Nghiên cứu tổng hợp carbocystein

Bộ YT Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THỊ HIÈN
NGHIÊN CỨU TỎNG HỢP
CARBOCYSTEIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
Người hướng dẫn:
Ds. Đào Nguyệt Sương Huyền
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đai hoc Dươc Hà Nôi
o • • • •
HÀ NỘI-2011
LỜI CẢM OiN
Sau một thời gian làm việc khẩn trương được sự giúp đỡ tận tình của các thày
cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu
tổng hợp Carbocystein”.
Với tất cả sự kính trọng, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thày
giáo PGS. TS Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo
mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo DS. Đào Nguyệt Sương
Huyền, thày giáo TS Nsuyễn Văn Hân, DS. Nguyễn Văn Hải, DS. Nguyễn Văn
Giang và thày Phan Tiến Thành của Tổ môn Tổng hợp Hóa dược - Bộ môn Công
nghiệp dược đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện khóa luận vừa qua.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thày cô giáo thuộc bộ môn Công
nghiệp Dược, cũng như các thày cô trong trưòng Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình
trong suốt năm năm học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ tôi
và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn

bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Phạm Thị Hiền
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đồ THỊ
ĐẶT VẤN ĐÈ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về Carbocysteỉn
2
1.1.1. Cấu trúc hỏa học và tỉnh chất lý hóa 2
1.1.2. Tác dụng dược lý 5
ỉ. 1.3. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp Carbocystein 5
1.2. Tổng quan về L-cystin 10
1.2.1. Cẩu trúc hỏa học 10
1.2.2. Tính chất 11
1.2.3. Phương pháp điều chế 11
1.3. Tổng quan về L-cystein 11
1.3.1. Cẩu trúc hóa học 11
1.3.2. Tỉnh chất 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ ư 14
2.1. Nguyên vật liệu và thiết b ị 14
2.1 .1 .Nguyên liệu và hóa chẩt nghiên cứu 14
2.1.2. Thiết bị, mảy móc và dụng cụ nghiên cứu 15
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Khảo sát một sổ yếu tổ ảnh hưởng đến tổng hợp Carbocysteỉn đi từ hai
nguyên liệu L-cystin và L-cystein 15

2.2.2. Xác định cẩu trúc và kiểm tra độ tỉnh khiết của sản phẩm thu được 16
2.2.3. Kiểm nghiệm Carbocysteỉn theo một số tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Tổng hợp hóa học 16
2 .3.2 .Kiểm tra độ tinh khiết 16
2 .3.3.Xác định cấu trúc sản phẩm 17
2.3.4. Phương pháp khác 17
CHƯƠNG 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

18
3.1. Thực nghiệm và kết quả 18
3.1.1. Tổng hợp Carbocystein từL-cystein hydroclorid monohydrat

18
3.1.2. Tổng hợp Carbocystein từL-cystin 23
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm 30
3.3. Kết quả phân tích phổ của sản phẩm Carbocystein

31
3.2.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại 31
3.2.2. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( ’H- NMR)
32
3.4. Kiểm nghiệm sản phẩm thu được theo một số tiêu chuẩn Dược điển Anh
2009 32
3.4.1. Định tính Carbocystein theo một số tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009

32
3.4.2. Định lượng Carbocystein theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009

33

3.5. Bàn luận 35
3.5. ỉ. Tổng hợp Carbocystein từ L-cystein hydroclorỉd monohydrat 35
3.5.2. Tổng hợp Carbocysteỉn từ L-cystỉn 37
CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT
CMC
Carbocystein
g
gam
h
giờ
KL
Khối lượng
L-CHM L-cystein hydroclorid monohydrat
MCA Acid monocloacetic
ml mililit
NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance
spectroscopy)
IR
Phổ hồns nsoại (Inữared spectroscopy)
SKLM
Sắc ký ỉớp mỏng
r c
Nhiệt độ
TB
Trung bình
THF

Tetrahydrofuran
DANH MỤC CÁC BẢNG
•
Bảng 2.1 : Nguyên liệu và hóa chất nghiên cửu 14
Bảng 2.2: Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cửu 15
Bảng 3.1: Bảng ký hiệu và yêu cầu của các biến đầu vào
19
Bảng 3.2; Bảng ký hiệu và mục tiêu biến đầu ra 19
Bảng 3.3: Bảng thiết kế thí nghiệm phản ứng 19
Bảng 3.4: Kết quả các thí nghiệm 20
Bảng 3.5: Công thức tối ưu cho quy trình tổng hợp Carbocystein từ L-cystein

