá chất phụ thuộc vào nhiều yếu
tố: tính chất của loại hoá chất, phạm vi lan toả của khu vực ô nhiễm, thời điểm
nạn nhân có mặt tại nơi xẩy ra tai nạn, thời gian tiếp xúc dài hay ngắn và phơng
pháp xử trí điều trị.
Trong các dạng hoá chất có thể gây nguy hiểm trong các vụ tai nạn, chất
dạng khí nguy hiểm hơn cả, trong đó có các chất nh: clo, sulfua dioxid, oxid
cacbon, amoniac, acid clohydric, oxid nitơ Các loại khí này có độc tính tong
đối cao khi bị rõ rỉ hoặc phát tán, gây nhiễm độc qua đờng hô hấp nên dễ xẩy
NĐHL, khối lợng sản xuất, dự trữ và vận chuyển lớn.
+ Do khủng bố
Các thế lực khủng bố tìm mọi cách để gây hiệu quả sát thơng về sinh
mạng dân thờng và cơ sở vật chất lớn nhất. Do vậy, các phơng tiện sử dụng để
khủng bố có thể gồm các loại sau đây:
- Chất nổ.
- Chất độc hoá học.
- Tác nhân sinh học.


4
- Chất phóng xạ.
Trong những năm gần đây, đã xẩy ra những vụ khủng bố bằng chất độc

hoá học. Năm 1970, các nhóm khủng bố thân Arập đã có kế hoạch sử dụng chất
độc hoá học tấn công các sứ quán Mỹ ở châu Âu. Năm 1972, bọn khủng bố sử
dụng acid cyanhydric để tấn công hệ thống điều hoà không khí trong toà nhà
Liên hợp quốc ở New York. Năm 1978, các nhóm khủng bố Palestin đã cho thuỷ
ngân vào các lô cam xuất khẩu từ Israen sang châu Âu. Chất độc cyanid đã đợc
cho vào nho của Chilê xuất khẩu sang châu Âu.
Tháng 8 năm 2002, Mỹ bắt đợc một nhóm Hồi giáo cực đoan tinh chế
ricin ở phía bắc Irắc. Đầu năm 2003, cảnh sát Anh ở Luân đôn đã bắt đợc một
nhóm ngời cất giữ chất độc ricin và có ý định đầu độc ở các ga tầu điện ngầm.
Ngoài ra, ở Nga và Pháp cũng thu giữ đợc những chứng cứ về việc tàng trữ chất
độc ricin.
Ngày 20-02-2002 cảnh sát Italia bắt đợc 4 ngời đàn ông Marốc mang
khoảng 4kg chất độc cyanua (kaliferocyanua) có ý định đa vào đòng ống nớc
dẫn vào sứ quán Mỹ ở thủ đô Rom. Chất này có độc tính không cao nhng có khả
năng tạo thành acid cyanhydric (HCN).
Ngày 26 tháng 4 năm 2004, cảnh sát Gioóc-đa-ni bắt đợc một nhóm
khủng bố thuộc mạng lới An Ke-đa âm mu dùng xe tải chở 20 tấn thuốc nổ
cùng hoá chất độc tấn công vào trụ sở cơ quan tình báo nớc này.
Vụ khủng bố bằng chất độc hoá học điển hình nhất là do giáo phái Aum ở
Nhật Bản tiến hành. Ngày 27-7-1994, tại thành phố Maxumoto, bọn khủng bố sử
dụng chất độc sarin làm 7 ngời chết và 114 ngời nhiễm độc. Ngày 20-3-1995,
bọn khủng bố cũng dùng chất độc sarin ở 5 tuyến tầu điện ngầm Tokyo làm 5000
ngời nhiễm độc và 12 ngời chết.

ở
Việt Nam tuy cha xẩy ra khủng bố, nhng một số kẻ xấu đã sử dụng
chất độc của Mỹ để lại sau chiến tranh để gây hoảng loạn trong dân chúng. ở
Đắc Lắc năm 2001 làm 911 học sinh và giáo viên bị nhiễm độc.
Sau chất nổ, chất độc hoá học là phơng tiện đợc u tiên lựa chọn để
khủng bố vì các đặc điểm sau đây:

-
Có thể gây sát thơng hàng loạt, gây hoang mang, sợ hãi trong dân
chúng.


5
-
Có thể sử dụng bằng nhiều phơng pháp và nhiều dạng khác nhau,
làm cho đối phơng bất ngờ, khó đối phó: gây ô nhiễm nguồn nớc,
không khí, lơng thực thực phẩm bằng chất độc dạng lỏng, dạng hơi,
dạng khí dung, dạng bột
-
Chất độc có khả năng tồn tại ở môi trờng trong thời gian nhất định.
-
Công nghệ và nguyên liệu sản xuất chất độc hoá học tơng đối đơn
giản, dễ kiếm, có thể sử dụng quy trình sản xuất trong công nghiệp
thông thờng và rẻ tiền hơn so với chất phóng xạ và chất nổ. Có ý kiến
cho rằng, các nhóm khủng bố khó có khả năng về mặt công nghệ để sản
xuất chất độc hoá học. Nhng theo một báo cáo của CIA, việc sản xuất
các tác nhân hoá học và sinh học có thể gây sát thơng nhiều ngời
không khó hơn sản xuất heroin và các chất gây mê.
- Việc phát hiện, chẩn đoán và xử trí NĐHL gặp nhiều khó khăn.

Tuy nhiên, sử dụng chất độc hóa học để khủng bố cũng có một số khó
khăn và hạn chế:
-
Khó tạo đợc nồng độ chất độc cao để sát thơng đợc nhiều ngời.
-
Cần phải có những phơng tiện phun rải chất độc thích hợp và giữ đợc
bí mật bất ngờ.

