Nghiên cứu chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana (bert ) hemsl ), họ cúc (asteraceae)

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
_
______
*****
_______
_
LÊ THỊ THỌ
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT số
GLYCOSID TỪ CÂY cỏ NGỌT
(STEVIA REBAUDIANA (BERT.)
HEMSL.), HỌ CÚC (ASTERACEAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Tài
2. TS. Nguyễn Thu Hằng
Nơi thực hiện:
1. Khoa Hóa thực vật -Viện Dược Liệu
2. Bộ môn Dược Liệu
ỊĩR Ư Ờ N a ĐH
Noàv V ’
HÀ NỘI-2011
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của
các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới:
TS. Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược
liệu.
TS. Nguyễn Thu Hằng - Phó trưởng Bộ môn Dược liệu , Trường ĐH
Dược Hà Nội.

Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình làm khóa luận.
Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong Khoa Hóa thực
vật, Viện Dược liệu đã luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo
trong trưcmg, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong
học tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của tôi không thể
tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được sự góp ý quý báu của các
thầy cô và các bạn sinh viên.
Hà Nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên
Lê Thị Thọ
MỤC LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN Đ Ề 1
Chương 1. TÔNG QUAN 3
1.1 VỀ THỰC VẬT 3
1.1.1 VỊ trí phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm thực vật 3
1.1.3 Phân bố 4
1.1.4 Sinh thái 4
1.2 VỀ HÓA HỌC 4
1.3 ỨNG DỤNG CỦA CẦY c ỏ NGỌT
8
1.3.1 Công dụng 8
1.3.2 Tác dụng sinh học 8

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY c ỏ
NGỌT 14
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

17
2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 17
2.1.1 Nguyên liệu
17
2.1.2 Thiết bị, hóa chất 17
2.2 NỘI DƯNG NGHIÊN CÚXJ 18
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
Chương 3. THựC NGHIỆM , KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 20
3.1.1. Dự kiến các giai đoạn chính trong quy trình chiết xuất glycosid
từ cỏ ngọt 20
3.1.2 Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt
bằng n-butanol bão hòa nước

20
3.1.3. Khảo sát khả năng tách glycosid của một số cột nhựa hấp phụ23
3.1.4. Khảo sát hệ dung môi rửa giải cột Diaion HP-20

25
3.1.5. Khảo sát nhiệt độ của quá trình chiết suất 26
3.1.6. Khảo sát thời gian chiết suất 27
3.1.7. Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi của quá trình chiết suất

28
3.1.8. Khảo sát số lần chiết suất 30
3.1.9. Đánh giá khối lượng và độ tinh khiết của CNl trong quá trình

tinh chế
31
3.1.10. Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột
nhựa hấp phụ Diaion HP-20 33
3.1.11. Xác định cấu trúc của chất phân lập (Chất CN1) 36
3.1.12. Định lượng steviosid chiết được từ cỏ ngọt bằng phương pháp
HPLC 40
3.2 BÀN LUẬN 41
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGÍỈỊ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADI - Acceptable Daily Intake
CN1 - Chất chiết từ cỏ ngọt
EFSA - European Food Safety Authority
GFR - Glomerular filtration rate
Glc - Glucose
NOAEL - No Observed Adverse Effect Level
Rha - Rhamnose
RPF - Renal plasma flow
SPiR - Spontaneously hypertensive rats
SKLM - Sắc ký lớp mỏng
SPT - Skin Prick Test
STT - Số thứ tự
Xyl - Xylose
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Cấu trúc của các Steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 6
Bảng 2. Hiệu suất chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-butanol
bão hòa nước 23
Bảng 3. Khảo sát hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt của một số cột nhựa hấp

phụ 26
Bảng 4 : Sự ảnh hưởng của dung môi rửa giải cột đến hiệu suất chiết glycosid
từ cỏ ngọt 27
Bảng 5. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào nhiệt độ
28
Bảng 6. Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian chiết
dược liệu 29
Bảng 7. Sự phụ thuộc tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) trong quá trình chiết
dược liệu đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt 31
Bảng 8. Sự ảnh hưởng của số lần chiết xuất đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ
ngọt 32
Bảng 9. Khối lượng CNl thu được sau mỗi lần kết tinh lại