23
Bảng 3.6: Bảng kết quả phản ứng theo công thức tối ưu
23
Bảng 3.7: Bảng biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưỏng của các loại dung môi tới hiệu
suất tạo CMC 26
Bảng 3.8: Bảng biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến
hiệu suất phản ứng alkyl hóa 27
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản
ứng alkyl hóa 28
BảngS.lO: Kết quả khảo sát ảnh hưcmg của tỷ lệ mol L-cystin và acid
monocloacetic đến hiệu suất tạo Carbocystein 29
Bảng 3.11: Các thông số tốt nhất cho quy trình phản ứng tổng hợp CMC

30
Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm CMC

31
Bảng 3.13; Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của CMC tổng họrp được

31
Bảng 3.14: Kết quả phân tích phổ 'H- NMR của CMC tổng hợp được

32
Bảng 3.15: Kết quả định tính CMC theo một số tiêu chuẩn BP 2009

33
Bảng 3.16: Kết quả chuẩn độ lại dung dịch acid HCIO4 0,1M
34
Bảng 3.17; Kết quả định lượng CMC 34
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐÒ THỊ
Hình 3.1: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa L-CHM và MCA, thời
gian phản ứng alkyl hóa đến hiệu suất tạo CMC
20
Hình 3.2: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưcmg của tỷ lệ mol giữa L-CHM và MCA, nhiệt
độ phản ứng alkyl hóa đến hiệu suất tạo CMC 21
Hình 3.3: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của thời gian phản ứng và nhiệt độ phản
ứng alkyl hóa đến hiệu suất tạo CMC 21
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình tổng hợp CMC từ L-cystin 25
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến
hiệu suất phản ứng tạo CMC 27
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến
hiệu suất phản ứng tạo CMC 28
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol L-cystin và
MCA đến hiệu suất phản ứng tạo CMC 30
ĐẶT VẤN ĐÈ
Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm.
Do vậy bệnh đường hô hấp là một trong những bệnh phổ biến nhất hiện nay. Các
bệnh hô hấp thường gặp bao gồm: viêm phế quản cấp, viêm phổi do các loại vi

khuẩn, virus; hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, tràn dịch màng phổi, lao
phổi, ung thư phổi Các bệnh này chiếm khoảng 80% số các bệnh lý hô hấp, bên
cạnh đó, còn nhiều bệnh hô hấp khác, tuy nhiên chỉ chiếm tỷ lệ ít hơn như: giãn phế
quản, viêm phổi kẽ, bụi phổi, các biểu hiện phổi trong các bệnh hệ thống, nội tiết,
cơ xưong khớp, thận [3]
Có rất nhiều loại thuốc được sử dụng để điều trị các bệnh đường hô hấp,
trong đó Carbocystein được dùng rất phổ biến. Carbocystein có tác dụng làm lỏng
dịch nhầy đường hô hấp, được dùng trong các trường hợp rối loạn hô hấp, đặc biệt
liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mạn
tính, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng. Điều trị hỗ trợ
trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết
trước khi phẫu thuật [4, 16, 17, 20].
Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh được Carbocystein có tác dụng đáng
kể trong việc điều trị bệnh nghẽn phổi mãn tính (chronic obstructive pulmonary
disease- (COPD)) [11, 12] và trong việc ức chế sự lây nhiễm virus cúm A [24].
Tuy nhiên, trên thị thưòng Việt Nam các biệt dược chứa Carbocystein đều có
nguồn gốc nhập khẩu và chưa đon vị nào tổng họp đươc nguyên liệu này. Do vậy
giá thành các thành phẩm chứa carbocystein còn rất cao.
Để góp phần nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu làm thuốc, chúng tôi thực hiện
đề tài ""Nghiên cứu tỏng hợp Carbocysteỉtỉ'.
Với muc tiêu nghiên cứu sau:
^ Tổng hợp được Carbocystein từ hai nguồn nguyên liệu ban đầu là L-cystin
và L-cystein có hàm lượng đạt tiêu chuẩn BP 2009.
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp Carbocystein.
CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN
1.1. Tổng quan về Carbocystein (CMC)
1.1.1. Cấu trúc hóa hoc và tính chất lý hỏa
a. Cấu trúc hóa hoc [2 1 . 23]
HO.
'OH

