Xác định hàm lượng tạp acid succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

BỘ YTÌ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÂ NỘI
ĐỖ ĐỈNH HẢI
XẤC BỊNH HÀM LIIDNe TẠP ACID SUCCINIC
KHI ĐỊNH Linme ARTESUNAT NBUYÊN LIỆU
BẰNG PHưUNG PHẮP HPLC
(KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOĂ 2001- 2006)
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Trần Đức Hậu
Th.s Trần Thị Lan Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược
■ ■
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: Tháng 2 - 5/2006.
/V
HẰ NỘI - T5/2006
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành
nhất tới những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn
thành khoá luận này:
PGS.TS.Trần Đức Hậu, Chủ nhiệm bộ môn Hoá dược.
Th.S.Trần Thị Lan Hương, Giảng viên bộ môn Hoá dược.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ của bộ
môn Hoá dược đã giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành khoá luận này.
Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các cán bộ bộ môn Hoá
phân tích, Hoá vô cơ.
Cuối cùng xin cảm otti gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên,
khích lệ tôi trong thời gian qua.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên : Đỗ Đình Hải

MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
ĐẶT VÂN ĐỂ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về artesunat 3
1.2. Tổng quan về tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu 5
1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8
PHẦN 2; THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 19
2.1. Đối tượng, thiết bị, hoá chất, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19
2.2. Thực nghiệm và kết quả 21
2.2.1. Xác định hàm lượng acid succinic trong artesunat nguyên liệu 21
2.2.1.1. Phương pháp định lượng acid succinic khi định lượng
artesunat bằng HPLC 21
2.2.1.2. Thử tính tích hợp của hệ thống 21
2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng 23
2.2.2.1. Đánh giá tính tuyến tính của phưcfng pháp 23
2.22.2.
Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 24
2.2.2.3. Đánh giá tính đúng của phương pháp 25
2.2.2.4. Tính đặc hiệu của phương pháp 28
21.25. Xác định giới hạn định lượng acid succinic theo phương
pháp xây dựng 31
2.2.2.Ỏ. Xây dựng cách xác định acid succinic trong arthesunat
khi không có acid succinic chuẩn 32
2.2.3. Kết quả 35
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT 38
3.1. Kết luận 38
3.2. Đề xuất 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHỮ VIẾT TẮT

DHA
Dihydro artemisinin
Ds
Dược sỹ
HPLC High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD Limit of detection
: Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification : Giới hạn định lượng
NXB
: Nhà xuất bản
PA
: Tinh khiết phân tích
ĐẶT VẤN ĐỂ
Sốt rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội. Điều đáng lo ngại là việc
điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét đã và đang
kháng với các loại thuốc điều trị sốt rét kinh điển như: Cloroquin, Mefloquin,
Primaquin [13].
Vào năm 1972, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được
artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng. Artemisinin có hiệu lực điều trị sốt rét
nhanh, mạnh trên các bệnh nhân bị sốt rét do nhiễm chủng p. falciparum
kháng thuốc và sốt rét thể não [7]. Tuy nhiên, artemisinin có hạn chế là: khả
năng hoà tan kém, tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao. Để khắc phục những
hạn chế này người ta đã bán tổng hợp ra artesunat với ưu điểm có hoạt lực
điều trị mạnh hơn, lại dễ tan hơn artemisinin. Hiện nay aitesunat được sử dụng
rộng rãi và là một trong những niềm hy vọng lớn của con người trong cuộc
chiến chống lại sốt rét.
Cùng với sự gia tăng nhu cầu sử dụng artesunat, việc kiểm tra chất lượng
aitesunat trong nguyên liệu và thành phẩm là rất cần thiết.