-
Mục tiêu tấn công cần những điều kiện nhất định: tập trung đông
ngời, ở những địa điểm chất độc không bị phân tán quá nhanh.
+ Do chiến tranh có sử dụng vũ khí hoá học (VKHH)
VKHH bắt đầu đợc sử dụng nh một loại vũ khí sát thơng hàng loạt
(Weapon of Mass Destruction-WMD) trong Đại chiến Thế giới lần thứ nhất.
Ngày 22-4-1915 quân đội Đức sử dụng khí clor để tấn công liên quân Anh-Pháp
tại làng Ypres (thuộc Bỉ) làm 5000 ngời chết và 15000 ngời nhiễm độc. Tổng
số chết trong cuộc Đại chiến Thế giới lần thứ nhất là 92.000 ngời và hơn 1,5
triệu ngời nhiễm độc.
Trong đại chiến Thế giới lần thứ hai có nhiều nớc trang bị vũ khí hoá học
và xuất hiện loại chất độc mới, chất độc thần kinh. Trong thời kì chiến tranh
lạnh cuộc chạy đua vũ trang giữa hai phe đã làm gia tăng kho vũ khí hoá học
tàng trữ trên thế giới. Trong những năm 60 của thế kỉ trớc, Mỹ đẩy mạnh việc


6
nghiên cứu phát triển các loại chất độc hoá học mới. Trong đó có vụ thử nghiệm
chất độc VX ở vùng Dugway (Bang Utah) đã làm 6000 con cừu bị chết. Năm
1984, quân đội Irắc dùng chất độc sarin và yperit tấn công vào thành phố Halabja
của ngời Cuốc làm hơn 5000 ngời bị nhiễm độc với tỉ lệ tử vong 15%.
+ Do ô nhiễm môi trờng:
Đã xẩy ra nhiều trờng hợp NĐHL do môi trờng bị ô nhiễm, sau đây là
một số vụ điển hình:
- Nguồn nớc ở Bangladesh bị nhiễm asen là nguyên nhân gây NĐHL lớn
nhất trong lịch sử. Có khoảng một nửa dân số nớc này bị nhiễm độc asen (35
triệu trong số 77 triệu dân).
- Năm 1958 ở vịnh Minamata (Nhật Bản), xuất hiện một loại bệnh lạ trong
c dân địa phơng và sau đó nguyên nhân đợc xác định là do ô nhiễm methyl
thuỷ ngân. Bệnh này sau đó đợc đặt tên là bệnh Minamata.

-Trong hai năm 1971-1972, việc sử dụng thuốc diệt nấm hại hoa mầu có
chứa methyl thuỷ ngân ở Irắc đã làm 6530 ngời nhiễm độc và 500 ngời chết.
+ Do thực phẩm, thuốc và các sản phẩm sinh hoạt trong đời sống bị
nhiễm độc:
Lịch sử đã ghi nhận nhiệu vụ NĐHL do thực phẩm, thuốc và các sản phẩm
sinh hoạt bị nhiễm chất độc vì nhiều lý do khác nhau. Sau đây là một số ví dụ:
- Vụ nhiễm độc dầu ăn ở Tây Ban Nha: 1981, 1000 ngời chết và 25.000
ngời bị nhiễm độc đợc coi là vụ nhiễm độc thực phẩm rất nghiêm trọng trong
lịch sử châu Âu hiện đại. Nguyên nhân là do dầu ăn bị nhiễm hoá chất trừ sâu.
- Tháng 10-1992, 49 trẻ em ở một trờng học thuộc tiểu bang New Jersey
(Mỹ) xuất hiện các biểu hiện nhiễm độc sau bữa ăn tra. Xét nghiệm cho thấy
hàm lợng MetHb trong máu của các trẻ em này đều rất cao và hàm lợng nitrit
trong món súp lên tới 459ppm.
- Năm 1996, ở Haiti xẩy ra vụ 76 trẻ em chết do uống paracetamol nhng
có lẫn diethylenglycol.
- Năm 2002, một số trẻ em ở thành phố New York (Mỹ) bị nhiễm độc
thuốc diệt chuột Trung Quốc.



7
1.2 biện pháp dự phòng và xử trí NĐHL
Mặc dù đã xẩy ra nhiều vụ NĐHL nhng việc nghiên cứu và kế hoạch sẵn
sàng ứng phó với các thảm hoạ hàng loạt do chất độc hoá học các vẫn cha đợc
các nớc quan tâm đúng mức. Sau vụ 11-9, nguy cơ khủng bố bằng các loại vũ
khí sát thơng hàng loạt nói chung, chất độc hoá học nói riêng đã tăng lên rõ rệt.
Vì vậy, nhiều quốc gia đã tiến hành hoạch định các phơng án đối phó khi NĐHL
xẩy ra.
Theo một điều tra ở bang Georgia (Mỹ) do Richard B. tiến hành cho thấy
73% bệnh viện không có phơng án chuẩn bị xử trí thảm họa hàng loạt do chất

độc hoá học và phóng xạ, 73% số bệnh viện có bố trí một vị trí dành cho việc xử
lý vệ sinh, chỉ có 13% số bệnh viện có quy trình xử lý vệ sinh, 3% bệnh viện có
kho thuốc dự trữ thuốc chống độc, 25% số bệnh viện thỉnh thoảng có tập huấn
về xử trí sự cố hàng loạt. Bản điều tra kết luận: tất cả các bệnh viện đều không
sẵn sàng để xử trí các sự cố hàng loạt.
Nguyên nhân của tình hình đó có thể là do: quan niệm cho rằng điều đó
không thể xẩy ra, thiếu hiểu bíêt về sự cố hàng loạt, không có kinh phí và thiếu
phơng tiện, trang bị.


1.3. Phát hiện chất độc trong các vụ NĐHL
Phát hiện và xác định chất độc gây ra NĐHL trong các mẫu sinh học là
một trong những nhiệm vụ quan trọng. Mục đích của công việc này là nhằm phát
hiện sớm các tác nhân gây ngộ độc để sử dụng các thuốc chống độc đặc hiệu và
các biện pháp thích hợp cấp cứu và cứu sống nhanh nhất các nạn nhân.
Công việc này bao gồm các vấn đề:
- Phát hiện sớm các dấu hiệu của một vụ NĐHL và thông báo kịp thời .
- Sử dụng các phơng pháp phát hiện nhanh, có tính chất định tính.
- Lấy mẫu, vận chuyển, bảo quản
- Xử lý mẫu.
- Tiến hành các kỹ thuật phân tích.
- Xử lý và báo cáo kết quả.
Để thông báo kịp thời các thông tin về việc sử dụng VKHH của đối
phơng, các phơng pháp phát hiện phải cho kết quả rất nhanh và với độ nhậy


8
cao. Ví dụ, với nồng độ 0,0005mg/lít sarin có thể gây nhiễm độc sau 5 phút tiếp
xúc. Nh vậy, chất độc cần đợc phát hiện trong khoảng 2-3 phút để có thể thông
báo kịp thời. Tuy nhiên, trong các vụ NĐHL, yêu cầu này khó có thể thực hiện