Công thức phân tử: C5H9NO4S
Phân tử lượng: 179,19.
Thành phần: 33,51% C; 5,06% H; 7,82% N; 35,71% O; 17,89% s.
Danh pháp quốc tể (International Nonproprietary Name- INN): Carbocisteine
Danh pháp Hóa học theo Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure
and Applied Chemistry Nomenclature- lUPAC): (R)-2-Amino-3-
(carboxymethylsulfanyl) propanoic acid
Tên khác:
S-Carboxymethyl-L-cystein
Acid (R)-2-amino-4-thia-adipic
Acid L -2-Amino-3-(carboxymethylthio) propionic
3-(Carboxymethylthio)- L -alanin
L -3-((Carboxymethyl)thio)alanin
L -Carboxymethylcystein
( R )-Carbocistein
Carbocystein
b. Tính chat Iv hóa
Tính chất vật lý [21];
• Bột kết tinh hay tinh thể hình đĩa, không màu
• Tan trong nước sôi, không tan trong nước lạnh và không tan trong các các
chất hữu cơ thông thường (ethanol, methanol, aceton )
• Độ quay cực riêng: [a]o°= 0,5 trong dung dịch HCl IN
• Nhiệt độ nóng chảy; 204- 207°c.
- Tính chất hóa học [12]:
• CMC có cấu trúc của một a-amino acid, CMC có chứa nhóm -COOH và -
NH2 nên có các phản ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxyl như
phản ứng acetyl hóa, phản ứng fomiyl hóa hay este hóa.
+ Phản ứng vói Ninhydrin:
Nguyên tắc: Ninhvdrin là chất oxy hóa mạnh, khi đun nóng có khả năng khử
nhóm amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo ninhydrin khử, CO2, NH3 và

aldehyd. Sau đó ninhydrin và ninhydrin khử lại phản ứng tiếp với NH3 tự do tạo
thành phức hợp màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở Ằ,= 570nm. Cường độ màu phụ
thuộc vào nồng độ của acid amin.
o
o
Ninhydrin
NH,
Aminoacid
COOH
C
R
H
H2O
+ NH3 + CO2 + R- CHO
+ Phản ứng với FIuorescamin:
Nguyên tắc: Tạo sản phẩm huỳnh quang với a-amin của acid amin, đây là
phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng ngàn nano gram.
H

N
H
H H
I
,+
-c-
R
Acid amin
Dan xuất huỳnh quang
Pluorescamin
+ Phản ứng Biuret:

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm các liên kết peptid trong protein kết họp
với ion tạo phức họp màu tím ở dạng anion. Phản ứng này tạo phức có màu
bền vững và ổn định được dùng để định lượng protein.
R’ o
H I II H H
-C H C N CH
-
C N

C-
CuSO,
o
0
R"
R"
H
-C H

c

N

CH

c

N
I í
R’ 0
NaOH

R' o
-CH — c
-
N— CH — C— N — C

I li 'x X l
R 0 / R"
R o R"
-CH — C

N— CH — C— N

ộ


2Na
+ Phản ứng Edman:
Nguyên tẳc: Acid amin phản ứng với phenylisothiocyanat tạo dẫn xuất
phenylthiohydantoin có thể xác định liên tiếp tới 50 acid amin-N tận mà không hề
làm thủy phân đoạn peptid còn lại.
+ Phản ứng Sanger;
Nguyên tắc: Acid amin phản ứng với clorid đabsyl, clorid dansyl và 1-
fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân
protein.(Phản ứng này dùng để xác định aa-N tận nhưng không có khả năng xác
định liên tiếp vì peptid còn lại bị phá hủy do thủy phân).
H
I
-COO^

“OOC—C —N-

\ R H
\ /
-NO2 + H-
+
-N-
H
R
-C-
H
HF
O2N
l-fluoro-2,4 dinifrobenzen
acid a- amin
O2N
2,4-dinifrophenylaminoacid
-NO2
• Trong phân tử CMC có chứa lưu huỳnh, nên có phản ứng Folh xác định
acid amin chứa lưu huỳnh.
Nguyên tắc: CMC khi đun nóng trong môi trường kiềm sẽ phản ứng với muối chì
tạo chì sulfid PbS màu đen xám.
• Phân tử CMC có chứa nhóm chức acid (diacid), nên có phản ứng đặc
trưng của acid: phản ứng ester hóa, phản ứng acyl hóa.
1.1.2. Tác dung dươc lý T4. 12. 16. 17. 20. 241
Theo một nghiên cứu nhận thấy, các thành phần đường (fücose và acid
sialic) trên glycoprotein nhầy (còn được gọi là mucins) có liên quan đến độ nhớt của
dịch nhầv đưòms tiêu hóa. CMC ỉà một loại thuốc mucoresulation, có tác dụns điều
chỉnh fucose và acid sialic trong chất nhầy đường tiêu hóa thông qua cơ chế ức chế
yếu tố hoại tử khối u alpha (tumor nucrosis factor alpha- TNF a)- yếu tố làm tăng
độ nhớt của chất nhầy và ức chế sialyl Lewis X trên protein dung họp MUC5AC
(Mucin 5 kiểu phụ A và C) do đó làm giảm độ nhớt của chất nhày.