33
Bảng 10: Dữ liệu phổ IH-NMR và 13C-NMR của chất C N l 39
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid

5
Hình 2. Cấu trúc hóa học của Steviosid

7
Hình 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của Bùi Thị
Song Sơn 16
Hình 4. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của
Giovanetto 18
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt

24
Hình 6. Ảnh chụp sắc ký đồ của CNl trong hệ dung môi CHClsiMeOHiHiO

(15:8:1), hiện vết bằng dung dịch H 2SO 4 10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100°c
34
Hình 7. Qui trình chiết glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột nhựa Diaion HP-20

37
Hình 8. Cấu trúc hóa học của CNl: Steviosid 41
ĐẶT VẤN ĐÈ
Hiện nay, số người bị mắc các bệnh béo phì, tiểu đường, tim mạch,
đang ngày càng gia tăng trên toàn thế giới. Nguyên nhân là do thói quen ăn
nhiều đường và các thực phẩm có nhiều năng lượng nhưng lại ít vận động. Vì
thế, các nhà sản xuất thực phẩm và đồ uống luôn trong cuộc chạy đua tìm
kiếm các chất làm ngọt mà ít có tính dinh dưỡng. Việc sử dụng các sản phẩm
hóa học tạo vị ngọt có thể được dùng để thay thế đưòng (saccharin, sodium
cyclamat, sucralose và phổ biến nhất là aspartam) mặc dù rẻ và tiện lợi nhưng
người ta vẫn e ngại ảnh hưởng về lâu dài của chúng đối với sức khoẻ. Hiện
nay, saccharin đã bị cấm sử dụng tại một số quốc gia, vì bằng thực nghiệm đã
chứng minh chất này gây ung thư bàng quang ở chuột. Aspartam không nên
dùng cho những người bị bệnh Phenylketonuria. Chính vì thế, cây cỏ ngọt và
các chất chiết xuất từ cỏ ngọt đang ngày càng được nhiều người chú ý đến
như là chất điều vị tuyệt vời, có thể thay thế đường, không chứa calo, thích
hợp dùng cho cả người bị bệnh tiểu đường và béo phì.
Từ lâu, nhiều quốc gia trên thế giới đã sử dụng cỏ ngọt và các chất
chiết từ cỏ ngọt. Trung Quốc xem cỏ ngọt như một dược liệu thiên nhiên rất
tốt để giúp làm giảm cân, ăn ngon và tiêu hóa tốt. Nhật Bản là quốc gia sử
dụng cây cỏ ngọt nhiều nhất trên thế giới. Mỗi năm kỹ nghệ Nhật tiêu thụ từ
700 tấn đến 1000 tấn lá cỏ ngọt. Một khối lượng lớn cỏ ngọt cần phải được
nhập thêm từ Hàn Quốc, Đài Loan và Trung Quốc. Việc sử dụng cỏ ngọt trên
thế giới đã gây nhiều tranh cãi trong thời gian qua vì một số nghiên cứu trước
đây cho rằng việc sử dụng steviosid - hoạt chất chính chiết từ cỏ ngọt có thể
ảnh hưởng đến khả năng sinh sản trên chuột thí nghiệm. Mới đây nhất, ủy