đợc. Trong vụ khủng bố ở Tokyo năm 1995, phải mất 4 giờ, mới có kết quả
phân tích xác định là do sarin. Trong khí đó, căn cứ vào dấu hiệu lâm sàng, các
nhân viên y tế là những ngời đầu tiên khẳng định nguyên nhân và quyết định sử
dụng thuốc chống độc đặc hiệu.
Phơng pháp phát hiện phải có khả năng xác định đợc chất độc ở nồng
độ thấp hơn mức có thể gây nhiễm độc (nồng độ ngỡng). Ví dụ, nồng độ ngỡng
của sarin là 0,0025 mg/lít/phút, độ nhạy của phơng pháp phát hiện phải đạt là
1.10
-6
mg/lít

Các tiêu chuẩn để lựa chọn phơng pháp phân tích gồm:
+ Độ nhậy
+ Thời gian tiến hành
+ Độ đặc hiệu
+ Chi phí
Ngoài ra, cần u tiên chọn phơng pháp phát hiện các chất độc nguy hiểm,
có độc tính cao và gây nhiễm độc nhanh.

1.3.1. Phơng pháp lấy mẫu:
+ Lấy mẫu sinh học
Lấy mẫu sinh học trong phân tích độc chất phải tuân theo bốn nguyên tắc
chính sau đây:
- Thời gian:
phải lấy đúng thời gian thích hợp.
- Khối lợng mẫu:
Phải đủ lợng mẫu cần thiết để phân tích.
- Bảo quản mẫu:
Mẫu phải đợc bảo quản đúng cách, tránh phân huỷ
và nhiễm bẩn mẫu.

- Vị trí lấy:
Lấy tại vị trí tiếp xúc trực tiếp với chất độc (da, niêm
mạc, dịch dạ dày). Lấy mẫu ở những bộ phận hấp thu, chuyển hoá
và thải trừ chất độc (máu, nớc tiểu, dạ dầy, gan, thận) và những bộ
phận tích luỹ chất độc (não, mô mỡ, xơng)


9

1.3.2 Các phơng pháp xử lý mẫu
Việc phân tích chất độc trong trong các mẫu sinh học (máu, nớc tiểu, mô,
dịch dạ dày) rất khó vì chúng có nồng độ quá bé và nền mẫu rất phức tạp. Vì
vậy, quá trình xử lý mẫu là rất cần thiết nhằm làm giầu mẫu vợt qua ngỡng giới
hạn của các thiết bị phát hiện và loại bỏ các thành phần ảnh hởng của nền mẫu.
Quá trình xử lý mẫu đối với các thể tích lớn thờng rất phức tạp và bị ảnh bởi rất
nhiều yếu tố.
Các phơng pháp xử lý các mẫu gồm chiết pha lỏng và chiết pha rắn.

1.3.2.1 Chiết pha lỏng

+ Chiết lỏng lỏng
Chiết lỏng-lỏng thờng đợc sử dụng để làm sạch hoặc tách các loại cấu tử
ra khỏi mẫu mẹ. Do các độ phân cực của các dung môi nằm trong một khoảng
rộng nên rất thuận lợi cho việc tách. Điểm bất lợi là việc sử dụng một thể tích lớn
dung môi hữu cơ độc hại và đắt tiền, dụng cụ cồng kềnh, hiệu suất thu hồi kém.
Theo I.H. Suffet, để đạt hiệu suất cỡ 90% thì tỷ lệ dung môi mẫu phải có tỷ lệ
1:5.
+ Chiết lỏng - rắn.
Chiết lỏng rắn đợc áp dụng để tách các chất phân tích rắn ra khỏi mẫu vật
rắn bằng dung môi thích hợp. Chất phân tích trong mẫu rắn thờng nằm ở thành

nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn vì vậy cần phải nghiền nhỏ để tăng diện
tích tiếp xúc của dung môi và chất phân tích. Tuỳ thuộc vào độ phân cực của chất
cần tách mà ta lựa chọn dung môi chiết. Phơng pháp này chủ yếu đợc áp dụng
cho các mẫu rắn nh đất, thực vật

1.3.2. 2 Chiết pha rắn (SPE)
Ra đời từ giữa những năm 1970, phơng pháp chiết pha rắn đã dần thay
thế cho phơng pháp chiết pha lỏng và đợc sử dụng rất nhiều trong các lĩnh vực
phân tích. Chiết pha rắn là một phơng pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm
sạch các chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp thụ lên một cột hoặc đĩa pha
rắn, sau đó chất phân tích đợc giải hấp bằng hệ dung môi thích hợp.


10

u điểm của phơng pháp chiết pha rắn là hiệu suất thu hồi cao, khả năng
làm sạch và làm giàu chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, có khả năng tơng thích
với phân tích sắc ký, tiết kiệm dung môi và là một phơng pháp an toàn, đơn giản
dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt do đó tiết kiệm đợc thời gian.

+ Vi chiết pha rắn:
Một kỹ thuật mới của chiết pha rắn là vi chiết pha rắn bao gồm một sợi
thuỷ tinh silic chịu nhiệt phủ phim mỏng pha tĩnh đợc nhúng vào dung dịch
hoặc không gian hơi để hấp lu các chất cần phân tích sau đó đa trực tiếp sợi
này vào injectơ của máy sắc ký khí để giải hấp nhiệt hoặc bộ ghép nối với máy
sắc ký lỏng cao áp để phân tích. Kỹ thuật này đợc áp dụng đầu tiên vào vào phân
tích lợng vết của các chất hữu cơ dễ bay hơi. Gần đây, phơng pháp này đã đợc
áp dụng rộng rãi để phân tích lợng vết các chất với hiệu quả cao.