DHA và acid succinic là 2 tạp thường gặp nhất trong artesunat do quá
trình sản xuất và bảo quản. Các tạp chất này làm giảm chất lượng thuốc, giảm
hiệu lực điều trị và ảnh hưởng tới kết quả định lượng artesunat. Theo các
phưoỉng pháp định lượng artesunat đang áp dụng ở Việt Nam, khi trong chế
phẩm cần định lượng có lẫn 1% acid succinic thì kết quả định lượng theo
phương pháp ghi trong tiêu chuẩn cơ sở tăng khoảng 6,5%. Khi trong chế
phẩm cần định lượng có lẫn 1% DHA thì kết quả định lượng theo phương
pháp ghi trong tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III tăng khoảng 1,4% [4]. Vì
vậy việc xác định hàm lượng các tạp chất này là rất quan trọng. Trong đề tài
này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu “ Xác định hàm lượng tạp acid
succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC”
nhằm đạt hai mục tiêu chính:
1. Dựa trên phương pháp định lượng artesunat bằng phương pháp
HPLC, xác định hàm lượng acỉd succỉnỉc trong nguyên liệu artesunat khi
có hoặc không có acỉd succỉnỉc chuẩn.
2. Đánh giá phương pháp định lượng acid succinic bằng HPLC dưới
dạng tạp chất theo các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT
1.1.1. Một số tính chất của artesunat
- Công thức hoá học [2]:
- Công thức phân tử: ^19^2808'
- Khối lượng phân tử: 384,43.
-Tên khoa học:
(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-decahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-
epoxy-pyrano[4,3-j]l»2-benzodioxepin-10-ol, hydrogen succinat.
-Tên khác: acid artesunic, Dihydro artemisinin -lOa - hemisuccinat.
- Tính chất:
Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, rất khó tan trong
nước, rất dễ tan trong dicloromethan, dễ tan trong ethanol, methanol và

aceton [2].
Điểm chảy: 142®c đến 145°c.
Góc quay cực riêng: = +2,5° đến +3,5° (dung dịch artesunat trong
dicloromethan).
Hỗn dịch 1% trong nước có pH từ 3,5 đến 4,5 [21].
1.1.2. Nguồn gốc, cách điều chế
+ Nguồn gốci Artemisinin phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng có tác
dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng Cloroquin. Tuy vậy,
artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh
nhân sạch ký sinh trùng trong máu.
Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất
của artemisinin, trong đó đáng chú ý là artesunat có tác dụng tốt, tan trong
dung dịch kiềm dùng để pha thuốc tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát
và vì vậy được dùng phổ biến hơn cả.
+ Điều chế: Trên cơ sở phương pháp của các nhà khoa học Trung Quốc,
D. L. Klayman, p. Brossi và cộng sự, Đỗ Hữu Nghị và cộng sự tại trường Đại
học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp tổng hợp artesunat
qua hai giai đoạn với hiệu suất cao [12]:
Giai đoạn 1:
- Bán tổng hợp dihydroartemisinin (DHA): Khử hoá artemisinin thành
DHA bằng các chất khử khác nhau, thường dùng là natri borohydrid (NaBH4)
trong môi trường methanol, ở nhiệt độ thấp (0°c - 5°C).
NaBH.
MeOH
0-5®C
Artemisinin
Giai đoạn 2:
- Ester hoá DHA bằng acid succinic hoặc anhydrid succinic hoặc succinyl
clorid với sự có mặt của chất xúc tác (dimethylamino pyridin - DMAP, hay
hỗn hợp DMAP và dicyclohecxyl carbodiimid - DCC) được aitesunat.

COOH
L
ch ,
r
i
H2
OOH
DMAP
DCC
o - c — CHo—CHo-COOH
I
DHA Artesunat
Từ công thức cấu tạo và phưoỉng pháp điều chế trên có thể thấy tạp chất
chính có trong artesunat nguyên liệu là: DHA và acid succinic.
1.1.3. Tác dụng, chỉ định
-Tác dụng:
Artesunat có tác dụng diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh
trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do p. falciparum, không diệt thể
giao bào và không tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh.
Thuốc có tác dụng mạnh trên cả ký sinh trùng đã kháng Cloroquin,
Mefloquin, Fansidar [7].
- Chỉ định:
Phòng và điều trị sốt rét do p. falciparum, p. vivax, p. malariae kể cả sốt
rét do p. falciparum đã kháng thuốc khác [7], [9].
1.2. TỔNG QUAN VỂ TẠP ACID SUCCINIC TRONG ARTESUNAT
NGUYÊN LIỆU
1.2.1. Một số tính chất hoá lý của acid succinic
- Công thức:
- Tên khoa học: acid butanedioic.
-Tên khác: acid butanedionic, acid amber, asuccin.