ban châu Âu về an toàn thực phẩm đã đưa ra két luận về sự an toàn của các
glycosid chiết từ cỏ ngọt dựa trên rất nhiều dữ liệu và thí nghiệm đã được
công nhận [15].
ở Việt Nam, mặc dù được nhập về trồng từ trước năm 1990 ở quy mô
sản xuất nhưng việc sử dụng cây cỏ ngọt mới chỉ dừng lại ở những dạng dùng
đơn giản và chủ yếu dùng cho xuất khẩu. Đây là một loại cây có giá trị kinh tế
cao và hiện việc trồng cỏ ngọt đã được mở rộng ra nhiều vùng trên cả nước.
Việc trồng cỏ ngọt ở Việt Nam có nhiều thuận lợi vì vốn đầu tư ban đầu
không lớn, việc chăm sóc không quá khó khăn và cho năng suất cao. Do đó,
việc nghiên cứu chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt để thay thế đường đang được
các nhà khoa học quan tâm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu
chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt
{Stevia rehaudỉana (Bert.) Hemsl.),
họ Cúc (Asteraceae)” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt
2. Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. VÈ THựC VẬT
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo các tài liệu về phân loại thực vật [2], cây cỏ ngọt có vị trí phân
loại như sau:
Giới Thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta )
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Cúc (Asteridae)
Bộ Cúc (Asterales)
Họ Cúc (Asteraceae)
Chi Stevia Cav.
1.1.2. Đăc điểm thưc vât
• • •

Tên khoa học; Stevia rebaudiana (Bert.) Hemsl.
Tên Việt Nam: cỏ ngọt, cỏ mật, cúc ngọt.
Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6m, có khi đến Im. Thân
cứng mọc thẳng, có tiết diện tròn, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân
nhánh. Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn,
dài 5-7 cm, rộng 1-1,5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía
đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm; cuống lá
rất ngắn. Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn thân. Quả bế,
không có mào lông, hạt không có nội nhũ [1], [12'
Mùa hoa: tháng 5-9.
1.1.3. Phân bố
Chi Stevia Cav. gồm khoảng 240 loài chủ yếu là thân thảo, cây bụi có
nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và một vài tiểu bang miền
nam Hoa Kỳ, không có một đại diện nào ở vùng châu Á. Tới đầu thập niên
70, Nhật Bản bắt đầu trồng và sử dụng cỏ ngọt. Ngày nay thì cỏ ngọt được sử
dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á khác như: Trung Quốc, Hàn Quốc,
Philippin, Indonesia, Đài Loan, Thái Lan, Malaysia cỏ ngọt cũng được sử
dụng nhiều ở các nước Nam Mỹ: ưrugoay, Peru, Hiện nay, cỏ ngọt đang
được trồng phổ biến ở nhiều vùng của Việt Nam: Cao Bằng, Lâm Đồng, Hà
Giang, Hà Tây, Thái Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên, [12].
1.1.4. Sinh thái
Cỏ ngọt là cây ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào
thời kỳ cây con. vốn là cây ở vùng nhiệt đới, cỏ ngọt trồng ở Việt Nam sinh
trưởng, phát triển tốt vào vụ xuân-hè. v ề mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá
và hơi bị tàn lụi. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm. Tuy nhiên, người ta vẫn
thường áp dụng cách nhân giống bằng cắm cành [1],[12].
1.2. VÈ HÓA HỌC
Lá cỏ ngọt chứa;
- Các ent - kauren diteqDen glycosid: steviosid (2,2-18,5%), rebaudiosid A, B,
c, D, E, F, dulcosid, steviobiosid. Các thành phần này có vị ngọt ở các mức

độ khác nhau. Nguyễn Kim cẩn và cộng sự đã chiết được stevioside trong lá
cỏ ngọt trồng ở Việt Nam với hàm lượng từ 1,66-4,78% tùy theo khu vực lấy
mẫu [5],[12’.
- Các labdan diterpen gồm jhanol, austroinulin, 6-0-acetylaustroinulin [12’.
- Các triterpen gồm |3-amyrin acetat, lupeol [12’.
- Các thành phần khác gồm ß-sitosterol, stigmasterol, tanin và tinh dầu [12].
Nhóm hợp chất đáng chú ý trong cây cỏ ngọt là các steviol glycosid.
Các glycosid này chiếm 10-20% khối lượng lá cỏ ngọt khô và có bộ khung
cấu trúc được trình bày ở hình 1.
Hình 1. Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid
CHn
Steviol Ri = R2 = H
Cho đến nay đã có 9 steviol glycosid được phân lập từ lá cỏ ngọt được
tổng kết ở bảng 1 [1],[12],[20].
Bảng 1. Cấu trúc của các steviol giycosid chiết xuất từ cỏ ngọt
STT Tên chất
Ri
Ri
TLTK
1
Steviosid -ß-glc
-ß-glc-ß-glc (2-^ 1)
[1],[3],[4],[5
],[6Ì[7],
2
Steviolbiosid -H
-ß-glc-ß-glc (2-^ 1)
[1],[12],[20]
3 Rebaudiosid A -ß-glc
-ß-glc-ß-glc (2->l)