1.4. Phơng pháp phân tích độc chất trong các mẫu sinh học

trong phòng thí nghiệm
Đến nay có rất nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau đã và đang đợc ứng
dụng. Các kỹ thuật này đợc chia thành hai nhóm đó là phân tích hoá học và kỹ
thuật phân tích công cụ. Các phơng pháp phân tích hoá học có u điểm là đơn
giản, không cần đòi hỏi các máy móc phức tạp, đắt tiền, nhng đòi hỏi nhiều thời
gian, thao tác tỉ mỷ cẩn thận, nhng chỉ cho phép xác định đợc các chất với hàm
lợng lớn hơn 0,1%.
Các kỹ thuật phân tích công cụ hiện đại dùng trong các phòng thí nghiệm
nói chung và các phòng phân tích độc chất nói riêng có rất nhiều loại khác nhau.
Mỗi loại đều dựa trên các tính chất nhất định của các chất phân tích để xác định
chúng. Dựa theo phép đo, các phơng pháp này đợc chia thành 5 nhóm:
-
Các phơng pháp quang hoá.
-
Các phơng pháp điện hoá.
-
Các phơng pháp sắc ký.
- Phơng pháp điện di.
-
Các kỹ thuật hỗn hợp khác.




11
1.4.1 Phơng pháp quang hoá.
Trong phân tích định lợng, những phơng pháp dựa trên sự hấp thụ ánh
sáng đợc sử dụng rất phổ biến.
Đến nay các phơng pháp đo quang trong phân tích có rất nhiều loại.
Nhng cơ bản đợc xây dựng theo các tính chất quang hoá học hay quang lý học

của các chất (nguyên tử, phân tử, nhóm phân tử) trong những điều kiện xác định.
Tuỳ theo bản chất của sự sinh ra phổ mà có các loại phổ sau đây:
+Phổ nguyên tử:
do sự chuyển mức năng lợng của các điện tử hoá trị của
nguyên tử bị kích thích tạo ra, gồm có: phổ phát xạ nguyên tử (AES và ICP-AES);
phổ hấp thụ nguyên tử(AAS); phổ huỳnh quang nguyên tử (AAS).
+Phổ của nguyên tử:
do các điện tử nội

(lớp K và L) của nguyên tử khi
kích thích mà sinh ra, gồm có: Phổ phát xạ và nhiễu xạ tia X; phổ huỳnh quang
tia X (đây là hai nhóm phổ của nguyên tử tự do ở trạng thái khí).
+
Phổ của phân tử:
do các điện tử hoá trị nằm trong trạng thái liên kết
của phân tử khi bị kích thích sinh ra, gồm có: phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS); phổ
hấp thụ hồng ngoại (IR); phổ tán xạ Raman (RS).
+ Phổ khối lợng (MS):
do các mảnh khối lợng của chất (nguyên tử
hay nhóm nguyên tử) của chất phân tích khi bị ion hoá tạo thành và chúng sinh ra
phổ theo độ lớn của khối lợng.
+ Phổ cộng hởng từ:
do sự cộng hởng từ của điện tử hay của hạt nhân
nguyên tử tạo ra. Loại phổ này gồm hai kiểu: Cộng hởng từ hạt nhân (NMRS) và
cộng hởng từ điện tử (EMRS)
Các phơng pháp phân tích theo phổ có u điểm nh: nhanh, xét nghiệm
hàng loạt, nồng độ phân tích thấp, có thể định tính và định lợng, có phơng pháp
phục vụ đợc cả xác định cấu trúc phân tử.
Đối với việc nghiên cứu và phân tích các chất độc trong các phòng thí
nghiệm, các phơng pháp phổ có nhiều u việt, đợc sử dụng phổ biến hiện nay.

1.4.2 Phơng pháp điện di
Điện di là hiện tợng chuyển động của các phần tử nhỏ hay các phần tử
mang điện trong một chất giá dới ảnh hởng của điện trờng. Sự phát hiện hiện
tợng này đã có từ lâu, nhng mãi đến năm 1809 mới đợc mô tả chi tiết lần đầu
bởi nhà Bác học Nga Reuss.


12
Trong những năm gần đây, điện di đã phát triển trở thành kỹ thuật rất có
tiềm năng. Lúc đầu, điện di đợc ứng dụng chủ yếu vào phân tích sinh học,
nhng gần đây, kỹ thuật này đã đợc áp dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hoá
học. Do điện di có khả năng phân tách nhanh và có hiệu quả các hợp chất dạng
ion, ion hoá và các hợp chất trung tính và dựa trên một kỹ thuật phân tác khác với
sắc ký khí và sắc ký lỏng nên nó là một kỹ thuật rất có giá trị và có thể kết hợp
với các phơng pháp sắc ký hiện đại để phân tích một số độc chất, khi các chất đó
không thể phân tích đợc bằng các phơng pháp sắc ký.

1.4.3. Phơng pháp sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật vật lý và hoá lý để tách và phân tích các chất trong
một hỗn hợp. Cơ sở của sự tách sắc ký là có sự phân bố các chất giữa hai pha:
một pha cố định (pha tĩnh) và một pha di động (pha động) theo các tính chất hoá
lý nhất định nh:
-
Sự hấp phụ.
-
Sự trao đổi ion.
-
Sự phân bố giữa hai tớng.
- Sự rây phân tử

Vì thế ứng với mỗi loại bản chất của sự tơng tác đó ngời ta có một loại
sắc ký riêng. Quá trính sắc ký đợc thực hiện xảy ra giữa hai pha: pha tĩnh và pha
động. Căn cứ vào pha động hoặc hình dạng giá tựa của pha tĩnh ngời ta chia sắc
ký thành nhiều nhóm: Pha động là khí là sắc ký khí, pha động là lỏng là sắc ký
lỏng. Hay - sắc ký cột, sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký điện di
Một số loại sắc ký thông dụng thờng đợc sử dụng trong các phòng thí
nghiệm phân tích độc chất là: Sắc ký lỏng, sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng và các
loại sắc ký lỏng, sắc ký khí ghép khối phổ.

+ Sắc ký lớp mỏng (TCL)
Phơng pháp sắc ký lớp mỏng đợc phát triển từ những năm 1950 và ứng
dụng rộng rãi vì đây là phơng pháp đơn giản, rẻ tiền.
Ngày nay với sự cải tiến về kỹ thuật và có sự kết nối trực tiếp sắc ký lớp
mỏng với các phơng pháp phổ và các phơng pháp phân tích khác. Sắc ký lớp


13
mỏng đã phát triển thành một kỹ thuật phân tích công cụ có thể tự động hoá, đợc
ứng dụng trong các phòng phân tích độc chất hiện đại.