Theo một nghiên cứu khác, các tác giả cho biết, CMC có tác dụng làm lỏng
dịch nhầy đường hô hấp theo cơ chế làm gãy cầu nối disulfua của các glycoprotein
(còn gọi là mucoprotein) làm cho tan chất nhày nhớt đặc quánh.
Theo một nghiên cứu mới, CMC có tác dụng trong ngăn ngừa lây nhiễm cúm
tuyp A: CMC có tác dụng ức chế yếu tố nhân kappa B (Nuclear factor- kappa B:
NF-kB) và tăng độ pH trong endosomes làm giảm các thụ thể virus cúm người
trong tế bào biểu mô đưòng hô hấp, do vậy, ức chế sự lây nhiễm virus cúm A.
Chỉ định: Rối loạn hô hấp đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ
nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mãn, giãn phế quản, viêm phế quản dạng
hen hoặc khí phế thũng. Điều trị hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng,
chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật
1.1.3. Tổng quan về các phương pháp tổng hop CMC
1.1.3.1. Các phương pháp tong hơp CMC đi từL-cvsteỉn
a. Phương pháp của L. Michaelis và Maxwell p. Schubert (1934) [22]
Tổng hợp CMC (I) từ L-cystein hydroclorid monohydrat (II) và acid
monocloacetic (III) trong môi trường kiềm (dung dịch KOH 6,7M). Dung dịch sau
phản ứng được điều chỉnh về pH 5 bằng acid acetic băng, làm lạnh bằng nướcđá
trong 2h, cystein dư sẽ tủa lại. Lọc loại tủa cystein, thu lấy dịch lọc. Điều chỉnh pH
của dịch lọc về 2 bằng acid clohydric 6M, làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá
trong 2h. CMC sẽ kết tinh. Lọc thu lấy tinh thể. Hòa tan tinh thể CMC trong 200ml
nước sôi, lọc nóng thu dịch lọc. Dịch lọc được làm lạnh bằng đá. CMC sẽ kết tinh
dưới dạng tinh thể 6 mặt. Lọc, rửa bằng nước lạnh, sấy ở 60°c. Hiệu suất phản ứng
khoảng 70%, nhiệt độ nóng chảy 175- 176°c.
Phươns trình phản ứng;
o o
'OH
II
b. Phương pháp của M. D. Amstrong và cộng sự (1951)[9]
Tổng họfp CMC từ L-cystein bằng cách hồi lưu hỗn hợp của L-cystin và acid
monocloacetic trong acid HCl đặc. Kết quả thu được dạng racemic của CMC