1
-Ì3-glc(3^1)
[1],[12],[14],
[18],[20],
4
Rebaudiosid B -H
-ß-glc-ß-glc (2-^ 1)
1
-|3-glc(3-^l)
[1],[12],[20]
5 Rebaudiosid c
(Dulcosid)
-ß-glc
-ß-glc-a-rha (2—>1)
1
-ß-glc(3-^l)
[1],[12],[20],
[32]
6 Rebaudiosid D -ß-glc-ß-glc (
2-^1)
-ß-glc-ß-glc (2-^1)
1
-|3-glc(3^1)
[1],[12],[20]
7
Rebaudiosid E ß-glc-ß-glc (2^ 1)
ß-glc-ß-glc (2^ 1)
[1],[12],[20]
8 Rebaudiosid F
-ß-glc

-ß-glc-ß-xyl (2^ 1)
1
-ß-glc(3-^l)
[20]
9 Dulcosid A
-ß-glc -ß-glc-a-rha (2-^ 1) [1],[12],[20],
[3^
Từ bảng 1 cho thấy bốn glycosid được đề cập đến nhiều nhất trong các
tài liệu tham khảo là dulcosid A (0,3%); rebaudiosid c (0,6%); rebaudiosid A
(3,8% ) và steviosid (9,1%). Trong số này, chỉ có steviosid và rebaudiosid A
đã được xác định rõ các đặc tính vật lý và cảm quan. Steviosid và rebaudiosid
A đã được thử nghiệm độ ổn định trong các đồ uống có ga và cả hai chất được
xác định là bền với nhiệt và pH [3 r .
Các steviol glycosid ngọt hơn nhiều so với saccharose, trong đó:
steviosid ngọt hơn 110 đến 270 lần, rebaudiosid A ngọt hoTi 150 đến 320 lần,
rebaudiosid c ngọt hon 40 đến 60 lần, dulcoside A ngọt hơn 30 lần. [32]
Rebaudiosid A là chất có dư vị ít đắng nhất trong số bốn chất. Dubois
và Stephanson đã xác nhận rebaudiosid A ít đắng hơn steviosid và giải thích
nguyên nhân có dư vị đắng của steviosid và rebaudiosid A là do những đặc
tính vốn có của hai hợp chất này chứ không phải do tạp chất trong quá trình
chiết xuất. Dư vị đắng có xu hướng tăng cùng với sự tăng nồng độ của cả
Steviosid và Rebaudiosid A [32].
Steviosid (13-[(2-0-P-D-glucopyranosyl-a-D-glucopyranosyl) oxy]kaur-16-
en-18-oic acid |3-D- glucopyranosyl ester) là hoạt chất chính chiết từ lá cây cỏ
ngọt có cấu trúc hóa học được trình bày ở hình 2.
Hình 2. Cấu trúc hóa học của steviosid
OH
Q
HO'
HO