+ Sắc ký khí (GC)
Sắc ký khí đợc sử dụng rộng rãi nhất trong các phơng pháp sắc ký để
phân tích các chất độc trong các phòng thí nghiệm hiện đại do tính u việt của nó
về độ nhạy và độ phân giải cao. Hệ thống GC với các cột mao quản có khả năng
phân tách cao, các loại detectơ có độ nhậy và độ chính xác cao và khả năng kết
nối với khối phổ (MS) cho phép xác định một lợng lớn các chất tại nồng độ phát
hiện thấp tới ppb.
Thiết bị GC gồm nhiều bộ phận, nhng có 2 bộ phận quan trọng nhất là
cột tách và detector. Nhờ hệ thống khí mang, mẫu phân tích đợc bơm vào buồng
bơm mẫu và sau đó đợc dẫn vào cột tách. Các cấu tử trong hỗn hợp mẫu sẽ rời

bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau và lần lợt đi vào detector, sự có mặt của
từng cấu tử đợc chuyển thành tín hiệu điện, khuyếch đại, ghi lại và thu đợc kết
quả là các sắc đồ. Có nhiều loại cột tách khác nhau và cần đạt các yêu cầu sau:
- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha động và pha tĩnh;
- Có độ thấm cao;
- Có khả năng tải trọng và hoà tan cao các cấu tử trong pha tĩnh;
- Có khoảng cách sử dụng nhiệt độ lớn, làm việc đợc ở nhiệt độ cao.
Cột tách sử dụng trong GC có thể là cột nhồi hoặc cột mao quản. Cột nhồi
đợc chế tạo từ thuỷ tinh hoặc thép không gỉ, bên trong cột nhồi chứa chất mang,
trên bề mặt chất mang đợc tẩm một lớp pha lỏng tơng ứng. Cột mao quản đợc
chế tạo từ thuỷ tinh thông thờng hoặc thuỷ tinh thạch anh với pha lỏng đợc tẩm
trên thành trong của ống mao quản. Cột mao quản có khả năng tách tốt, độ nhậy
cao.
Detector là một bộ phận rất quan trọng trong GC, dùng để phát hiện các
cấu tử trong hỗn hợp nghiên cứu. Detector phải có khả năng phát hiện mọi cấu tử
ở nồng độ thấp. Hiện nay, các detector đã có khả năng phát hiện lợng chất ở
mức độ ppb, ppt.
Có nhiều loại detector nh
:


14

- Detector dẫn nhiệt TCD
: Nhận biết các chất theo nguyên lý so sánh độ
dẫn nhiệt của khí mang tinh khiết và khí mangcó chứa cấu tử cần tách. Detector
TCD thờng dùng để phân tích các khí vô cơ.

- Detector ion hoá ngọn lửa FID
: Nhận biết các chất dựa trên sự biến đổi

độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trờng khi có chất cần tách
chuyển qua. Nhờ nhiệt độ ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ bị bẻ gẫy mạch, bị ion
hoá để trở thành các ion trái dấu. Các ion tạo thành đợc chuyển về các bản cực
trái dấu có hiệu điện thế cao nằm ở 2 phía của ngọn lửa. Dòng ion tạo nên sự sụt
giảm hiệu điện thế, độ sụt áp đợc ghi lại và khuyếch đại để ghi nhận sự có mặt
của các cấu tử cần tách
Độ nhậy của detector FID cao hơn TCD nhiều lần ( 100- 1000 lần). Tuy nhiên,
detector FID chỉ thích hợp để phát hiện các hợp chất hữu cơ đơn thuần.

- Detector cộng kết điện tử ECD
: Detector ECD có chứa một nguồn phóng
xạ

đợc phát ra từ nguồn phóng xạ Ni
63
bắn phá các phân tử khí mang, tạo ra
các ion dơng và các điện tử sơ cấp. Nhờ tác dụng của điện trờng tạo ra sẵn
trong detector, các điện tử và ion dơng chuyển động về các bản điện cực trái dấu
tạo thành dòng điện nền. Nếu dòng điện khí mang chứa mẫu là những chất mà
phân tử của chúng có khả năng cộng kết điện tử thì các điện tử sơ cấp sẽ bị các
nguyên tử hoặc phân tử này bắt giữ, làm sụt dòng điện nền, tạo thành tín hiệu
tơng ứng. Các peak tín hiệu có độ lớn tơng ứng với lợng chất có trong mẫu.
Detector ECD có các đặc trng sau: nhậy cảm với nồng độ, giới hạn phát hiện
10
-14
g/giây, khoảng động học 10
-4
- 10
-5
và có độ ổn định khá cao. Detector ECD

chọn lọc với các hợp chất ái điện tử, ví dụ: các hợp chất hữu cơ chứa các nguyên
tố phân nhóm 5,6,7 nh N; P; 0; S và halogen.
-
Detector nhiệt ion hoá ngọn lửa FTD ( thờng gọi là NPD):
Chọn lọc
với các hợp chất chứa nguyên tố nitơ, photpho.


+ Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) đợc công nhận nh là một kỹ thuật có
độ chính xác và độ nhạy cao để áp dụng cho phân tích lợng vết và siêu vết, vì
sắc ký khí là một phơng pháp rất hiệu quả trong việc tách rất nhiều cấu tử nhng
lại khó khăn trong việc định tính các chất có trong hỗn hợp phức tạp đó. Ngợc
lại, khối phổ không có khả năng tách chất nhng lại cho phép ta định tính và dự


15
đoán và làm sáng tỏ cấu trúc của các chất lạ từ những thông tin thu đợc của khối
phổ đồ. Nh vậy hệ liên hợp sắc ký khí - khối phổ là một kỹ thuật ghép nối nhằm
mục đích đạt đợc những chức năng u việt của hai thiết bị riêng rẽ.
Trong kỹ thuật khối phổ có hai phơng pháp ion hóa: bắn phá điện tử (EI)
và ion hóa bằng hóa học (CI). Kỹ thuật EI đợc sử dụng phổ biến hơn trong phân
tích các chất độc chiến tranh. Sự gắn kết GC và hai MS liên tiếp tỏ ra có nhiều
hiệu quả và đợc rất nhiều nghiên cứu đề cập khi tiến hành phân tích các chất độc
chiến tranh đặc biệt là các chất độc nhóm lân hữu cơ.
Phơng pháp GS-MS là phơng pháp rất phổ thông trong các phòng thí
nghiệm nghiên cứu về các chất độc. Borrett và cộng sự đã dùng phơng pháp này
với cả hai kỹ thuật ion hóa để nghiên cứu xác định khoảng 60 chất độc khác nhau
của nhóm các chất độc lân hữu cơ, tìm đợc các ion mảnh đặc trng của chúng.
Sokolowski và Witkiewicz sử dụng GC-MS làm công cụ nghiên cứu sự phân hủy