- Tính chất: Bột kết tinh trắng.
Độ tan: 1 g acid succinic hoà tan được trong 13 ml nước lạnh; 1
ml nước sôi; 18,5 ml cồn; 6,3 ml methanol; 36 ml aceton; 20ml glycerol; 113
ml ether. Không tan trong benzen, carbon disulffit, dầu ether.
Điểm chảy; 185 - 187°c.
Có: pKai = 4,16; pKa2 = 5,61.
Dung dịch acid succinic 0,1 M CÓ pH = 2,7 [18].
1.2.2. Nguyên nhân gây ra tạp acid succinic trong artesunat
Acid succinic là một trong hai thành phần dùng tổng hợp nên artesunat,
mặt khác artesunat là ester của acid succinic và DHA nên nguyên nhân chính
gây ra tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu là:
- Tinh chế chưa tốt trong quá trình sản xuất.
- Do sự phân huỷ của artesunat trong quá trình bảo quản.
1.2.3. Một sô phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc
a. Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối với tạp vô cơ):
Trong phương pháp này người ta thường dùng phản ứng tạo mầu hay tạo
tủa (đục) với tạp chất rồi so sánh mầu (hay độ đục) của dung dịch thử với mầu
(hay độ đục) của dung dịch mẫu - dung dịch này chứa một lượng tạp chất đó ở
giới hạn cho phép.
Tiến hành: chọn 2 ống nghiệm không mầu, cùng đường kính. Cho vào ống
thứ nhất dung dịch thử - dung dịch này pha theo sự hướng dẫn trong từng
chuyên luận của dược điển và ống thứ hai 10 ml dung dịch mẫu. Cho vào mỗi
ống mọi thuốc thử, trừ thuốc thử chính tạo tủa (hay mầu) với tạp chất. Cuối
cùng cho thuốc thử chính vào cả 2 ống. So sánh mầu (hay độ đục) của 2 ống.
Mầu (hay độ đục) của ống thử không được đậm hơn mầu (hay độ đục) của
ống mẫu [1], [3].
Phương pháp này đơn giản, song chỉ cho kết quả bán định lượng.
b. Đo quang:
Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp rồi đo độ hấp thụ của
dung dịch mẫu so với độ hấp thụ của dung dịch có chứa tạp đó ở mức tiêu

chuẩn trong cùng điều kiện.
Phương pháp chỉ xác định mức giới hạn, việc áp dụng hạn chế do phải có
phản ứng đặc hiệu.
c. Sắc ký lớp mỏng:
Pha dung dịch thử của chế phẩm. Pha dung dịch so sánh, dung dịch này có
chuẩn tạp có nồng độ bằng mức giới hạn quy định tính theo dung dịch thử.
Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng một lượng thể tích bằng nhau của 2
dung dịch. Triển khai sắc ký, lấy ra sấy khô, hiện mầu và so sánh vết tạp của
dung dịch chuẩn và vết tạp tương ứng của dung dịch thử. Yêu cầu vết tạp của
dung dịch thử có diện tích và độ đậm không được lớn hơn vết tạp của dung
dịch chuẩn tạp.
Nếu không cổ chuẩn tạp thì người ta dùng chính dung dịch thử để pha
dung dịch so sánh; dung dịch này có nồng độ bằng mức giới hạn quy định của
tạp và cũng tiến hành tương tự như trên, rồi so sánh vết tạp của dung dịch thử
và vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch so sánh [2], [15], [19].
Nhận xét: Khi không có chuẩn tạp người ta đã coi đáp ứng của tạp và chất
thử là như nhau. Phương pháp này chỉ là phương pháp bán định lượng, dùng để
xác định giới hạn cho phép của tạp.
d. Sắc ký lỏng hiệu năng cao:
- Chuẩn hoá diện tích pic:
Pha dung dịch thử và tiến hành sắc ký, ghi diện tích của tất cả các pic trừ
pic dung môi và những pic có đáp ứng rất nhỏ. Phần trăm diện tích của mỗi
pic được tính là phần trăm khối lượng mỗi chất có trong mẫu thử.
Phưcmg pháp này cho kết quả khá chính xác nhưng đã xem đáp ứng của
các pic là như nhau khi nồng độ bằng nhau và tất cả các chất có trong mẫu thử
đều cho đáp ứng trên sắc ký đồ. Để xác định đúng hàm lượng phần trăm của
mỗi chất (tạp chất) trong mẫu thử, cần xác định liên quan tỉ lệ phần trăm diện
tích pic với phần trăm hàm lượng giữa các chất, thường xem hoạt chất có tỉ lệ
này bằng 1. Vì vậy cần xác định hệ số biến đổi phần trăm diện tích pic ra phần
trăm hàm lượng (hệ số F). Khi đó phần trăm tạp được tính như sau:

%Tạp
=
.100%
ỵs,.F,
/=1
- So sánh với chuẩn tạp (khi cần xác định giới hạn cho phép của tạp):
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượng
bằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic. Diện tích pic tạp của dung dịch
thử tương ứng pic chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp.
- So sánh với chuẩn thử:
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được
pha từ dung dịch thử, có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép
của tạp. Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử
không được lớn hofn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn [1], [2], [15\
Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số
đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xảy ra.
Các phương pháp này chỉ dùng để xác định giới hạn cho phép của tạp.
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.3.1. Nguyên tắc
Phưoỉng pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý, dùng để tách và
định lượng các thành phần trong hỗn hçfp dựa trên ái lực khác nhau giữa các
chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh (trong
cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn
8
hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc
phân bố vào pha tĩnh tuỳ thuộc bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi
ta bơm dung môi pha động qua bcfm với áp suất cao thì tuỳ thuộc vào ái lực
của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn
đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là

detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị
trên màn hình hoặc đưa ra máy in [6].
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với
một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra
khỏi cột. Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình
rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc
ký của hỗn hợp nhiều thành phần, chúng ta có một sắc ký đồ gồm nhiều pic.
Nếu quá trình tách sắc ký tốt, thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất sẽ có bấy
nhiêu pic riêng biệt trên sắc ký đồ [6], [11].
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
7 bộ phận chính sau đây:
a. Hệ thống bơm:
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 -
400 bar).
b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi:
Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi
chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 |Lim ) và
đuổi khí hoà tan.
c. Hệ tiêm mẫu:
Để đưa mẫu phân tích vào cột, Có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu
bằng hệ tiêm mẫu tự động.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao
đến vài trăm bar. Cột tách có nhiều cỡ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ sắc
ký. Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25 cm, đường
kính trong từ 2 - 5 mm.
e. Detector trong HPLC:

Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tuỳ theo bản chất của các chất cần
phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay được sử dụng nhất là
detector hấp thụ u v - VIS.
g. Hệ điều khiển: Computer.
/. Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder [1], [11].
1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng
• Thời gian lưu (Íịị): tjỊ là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
• Thể tích lưu (Vịị): Vr là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển
chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
= Ír X Fc
(Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian).
tjỊ và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan, vì vậy các đại
lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ dòng,
tính chất chất tan, nhiệt độ
• Thời gian chết (Íq): to là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi
pha tĩnh.
10
• Thời gian lưu thực ( t \ ): t \ = tR - íq.
• Hệ sô'phân bố K:
K = k.Cs/C,
Cs và là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số
phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất
tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.
K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh,
nhiệt độ.
• Thừa số dung lượng K \’
Là một đại lượng dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất.
k ' = =z ~ ^0 = Ỉ A . _ Ị