OH
OH
OH
OH
CHo
KLPT: 804,87
Là những tinh thể dễ chảy nước, có điểm chảy 198°c
1 g steviosid tan trong 800ml nước
Tan trong dioxan, hơi tan trong alcol [2],[12].
Hàm lượng steviosid trong cỏ ngọt là 3-20% tùy theo giống và các
điều kiện trồng trọt, thu hoạch [12].
1.3. ỨNG DỤNG CỦA CÂY cỏ NGỌT
1.3.1. Công dụng
Lá cỏ ngọt hoặc steviosid thường dùng làm chất điều vị cho các loại
trà thuốc, trà túi lọc [12].
Cao cỏ ngọt hoặc steviosid đã được sử dụng rộng rãi làm chất ngọt
trong bánh kẹo, nước giải khát; ở Nhật mỗi năm tiêu thụ đến 700 tấn cỏ ngọt
và chưa thấy có phản ứng độc hại nào [2’.
Người bị bệnh tiểu đường và người béo phì có thể dùng chế phẩm của
cỏ ngọt để thay thế đường [2].
1.3.2. Tác dụng sinh học
1.3.2.1. Tác dung ha đường huyết và tàng tiết insulin
Nghiên cứu in vitro
Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng các steviol glycosid có khả năng
kích thích các tế bào tiểu đảo tụy cô lập tiết Insulin, làm tăng số lượng các
gen chủ chốt kiểm soát sự tiết insulin và có tác động đến sự giải phóng và
truyền tín hiệu insulin [15].
♦♦♦ Nghiên cứu in vivo
Trên chuột nhắt trắng bình thường lúc đói và chuột nhắt trắng bị tăng
glucose huyết do alloxan, steviosid đã chứng tỏ có tác dụng làm hạ glucose

huyết [10].
1.3.2.2. Tác dung giãn mach và ha huyết áp
<♦ Nghiên cứu in vitro
Các nghiên cứu in vitro cho thấy steviosid ức chế sự co mạch gây ra bởi
vasopressin với sự có mặt của calcium [15].
♦♦♦ Nghiên cứu in vivo
-Nghiên cứu trên chuột đực trưởng thành với liều 25mg steviosid/kg thể
trọng/ngày (tương đương khoảng lOmg steviol/kg thể trọng/ngày) so với lô
chứng sử dụng 16,7 mg glucose/kg thể trọng/ngày thông qua nước uống trong
6
tuần cho thấy tác dụng hạ huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trưong có ý
nghĩa của steviosid so với nhóm chứng và không có dấu hiệu tăng đáng kể về
trọng lượng cơ thể [15'.
-Các nghiên cứu khác trên chuột cao huyết áp tự phát (SHR) và chó lai
khỏe mạnh cũng cho thấy tác dụng ngăn chặn sự phát triển của bệnh cao
huyết áp trên những con chuột còn nhỏ hay tác dụng hạ huyết áp trên chó của
steviosid [15].
-Một vài nghiên cứu khác sử dụng đường tiêm tĩnh mạch và tiêm màng
bụng cũng cho thấy khả năng hạ huyết áp của steviosid ở liều từ 25 đến 400
mg/kg thể trọng/ngày (tương đương với liều 10 đến 158 mg steviol/ kg thể
trọng/ngày) [15].
♦♦♦ Các thử nghiệm lâm sàng
10
- Sau 3 tháng sử dụng steviosid (3 lần/ngày với liều 250mg) trên những
người bị cao huyết áp từ nhẹ đến trung bình thấy cả huyết áp tâm thu và huyết
áp tâm trương đều giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng [15].
- Ket quả tương tự cũng thu được khi sử dụng steviosid trong vòng 2 năm
(với liều 500mg, 3 lần/ngày) [15‘.
1.3.2.3. Tác dung trên chức năng thân
♦♦♦ Nghiên cứu ỉn vitro