của chất độc sarin trong các loại ancol mạch thẳng [53]. Dagostino và Provost đã
sử dụng kỹ thuật GC-EI-MS nghiên cứu quá trình thủy phân của một số chất
nhóm lân hữu cơ, sử dụng dung môi dichloromethane để chiết.
Nhìn chung phơng pháp GC-MS cho phép xác định các chất độc ở giới
hạn tơng đối thấp khoảng ng trong các mẫu có thành phần nền phức tạp.
Dagostino đã nghiên cứu gắn hai lần MS đã cho phép có thể phát hiện từ 30-70
pg các chất độc nhóm này, trong đó chất độc sarin định lợng ở số khối từ 99-79
m/z [53].
Phơng pháp GC-MS đã đợc dùng phân tích các mẫu thực tế thu tại làng
ngời Kurd ở phía bắc Irắc, giáp biên giới Iran khi quân đội dùng để đàn áp ngời
Kurd. Từ các mẫu nh đất, mảnh bom, tấm thảm đã tìm thấy 21 chất khác nhau.
Phơng pháp này đợc dùng để phân tích các mẫu huyết thanh của các nạn nhân
trong vụ khủng bố bằng chất độc sarin năm 1995 ở Tokyo và nhận thấy nồng độ
chất độc sarin trong các mẫu huyết thanh của nạn nhân từ 0,2-4,1 ng/ml [63].
Black và các cộng sự đã sử dụng ph
ơng pháp GC-MS và GC-MS-MS
phân tích các chất độc chiến tranh bằng kỹ thuật SIM (chọn lọc ion), xác định các
chất trong các mẫu nh đất, mẫu quần áo, mảnh kim loại. Kết quả nghiên cứu cho
thấy trong 6 mẫu đất nghiên cứu tác giả đã tìm thấy chất độc sarin và các sản
phẩn chuyển hóa của chúng. Với kỹ thuật này cho phép phát hiện nồng độ của
các chất này trong mẫu môi trờng tơng đối thấp từ ppm-ppb.


16

+ Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS).
Hiện nay phơng pháp này đợc phát triển rất nhanh đặc biệt là kỹ thuật
ghép nối hai lần khối phổ. Phơng pháp này cho phép mở rộng việc phân tích đối
với các chất độc chiến tranh, đặc biệt đối với các sản phẩm chuyển hóa của chúng
trong những mẫu có thành phần nền phức tạp. Từ những năm 1980, rất nhiều kỹ

thuật LC-MS đợc nghiên cứu nhng liên quan đến các chất độc chiến tranh thì
kỹ thuật TS-MS (ion hóa bằng phun nhiệt) đợc ứng dụng nhiều hơn cả ngay từ
những năm đầu 1990. Một số tác giả nghiên cứu và nhận thấy tính u việt của kỹ
thuật này khi phân tích các chất độc chiến tranh.
Kỹ thuật TS-MS rất tiện dụng, đơn giản đã đợc các tác giả ứng dụng phân
tích xác định chất độc sarin và các chất nhóm độc thần kinh cũng nh các sản
phẩm phân hủy của chúng. Nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật TS-MS-MS để
xác định các chất phân hủy của nhóm lân hữu cơ trong các mẫu nớc. Các phổ
ion thu đợc cho các dữ liệu để xác định các chất, ngoài ra tỷ lệ các tín hiệu
nhiễu cũng đợc tăng lên. Nhìn chung kỹ thuật ghép hai lần khối phổ đợc sử
dụng để tăng độ chính xác khi xác định một chất chuyển hóa trên nền mẫu có
thành phần phức tạp.
Có một số kỹ thuật ion hóa khác cũng đợc ứng dụng để xác định các sản
phẩm chuyển hóa nh ES-MS-MS với ion âm tỏ ra có hiệu quả hơn ion dơng.
Black và Read đã dùng kỹ thuật LC-APCI-MS để phân tích các sản phẩm thủy
phân của các chất độc thần kinh và của chất độc loét da yperit. Đặc biệt đã ứng
dụng LC-MS trong phân tích các sản phẩm phân hủy của các chất độc thần kinh
trong các mẫu sinh học. Noort và cộng sự đã dùng kỹ thuật micro-LC-ES-MS-MS
để kiểm tra IMPA - một sản phẩm thủy phân của chất độc sarin trong các mẫu
môi trờng cũng nh trong mẫu sinh học. Phơng pháp cho phép phát hiện IMPA
trong huyết thanh của các nạn nhân tại Tokyo, kết quả cho thấy hàm lợng IMPA
trong huyết thanh của các nạn nhân có hàm lợng từ 1-135 ng/ml.
DAgostino và các cộng sự dùng kỹ thuật LC-ESI-MS để xác định chất
độc sarin, soman và các chất chuyển hóa của chúng bằng kỹ thuật chiết siêu tới
hạn, với cột mao quản để phân tích, có sự so sánh với phơng pháp GC-MS đối
với các mẫu đất khác nhau.



17

+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):
Sắc khí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp phân tích hiện đại và đợc
ứng dụng rất rộng rãi. Với những u điểm riêng của mình, nó đã tỏ ra rất có hiệu
quả không những trong các lĩnh vực nghiên cứu cơ bản mà còn trong nhiều lĩnh
vực khác. HPLC bổ xung cho sắc ký khí vì nó cho phép phân tích các hợp chất
không ổn định nhiệt, không bay hơi và độ phân cực cao. HPLC thích hợp với việc
phân tích lợng vết các hỗn hợp chất có độ phân cực khác nhau lớn.
Pha tĩnh trong HPLC theo các kỹ thuật phân tách sau: sắc ký hấp phụ, sắc
ký pha đảo, sắc ký trao đổi ion và sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký pha đảo
đợc sử dụng thông dụng nhất.
Các loại pha động đợc lựa chọn dựa vào cả các chất phân tích và kiểu
tách, kiểu xác định.
Sự phân tách các chất thờng sử dụng kiểu pha động gradien thành phần
giữa nớc và một dung môi hữu cơ thích hợp, thờng là metanol và acetonitril.
Một dung môi hữu cơ thứ ba có thể sử dụng, nh tetrahydrofuran cũng đợc sử
dụng nhng với hàm lợng thấp hơn. Ngoài ra một số muối vô cơ thỉnh thoảng
cũng đợc thêm vào pha động.
Các detectơ của HPLC thờng là UV, huỳnh quang (FLD), điện hoá. Có
nhiều loại detectơ nh: detectơ hấp thụ quang phân tử UV-Vis, detector huỳnh
quang, detector khối phổ, detector đo chiết suất, detector đo độ dẫn