Íq Íq (q
k’ phụ thuộc vào bản chất của các pha, bản chất của chất tan, nhiệt độ và
đặc điểm của cột. Với một chất k’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Nếu
k’ lớn, pic bị doãng, độ nhạy kém. Nếu k’ nhỏ thì ír cũng nhỏ và sự tách kém.
Trong thực tế k’ nằm trong khoảng từ 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách
ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị k’ khác nhau.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao
cho: 1< k < 8.
Nếu k’ < 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp.
Nếu k > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài.
• Thừa số chọn lọc a (selectivity-factor):
“ = = (vớik’,> k ',)
a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 - 2.
11
• Độ phân giải (resolution):
Đặc trưng cho mức độ tách của 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:
^ ~ ^ ( ^ « 2 ~ ^«1 ) _ ^'2 ~ ^ ' l
^0.5, +^0,5
2 k\+k\+2
Rsphụ thuộc vào: hiệu lực cột, thừa số chọn lọc a, thừa số dung lượng k .
Trong thực tế: Rs tối ưu > 1,5.
Có thể tăng Rs bằng cách: tăng N (tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng),
tăng k’ (thay đổi thành phần pha động) hoặc tăng a (thay đổi pha tĩnh hoặc
thay đổi thành phần pha động).
• Số đĩa lý thuyết N:
Đặc trưng cho hiệu lực của cột:
t2
N = \6
[19]

hay
N =
5,54
0,5
[15].
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H
được tính bằng công thức: H =:
N
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị chiều
dài cột:
N =16
• Hệ số bất đối AF:
Lw„
ĨV
AF =
l a
Trong đó: Wji
2 0
là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
12
AF càng gần 1 thì peak càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả
tính diện tích peak càng chính xác.
Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9<AF<2 [2], [15], [19^.
1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
a. Lựa chọn cột (pha tĩnh):
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự
tách của một hỗn hợp nhiều chất. Bản chất chính của sự tách sắc ký hấp phụ là
dựa trên tính chất hấp phụ bề mặt của pha tĩnh. Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ.

Sắc ký hấp phụ gồm có 2 loại:
• Sắc ký hấp phụ pha thuận (normal phase-HPLC): pha tĩnh phân cực, pha
động không phân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực.
• Sắc ký hấp phụ pha đảo (reverse phase-HPLC): pha tĩnh ít phân cực, pha
động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân
cực. Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước rồi tới các chất ít và
không phân cực ra sau.
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:
• Phải trơ và bền vững trong môi trường sắc ký.
• Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
• Tính chất bề mặt ổn định.
• Cân bằng động học của sự tách diễn ra nhanh và lặp lại tốt.
• Cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica (SÌO2), nền oxyd nhôm
(AI2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên nền mạch carbon. Trong
sắc ký hấp phụ, pha tĩnh trên nền Silica có nhiều ưu việt và được sử dụng
nhiều nhất. Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:
13
ộ CH 3
Si

o — S i

R
ộ CH
3
• R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin
-CH2-NH2, alkylnitril -CH2-CN. Loại này sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký
hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.
• R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl; được điều

chế bằng cách alkyl hoá các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các
gốc alkyl -R của mạch carbon (C2, Cg, Cjg) hay các gốc carbon vòng (phenyl).
Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở
nên ít phân cực. Silica đã alkyl hoá được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha
đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion [6], [17\
b. Lựa chọn pha động cho HPLC:
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu
tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp. Pha động có thể là
nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ nhất định.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc
ký như: độ chọn lọc a, thời gian lưu Ir, hiệu lực tách của cột, độ phân giải
Rs, độ rộng của pic sắc ký .Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là
rất quan trọng.
Yêu cầu của một pha động:
• Phải trơ với pha tĩnh.
• Hoà tan được chất cần phân tích.
• Bền vững theo thời gian,
• Có độ tinh khiết cao.
• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
14
• Phù hợp với detector.
• Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân
cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform, .Các pha động này
thưòfng được bão hoà nước.
Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực
như; nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi này
có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ [6], [17].
Có 4 yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưcfng tới kết quả tách của một
hỗn hợp mẫu:

• Bản chất của dung môi để pha pha động.
• Thành phần của các chất trong pha động.
• pH của pha động.
• Tốc độ dòng của pha động.
c. Chọn đệm pH:
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan
có tính acid hay base thường phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho
quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc
ký. Thông thường chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid nhưng
cũng có trưòíng hợp đặc biệt, còn trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tuỳ từng
trường hợp [17].
d. Tốc độ dòng:
Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp thì một yếu tố cần lựa chọn để
quá trình tách tốt hơn là tốc độ dòng [17].
1.3.6. ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính:
15
a. Định tính và thử độ tinh khiết: thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải
tưoỉng ứng với thời gian luu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ [6].
b. Sắc ký điều chế: qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải
được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất [6].
c. Định lượng:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong
hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc; nồng
độ của chất tỷ lệ vói chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:
• Phưcmg pháp chuẩn ngoại (extemal Standard method): Đây là phương
pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến
hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều

cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ.
• Phương pháp chuẩn nội (intemal Standard method): Là phương pháp cho
thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp
ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc
ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội.
• Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic (area normalisation):
Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều
thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng
diện tích của tất cả các pic thành phần.
Yêu cầu: Tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện.
Tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector.
Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:
^,.100 _ ^,.100
+^y +5'r +•••
/=1
16
Tuy vậy trong sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp
ứng pic như nhau là rất khó. Khắc phục nhược điểm này, trong sắc ký lỏng
người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp
ứng ta chọn 1 thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1. Các thành phần
khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau: F = ^ .
s X - C c
Sg và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chuẩn gốc và thành phần
cần tính hệ số đáp ứng.
Q và Q là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ
số đáp ứng.
Fc là hệ số hiệu chỉnh của chuẩn, khi đó hàm lượng của thành phần X tính
theo công thức:
‘^.•^.•100 5 F 10 0
X X

t
/ = 1
Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng tạp chất trong thuốc [1],
[6]. Phương pháp này chúng tôi chọn áp dụng để xác định tạp acid succinic.
• Cách xác định hệ số đáp ứng:
- Cách 1: Dựa vào phương trình tuyến tính ở nồng độ khảo sát của mỗi
chất và tính ra hệ số đáp ứng theo biến đổi toán học. Nếu chất A có phương
trình tuyến tính là = kiX^ + bi, B có phương trình tuyến tính y = kjXg + bj thì
khi Ya= Yb => Fg= x^/Xb= kj/kjH- (bj- bi)/kjXB với Xg nằm trong khoảng khảo
sát ta tính được giá trị gần đúng của F.
- Cách 2: Xác định giá trị của độ hấp thụ riêng của từng chất và tính hệ số
đáp ứng dựa vào độ hấp thụ riêng. Ví dụ: có 2 chất A và B, A được chọn làm
chất chuẩn có hệ số đáp ứng là 1, khi đó hệ số đáp ứng của B sẽ là:
F = E\^/E*,b.
- Cách 3: Tính hệ số đáp ứng dựa vào kết quả đo tại từng điểm rồi tính hệ
số hiệu chỉnh trung bình của các điểm. Ví dụ có 2 chất A và
/>.
17 ! ■
chất làm chuẩn ta phải tính hệ số hiệu chỉnh cho B. Kết quả xác định ờ nồng
độ 100% của A là S^, kết quả xác định của B ở 5 mức nồng độ trong khoảng
khảo sát tuyến tính là 813, 823, 833, 843,850 ta lần lượt sẽ có Fib=Sa/Sib,
F2B“ p3B~ ^a/^3B’ F4B“ P5B“ ^a/^5b Fjt,=(FjB+ Fib"!" Fsb"!" P3B
+ FjbVS (Fjb là hệ số đáp ứng trung bình) [1], [19\
d. Xác định giới hạn định lượng bằng HPLC:
- Cách 1 : Pha một số dung dịch có nồng độ thấp dần rồi tiến hành sắc ký
định lượng. Giới hạn định lượng sẽ là kết quả thấp nhất mà ở đó kết quả định
lượng đảm bảo tính đúng và tính chính xác [20].
- Cách 2: Phương pháp phương trình hồi quy ở nồng độ gần nồng độ giới
hạn heo dự tính. Pha 5 mức dung dịch ở 5 nồng độ liền kề với nồng độ giới
hạn định lượng ước tính, tiến hành sắc ký ghi kết quả, thành lập phương trình