Một số nghiên cứu in vitro đã cho thấy cả steviol và steviosid đều có ảnh
hưởng tới sự vận chuyển các anion ở ống thận [15].
♦♦♦ Nghiên cứu in vivo
- ở chuột cống trắng bình ứiưòng, steviosid làm tăng cả lưu lượng huyết
tưong qua thận (RPF) và tốc độ lọc cầu thận (GFR). Tác dụng tăng GFR là do
thuốc làm giãn mạch vào và ra tiểu cầu thận [11].
-Tiêm tĩnh mạch steviosid cho chuột cống trắng cao huyết áp cũng làm
tăng cả RPF và GFR. Kết quả này cũng xảy ra ở chuột cống trắng bị cao
huyết áp do gây mô hình thực nghiệm tổn thương thận [11].
-Trên chuột cống trắng bình thường và cả chuột gây cao huyết áp thực
nghiệm, steviosid đều có tác dụng làm hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải
trừnatri [11].
1.3.2.4. Liều dùng an toàn ở người
ủy ban châu Âu về an toàn thực phẩm (EFSA) đã đưa ra liều dùng
được chấp nhận hàng ngày (ADI) đối với các steviol glycosid, được thể hiện
qua lượng steviol tương ứng là 5S8mg/kg thể trọng/ngày, tương đương với
Pố7mg steviosid/kg thể trọng/ngày [15'.
11
1.3.2.5. Đôc tính cấp
Các nghiên cứu về độc tính cấp đường uống với steviosid (độ tinh khiết
96%) cho thấy LD50 > 15gfk% thể trọng ở chuột bạch, chuột cống và chuột
hamster [15].
1.3.2.6. Đôc tính bán cấp
-Hỗn họp steviol glycosid (chứa 97% Rebaudiosid A) đã được thử
nghiệm độc tính trên chuột Wistar ở các nồng độ 0, 12500, 25000 và 50000
mg/kg thức ăn trong 90 ngày. Trong quá trình nghiên cứu không quan sát
thấy chuột chết và các dấu hiệu lâm sàng của độc tính; không có sự thay đổi
các chỉ số huyết học và hóa sinh cũng như các bệnh lý liên quan ngoại trừ các
ảnh hưởng tới trọng lượng cơ thể, lượng thức ăn đưa vào và hiệu quả chuyển
đổi thức ăn [15'.

-Các nghiên cứu sử dụng steviosid (độ tinh khiết 95,6%) trong chế độ
ăn của chuột Fischer trong 90 ngày cũng đã đưa ra kết luận: 5% steviosid
trong chế độ ăn tương đương 2500mg/kg thể trọng/ngày (tương ứng xấp xỉ
942mg steviol/kg thể trọng/ngày) là mức không quan sát thấy tác hại [15’.
ĩ .3.2.7. Khả năng gây đôt biến.
Các nghiên cứu cả in vivo và in vitro về khả năng gây đột biến của các
steviol glycosid, của steviol và các chất chuyển hóa của steviol đã đưa ra kết
luận:
Stevỉosỉd và rebaudiosid A không cho thấy các bằng chứng về khả năng
gây đột biến ở cả in vitro và in vivo. Stevioỉ và một vài dẫn chất oxi hóa của
nó cho thấy bằng chứng rô ràng về độc tính với vật liệu di truyền ở in vitro,
đặc biệt khi có mặt hệ thống hoạt hóa sự chuyển hóa. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về sự nguy hại với ADN và nhân tế bào ở chuột cống, chuột bạch và
12
chuột đồng in vivo cho thấy khả năng gây đột biến của steviol không thể hiện
ở liều lên tới 8000 mg/kg thể trọng [15],
1.3.2.8. Đôc tính man và khả năng gây ung thư
Các kết quả nghiên cứu về khả năng gây ung thư của các steviol
glycosid vào năm 1985, 1992, 1997 đều cho thấy các steviol glycosid không
gây ung thư ở các mô hình thử nghiệm [15'.
1.3.2.9. Ảnh hưởng đối với sư phát triển vả sinh sản
Nghiên cứu được thực hiện trên chuột Wistar bao gồm cả chuột đực và
cái ở thế hệ Fo, Fi, p2 và những con chuột đang mang thai cho thấy không có
tác dụng phụ nào đối với sự phát triển của cơ thể và cơ quan sinh sản cũng
như chức năng sinh sản hay bất kỳ ảnh hưởng nào đến bào thai ở chế độ ăn có
nồng độ steviosid lên tới 2100mg/kg thể trọng/ngày (tương đương 840 mg
steviol/kg thể trọng/ngày) [15'.
1.3.2.10. Khả năng gây di ứng của Steviol glycosid
-Đã có hai trưòng họp được báo cáo bị dị ứng có liên quan đến cỏ ngọt:
trường hơp thứ nhất là một bé gái 7 tháng tuổi sau khi nhai lá cỏ ngọt và