+ REMIDi HS (Rapid Emergency Drug identification High Sensitivity)
REMIDi HS của hãng BIO-RAD (Mỹ) là một thiết bị kết hợp giữa HPLC
với một hệ thống xử lý mẫu tự động có thể tách, chiết lợng vết các chất phân
tích từ mẫu sinh học và một số nền mẫu đơn giản khác. Bên cạnh đó, hệ thống
REMEDi HS đợc trang bị sẵn phần mềm tự động nhận dạng chất dựa vào 1 th
viện gần 1000 chất độc thờng gặp và có thể bổ xung các chất mới vào th viện
nhận dạng.
REMIDi HS đợc chế tạo với chức năng chính là sàng lọc (screening) vì
nhiều trờng hợp nhiễm độc do nhiều loại chất độc kết hợp và không dự đoán

trớc đợc chất gây nhiễm độc. Tuy nhiên, hệ thống này cũng có thể dùng để
định lợng.


18
Khác với các thiết bị phân tích sắc ký khác (sắc ký khí, sắc ký lỏng cao
áp) hệ thống REMIDi HS không cần phải dự đoán trwớc chất cần tìm để lựa
chọn các điều kiện phân tích và xử lý mẫu thích hợp. Quá trình chuẩn bị mẫu
đợc đơn giản hoá tối đa. Quá trình tách chiết mẫu đợc tự động hoá, có thể đo
50 mẫu cùng một lúc, rút ngắn thời gian phân tích.
Độ nhạy của hệ thống khá cao: ngỡng phát hiện của REMIDi HS đối với
hầu hết các thuốc là 100
ữ
300ng/l.
Do đó REMIDi HS có thể phục vụ đợc rất nhiều các chuyên ngành khác
nhau nh:
-
Cấp cứu nhiễm độc.
-
Độc học lâm sàng.
-
Độc học hình sự.
-
Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng.
-
Xác định và định lợng độc chất.
-
Theo dõi thuốc trong điều trị.
-

Đây là một thiết bị phù hợp để áp dụng trong các phòng thí nghiệm độc
chất hiện đại.
+ Phơng pháp Biosensor:
Biosensor là một phơng tiện phân tích mới dựa trên sự kết hợp của công
nghệ sinh học và điện tử.
Hình 1.1: Cấu tạo của Biosensor




19

Cấu tạo của Biosensor gồm có:

Thành phần sinh học
: Vi khuẩn, mô, thụ thể, enzym, kháng thể, acid
nucleic



Transducer
: Điện cực, sợi quang học, tinh thể áp điện, bán dẫn.
Khi chất cần phân tích tác dụng với thành phần sinh học sẽ tạo nên một
phản ứng sinh học, tín hiệu này sẽ đợc bộ phận transducer tiếp nhận và chuyển
đến bộ phận điện tử để chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu vật lý, sau đó
ghi lại.
Sử dụng biosensor có các u điểm sau:
- Độ nhậy và độ đặc hiệu cao.
- Quy trình tiến hành đơn giản, công việc xử lý mẫu không phức tạp.
- Thời gian tiến hành nhanh, có thể thực hiện trong điều kiện dã ngoại.

- Giá thành tơng đổi rẻ so với các phơng pháp phân tích truyền thống.
- Thiết bị đo đơn giản, không phức tạp nh sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu
năng cao Thiết bị đo sử dụng biosensor phát hiện kim loại nặng chỉ là một máy
đo cờng độ ánh sáng.
Ngày nay, biosensor đợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực nh:
- Y học: Ví dụ: biosensor phát hiện đờng, insulin trong máu
- Dợc: Kiểm nghiệm thuốc.
- Môi trờng: biosensor phát hiện kim loại nặng asen, thuỷ ngân, chì
trong nớc,đất.
- An toàn thực phẩm: biosensor phát hiện chất độc trong rau quả, thịt, cá.
- Công nghiệp mỏ: phát hiện các loại khí độc.
- Kiểm tra an ninh sân bay: biosensor phát hiện thuốc nổ, ma tuý.
- Quân sự và chống khủng bố: Biosensor đợc dùng để phát hiện chất độc
quân sự. Mỹ đã chế tạo đợc biosensor phát hiện chất độc thần kinh.
Bộ môn độc học và Phóng xạ quân sự Học viên Quân y trong khuôn khổ
đề tài nhà nớc KC10-13 đã nhập biosensor phát hiện asen, thuỷ ngân và áp dụng
trong thực tế.






20

Hình 1.2: Nguyên lý phát hiện kim loại nặng bằng phơng pháp biosensor
Nguyên lý phát hiện kim loại nặng bằng phơng pháp biosensor
1. Trong mẫu thử không có kim loại nặng: quá trình tổng hợp luciferase bị ức
chế, làm cho mức độ phát sáng của vi khuẩn thấp.
2. Trong mẫu thử có kim loại nặng: Quá trình tổng hợp luciferase đợc hoạt

hoá, làm vi khuẩn phát sáng ở mức độ cao.

Xét nghiệm asen (Arsenic Biotest for detection of Arsenic compounds)
của hãng Aboatox sử dụng vi khuẩn Escherichia coli MC 1061. Khi có mặt của
asen trong mẫu thử, vi khuẩn sẽ tăng cờng độ phát sáng và sử dụng thiết bị đo
cờng độ ánh sáng Aboatox 1253 để phát hiện asen.
Kỹ thuật này có giới hạn phát hiện thấp (với asen là 2-4ppb; thuỷ ngân là
0,05-2ppb), độ chính xác và độ nhạy cao, tiến hành đơn giản hơn so với các xét
nghiệm kim loại truyền thống nh quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), điện hoá,
trắc quang Thời gian xét nghiệm nhanh, có thể tiến hành hàng trăm xét nghiệm
trong ngày. Thiết bị nhỏ, gọn, có thể xét nghiệm ngay tại hiện trờng, giá thành
rẻ.