tuyến tính từ các kết quả trên dạng y = ax + b (y là đáp ứng pic, X là nồng độ
dung dịch).
ở nồng độ thấp nhất tiến hành sắc ký 5 lần, ghi kết quả và tính độ lệch
chuẩn của các kết quả (S), giới hạn tín hiệu phát hiện sẽ là: y = 3S + b. Từ
phương trình hồi quy và phương trình tính giới hạn tín hiệu phát hiện tính ra
nồng độ giới hạn phát hiện là: = 3S/a và nồng độ giới hạn định lượng:
x,^= lOxiod/3 [16].
- Cách 3: Tiến hành sắc ký, ghi sắc ký đồ. Xác định độ nhiễu đường nền ở
vùng thời gian luìi của chất nghiên cứu từ sắc ký đồ của mẫu trắng. Giới hạn
tín hiệu định lượng bằng 10 lần độ nhiễu đường nền. Từ đó suy ra giới hạn
định lượng bằng cách so sánh giới hạn tín hiệu định lượng với đáp ứng của
dung dịch có nồng độ rất thấp [20].
18
PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ, HOÁ CHÂT, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng
- Artesunat nguyên liệu do trường ĐH Dược Hà Nội sản xuất.
- Acid succinic chuẩn do Trung Quốc sản xuất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
a. Thiết bị, dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Dionex với detector mảng diod PDA-
100.
- Máy pH meter 3305-Jenway.
- Máy lắc siêu âm SONOREX.
- Máy lọc chân không Satorius, màng lọc 0,45 ¡dX.
- Bơm tiêm, lọ đựng mẫu.
- Cân phân tích điện tử hiện số Mettler AB204; độ chính xác 0,1 mg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết dùng cho phân tích: bình định mức các
loại, ống đong, pipet các loại

- Tủ sấy.
b. Hóa chất:
- Artesunat nguyên liệu do trường Đại học Dược Hà Nội sản xuất.
- Artesunat đối chiếu (hàm lượng 98,6%) của Viện kiểm nghiệm.
- Acid succinic chuẩn do Trung Quốc sản xuất.
- DHA do bộ môn công nghiệp sản xuất đã tinh chế lại.
- Acetonitril dùng cho HPLC.
- Methanol dùng cho HPLC.
19
- Acid phosphoric PA.
- Kali dihydrophosphat PA.
- Kali hydroxyd PA.
- Các hóa chất thông thường dùng trong phòng thí nghiệm.
2.1.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
a. Dựa vào phương pháp định lượng artesunat bằng HPLC, xác định hàm
lượng tạp tạp acid succinỉc trong artesunat nguyên liệu.
b. Đánh giá phương pháp định lượng acid succinic dưới dạng tạp chất theo
các chỉ tiêu của phương pháp định lượng.
• Đánh giá tính thích hợp của hệ thống.
• Đánh giá tính tuyến tính.
• Đánh giá tính đúng.
• Đánh giá độ lặp lại,
• Đánh giá tính đặc hiệu.
• Xác định giới hạn định lượng.
c. Xác định hệ sô' biến đổi tính hàm lượng acid succinic trong artesunat
nguyên liệu khỉ không có acid succỉnic chuẩn.
2.1.4. Một số công thức sử dụng tính toần thống kê
- Giá trị trung bình:
- Độ lệch chuẩn:
1 V

= —2 .
n 7ti
s =
11
/ = 1
\ 2
n - 1
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): s . = 4- X 100
X
- Sai số chuẩn:
- Sai số tương đối:
-sjn
S-
ta(n-X)
X 100
20