trường hợp thứ hai là một bé trai 2 tuổi sau khi uống nước ấm có pha bột
steviosid. Phản ứng với lá cỏ ngọt hoặc steviosid được xác nhận bằng test da
(SPT) trong cả hai trường hợp. Cả hai bệnh nhân này đều bị bệnh chàm dị ứng
khó kiểm soát. Sau khi kiêng các đồ ăn có steviosid, dấu hiệu chàm dị ứng cải
thiện đáng kể và không có phản ứng dị ứng ác tính ở cả hai trường hợp. Sau
hai tháng kiêng những đồ ăn có steviosid và cỏ ngọt, test da với lá cỏ ngọt và
steviosid được thử lại ở 2 trường họp trên đều cho kết quả âm tính [15’.
-Theo những quan sát lâm sàng ở trên, một nghiên cứu về khả năng gây
dị ứng của lá cỏ ngọt và steviosid 10% được thực hiện bằng SPT trên 200 em
13
bé cả trai và gái ở độ tuổi từ 4 tháng đến 2 năm trước và sau khoảng thời gian
2 tháng không sử dụng các loại thực phẩm có steviosid. số trẻ em chia thành
4 nhóm: 50 trẻ khỏe mạnh không có tiền sử dị ứng, 50 trẻ bị viêm mũi dị ứng,
50 trẻ bị hen phế quản và 50 trẻ bị chàm dị ứng. Không em nào trong số trẻ
em khỏe mạnh có kết quả test da dưong tính; 26% số trẻ em bị viêm mũi dị
ứng, 34% số trẻ em bị hen phế quản và 64% số trẻ em bị chàm dị ứng có phản
ứng với lá cỏ ngọt và steviosid. Khoảng thời gian 2 tháng không sử dụng các
thực phẩm có steviosid làm giảm số các phản ứng với lá cỏ ngọt hoặc
steviosid ở những trẻ bị viêm mũi dị ứng (4/50 với lá cỏ ngọt và 3/50 với
steviosid 10%), ở trẻ bị hen phế quản (3/50 với lá cỏ ngọt và 4/50 với
steviosid 10%), ở trẻ bị chàm dị ứng (7/50 với lá cỏ ngọt và 5/50 với steviosid
10%). Sự thay đổi của các triệu chứng viêm mũi, hen và chàm sau 2 tháng
không sử dụng thực phẩm có steviosid đã không được ghi nhận trong báo cáo
[15].
- Xem xét số lượng lớn các kết quả dương tính với test da trong nhóm
trẻ em bị chàm, lá cỏ ngọt và steviosid có thể chứa một vài họp chất gây dị
ứng phổ biến trong thực vật (phản ứng chéo) của họ cúc, mặc dù không nhận
được báo cáo nào về tác dụng này. Các chuyên gia cũng lưu ý rằng sự giảm
độ nhạy cảm sau khi loại bỏ các thực phẩm có chứa steviosid là một quan sát
thú vị nhưng không cung cấp được một bằng chứng mạnh mẽ cho sự tiến triển