+ Phơng pháp sinh hoá
Phơng pháp phân tích CĐHH dựa trên phản ứng sinh hoá có thể chia làm 3 loại:
- Xác định hoạt tính enzym,
- Xác định cơ chất,
- Xác định chất ức chế enzym. Trong đó, xác định hoạt tính enzym đợc
sử dụng rộng rãi hơn cả.



21
- Xác định hoạt tính của enzym cholinesterase
Phơng pháp xác định hoạt tính enzym cholinesterase (ChE) đợc ứng
dụng phổ biến để phát hiện hợp chất lân hữu cơ và cacbamat. Vì cơ chế của hợp
chất lân hữu cơ và cacbamat là ức chế ChE, làm ngừng phản ứng thuỷ phân
acetylcholin thành acid acetic và cholin, ngời ta đã sử dụng việc xác dịnh hoạt
tính enzym nay để định tính và định lợng loại chất độc này:
ChE

Acetycholin Acid acetic
+
cholin

Việc xác định hoạt tính enzym ChE bằng cách đánh giá tốc độ phản ứng
thuỷ phân acetylcholin thông qua sự hình thành các sản phẩm của phản ứng là
acid acetic và cholin. Có nhiều phơng pháp xác định hoạt tính ChE. Phơng
pháp kinh điển là đo số lợng acid acetic tạo thành nh một thớc đo cho hoạt
tính enzym ChE. Phơng pháp xác định hoạt tính ChE phổ biến hiện nay là
phơng pháp Ellman.
Tác giả Ammon đa ra khái niệm
đơn vị ChE
là lợng enzym trong 1
giờ, ở nhiệt độ 37
0
C và pH 7,4 thuỷ phân10
-6
M acetylcholin.
Đã có nhiều loại phơng tiện phát hiện CĐTK dựa trên nguyên lý xác định
hoạt tính ChE nh:
- Giấy thử CĐTK,
- Kit phát hiện nhanh CĐTK.
Ngoài ra còn có rất nhiều các phơng pháp khác đợc sử dụng trong các
phòng thí nghiệm phân tích, nh:
-
Phơng pháp miễn dịch,
-

Phơng pháp phân tích đồng vị phóng xạ


22
Chơng II
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng nghiên cứu:
Đối tợng nghiên cứu của đề tài là các mẫu sinh học ( máu, nớc tiểu, dịch
nôn )
Hoá chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
+ Hoá chất
Các dung môi sau đều là loại hoá chất tinh khiết phân tích và loại cho
HPLC do Merck và Prolabo cung cấp:
- Etylacetat
-
Metanol
-
Etanol
-
n-Hexan
-
n-Butanol
-
Isopopanol
- Aceton
-
Ether ethylic
-
Dichloroethan

-
Chloroform
Các các hoá chất sau đều là loại hoá chất tinh khiết phân tích do Merck và
Prolabo cung cấp:
-
Kali thiocyanat;
-
Kali cyanua;
-
Acid picric;
-
Natricacbonat;
-
Kalipermangant;
- Acid sulfuric;
-
Acid acetic
-
Amoni hydroxit
-
Natri sunphat
-
Natri hydroxyt


23
-
Natri cacbonat
-
Natri cyanua

-
Bari clorua
-
Acid clohydric
-
Acid photphotungstic
- Khí Nitơ
-
Than hoạt tính
-
Nihydrin (Merck).
-
Acid tricloraxetic
-
Silicagel 60 (kích thớc hạt 0,063 - 0,200 mm) của Merck
-
Catridge BOND
II
ODS-C18 loại 200 mg hãng ACCU;
- Kít hoá chất và dung môi chạy máy chuyên dùng cho thiết bị
REMIDi HS do hãng Biorad (Mỹ) cung cấp.

Các hoá chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu và phân tích asen đều là
loại hoá chất tinh khiết không lẫn asen gồm:
- Acid sulfuric đặc
-
Acid clohydric đặc
-
Acid nitric đặc.
-

H
2
O
2
đặc.
-
Kali permanganat
-
Kali iodua.
- NaBH
4
.
-
LaCl
3
.
-
Acid tartric.
+ Thiết bị
-
Máy sắc ký lỏng cao áp - Perkin Elmer (Mỹ).
-
Hệ thống REMIDi HS (Mỹ).
-
Thiết bị phát hiện asen theo nguyên lý biosensor (kit phát hiện asen và
máy đo Aboatox 1253- Phần Lan)
-
Máy quang phổ tử ngoại UV-VIS 3010 Shimadzu (Nhật Bản)
-
Máy quang phổ tử ngoại khả kiếm CAMSPEC M350 (Anh).

24
-
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AA6501S
Bộ phận tạo hydrua HVG-1.
Đèn catot rỗng.
-
Lò vi sóng ETHOSD Microwave Labstation Milestone.
-
Máy ly tâm Rotofix 32, ALC 4232 Cetrifuge.
-
Máy ly tâm phù hợp với các cột 16
ì
125mm, với lực ly tâm tối đa
10000 vòng/phút
-
Hệ thống cất chân không
-
Hệ thống cô bằng khí nitơ
-
Máy lắc ống nghiệm Minishaker M1 IKAR
-
Thiết bị ổn nhiệt.
-
Hệ thống cất và vi cất;
-
Máy đo pH
-
Cân kỹ thuật điện tử có độ chính xác đến 0,01g

-
Cân phân tích điện tử có độ chính xác đến 0,0001 g.

+ Dụng cụ
- ố
ng nghiệm nhựa chuyên dụng (cuvet dùng cho thiết bị Aboatox
1253).
- ố
ng ly tâm nhựa 1,5ml có nút đậy.
- ống lọc (0,22
à
m) (BIO-RAD chuyên dùng cho hệ thống REMIDi HS)
-
Thìa xúc hoá chất (kim loại).
-
Các ống nghiệm lấy máu
-
Cốc betxe nhựa chia vạch.
-
Chai đựng hoá chất nhựa.
-
Giấy thử pH
-
Lọ đựng mẫu dùng cho GC: 2ml
-
Bình định mức các loại dung tích: 10 ml, 25 ml 50 ml và 100 ml
-
Bộ pipetman: 10àl-5 ml.
- ố
ng ly tâm 15 ml, 50 ml thuỷ tinh hoặc polypropylen có nắp đậy

-
Chén nung teflon dung tích 100 ml có nắp đậy.
-
Bình Kieldal dung tích 100, 200 ml.