qua trung gian IgE.
Tóm lại, ủy ban châu Ấu về an toàn thực phẩm sau khi xem xét tất cả
các dữ liệu nghiên cứu về rebaudiosỉd A và steviosỉd đã đưa ra kết luận các
steviol glycosid đạt các yêu cầu kỹ thuật đề xuất thì không gây ung thư, không
gãy đột biển hoặc có bất kỳ tác dụng không mong muốn nào trên hệ phát triển
và sinh sản của cơ thể [15 .
14
1.4. MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY
C ỏ NGỌT
1.4.1. Phương pháp 1
Phương pháp này được thực hiện trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại
học của Bùi Thị Song Sơn năm 1996 tại trường Đại học Dược Hà Nội [11
theo phương pháp mô tả trong tài liệu của Hiroshi Kohda, Kyoli Kasai, Kazuo
Ymasaki, Kuniko, Murakami và Osanu Tanaka.
Quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt được tóm tắt ở sơ đồ hình 3.
1.4.2. Phương pháp 2: Phương pháp của Giovanetto 1988
Phương pháp này được coi là nền tảng cho rất nhiều nghiên cứu về sau
trong việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp màu trong dịch chiết nước cỏ
ngọt [27].
Quy trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ hình 4.
1.4.3. Phương pháp 3: Phương pháp của Payzant 1999
Quy trình chiết xuất của Payzant có giai đoạn đầu giống với phương
pháp của Giovanetto, tuy nhiên dịch nước thu được sau khi qua cột nhựa trao
đổi cation và anion được tiếp tục cho qua cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-7
và được rửa giải bằng dung dịch methanol. Dịch methanol này có chứa trên
95% steviol glycosid của dung dịch thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi
ion, sau đó được bay hơi dung môi và tách steviosid bằng phương pháp kết
tinh trong methanol [26].
15
Hình 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt

của Bùi Thị Song Sơn[4]
16
Hình 4. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của
Giovanetto [27]
17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là lá cỏ ngọt do Công ty cổ phần vật tư Y tế Khải Hà cung
cấp, được trồng tại huyện Vũ Thư, tỉnh Thái Bình và thu hái vào tháng 5 năm
2010. Mầu dược liệu đạt các tiêu chuẩn của dược liệu cỏ ngọt theo Dược Điển
Việt Nam IV [3].
Dược liệu được sấy ở 50°c trong 3h và xay nhỏ rồi bảo quản ở nhiệt độ
phòng trong túi nilon kín.
Độ ẩm dược liệu được xác định bằng máy đo độ ẩm PRECISA cho kết
quả 12,09%.
2.1.2. Thiết bị, hóa chất
Thiết bị
- Tủ sấy dược liệu MEMMERT
- Máy xác định độ ẩm PRECISA
- Cân phân tích PRECISA
- Máy đo điểm chảy STUART
- Máy cất quay BUCHI
1 KỉiONCí Đ ìi D i’O c H 4
nỘ Ĩ

THU V iÊ ỉM
Ngày 2
Q:i/
- Bản mỏng silicagel G F254 (MERCK) pha thuận hoạt hóa trong tủ

sấy ở nhiệt độ 105-110® c trong 60 phút.
- Cột sắc ký, bình chiết quả lê, bình nón, bình cầu, cốc có mỏ, ống
nghiệm, pipet Pasteur, phễu lọc Buchner.
- Máy đo phổ khối mW LETT PACKARD HP 5890, Serie II tại
Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia.
18
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE-500
MHz tại Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia.
Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích;
MeOH, EtOH, Chloroform, n-Butanol, Ca(0 H)2, FeCla, Acid Citric
monohydrat, nhựa Amberlite XAD-2, nhựa Amberlite XAD-7, nhựa Diaion
HP-20, H2SO4 đặc.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt theo hướng áp
dụng vào sản xuất.
- Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập được
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt
- Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-
buthanol và cột nhựa hấp phụ.
- Khảo sát các thông số của quá trình chiết xuất: nhiệt độ chiết, thời gian
chiết, số lần chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi.
- Hiệu suất chiết xuất tính theo dược liệu khô theo công thức (*):
m
A(%) =

X 100 Trong đó: A : Hàm lương phần trăm (%)
M(l-b)
m; Khôi lượng Steviosid thô (g)

b: Hàm ẩm dược liệu
M: Khối lượng dược liệu (g)