c. Phương pháp của L. Goodmans và cộng sự (1958)[14]
CMC được tổng hợp từ L-cystein và acid monocloacetic, trong môi trường
nước, có mặt NaOH. Kết quả thu được L-CMC
d. Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1962)[32]
CMC được tổng hợp từ L-cystein hydroclorid monohydrat và monoacetat
natri trong môi trưÒTig kiềm (dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí Nitơ và nhiệt độ
thấp.
Tinh chế CMC: Đun nóng hỗn hợp gồm: CMC, HCl 3N ở 70°c trong 30
phút. Sau đó thêm than hoạt, rồi đun sôi khối phản ứng trong 15 phút. Lọc nóng để
loại bã than. Dịch lọc được làm nguội đến 40°c. Sau đó được trung hòa bằng cách
thêm từ từ dung dịch NaOH, khuấy mạnh. Duy trì nhiệt độ khối phản ứng 50°c
trong 16h, CMC sẽ kết tinh lại. Lọc thu tinh thể. Tạo hỗn dịch của tinh thể với nước
cất. lọc thu tinh thể, rửa cho tới khi có phản ứng âm tính với dung dich AgNOs-
Hiệu suất quá trình tinh chế đạt 89- 90%, CMC thu được có nhiệt độ nóng chảy
248"c, góc quay cực riêng ở 26°C: [ữ]ị°= -36°5 đến -38°.
e. Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1967) [19]
CMC được tổng hợp từ cystein hydroclorid và acid monocloacetic trong môi
trường pH 8 (điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí Nitơ ở nhiệt độ
50®c. Khi phản ứng kết thúc, ngừng cung cấp N2, sau đó điều chỉnh pH về 6 bằng
HCl đặc. Tẩy màu bằng than hoạt, lọc nóns, thu dịch lọc. Dịch lọc được đưa về
nhiệt độ phòng. Điều chỉnh pH dịch lọc về 2,8 bằng HCl đặc, CMC (I) sẽ kết tủa.
Ly tâm thu lấy tủa và rửa tủa cho đến khi hết ion cr.
Tinh chế: Tạo hỗn dịch của CMC thô với HCl 2N (HCl dư khoảng 25%).
Đun sôi hỗn dịch trong 5 phút, rồi làm lạnh về 30°c. Điều chỉnh pH dung dịch đến
2,8 bằng NaOH 2N. Sản phẩm I sẽ kết tủa. Lọc rửa tủa sản phẩm tới khi hết ion cr.
Sản phẩm đạt độ tinh khiết 99,5%. Hiệu suất phản ứng đạt 90- 95%. Nhiệt độ nóng
chảy: 249-250°c.
f. Phương pháp của Bethge và các cộng sự (1984)[31]
Hòa tan hoàn toàn 140 g clohydrat (RS) cystein, trong llit dung dịch NaOH
4N. Khuấv và cho thêm vào dung dịch 3 2; NaHS. Khuấy thêm 45 phút. Sau đó cho

vào khối phản ứng 95g acid monocloacetic. Luôn giữ nhiệt độ 20°c trong suốt các
quá trình đó. Để khối phản ứng 3h ở nhiệt độ 20- 30°c. Sau đó điều chỉnh pH về 3
bằng dung dịch HCl. Hạ nhiệt độ xuống 10°c, hỗn hợp racemic của CMC kết tinh.
Lọc lạnh, rửa với nước loại ion clorid. sấy tinh thể ở 105°c. Hiệu suất phản ứng đạt
97%, hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy 188- 192°c.
Từ hỗn họp racemic (RS) CMC tách lấy (R) CMC bằng (R)-l-phenyl
ethylamin và tách lấy (S) CMC bằng (S)-l-phenyl ethylamin
ỉ. 1.3.2. Các phươmpháp tons hơp Carbocvsteỉn đi từL-cvstin
a. Phương pháp của Ear ỉ Pierson và các cộng sự (1946) [26]
8
CMC được tổng hợp từ L-cystin (IV) bằng cách thực hiện phản ứng khử
trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 30%) có mặt acid monocloacetic (III) và
kẽm, ở nhiệt độ 30°c. Dịch phản ứng sau khi loại bỏ kẽm dư sẽ được điều chỉnh về
pH 2 bằng acid sulíliric đặc. Hạ nhiệt độ phản ứng xuống 15- 20°c, khuấy liên tục
trong Ih, CMC (I) sẽ kết tinh. Lọc, rửa tinh thể bằng nước lạnh, sấy thu được sản
phẩm I. Hiệu suất phản ứng đạt 90%, nhiệt độ nóng chảy 188- 191°c.
Phương trình phản ứng:
o
,COOH l,Zn/NaOH HOv
NH,
HOOC
rv
'1
NH,
2’.
CK
o
III
'OH
trong NaOH

b. Phương pháp Maỉerhop và công sư (1978) [81
Để tổng họp CMC (I), trước tiên nhóm tác giả tiến hành phản ứng khử hóa
L-cystin (IV) bằng tác nhân Na/ NH3 lỏng, ở -40°c để tạo thành L-cystein (II). Sau
đó cho II thu được phản ứng với acid monocloacetic (III) ở nhiệt độ 20-30°c, tạo
thành CMC (I). Hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 92%, sản phẩm thu được có độ tinh
khiết cao hơn các phương pháp khác
Phưong trình phản ứng:
NH2
NH2
HOOC.
NH2
'COOH
l.N a /N H s
IV
2. CICH2COOH
'COOH
XOOH
c. Phương pháp của J. González-García và các cộng sự (1998)[15]
Sử dụng phản ứng điện phân L-cystin tại cực âm với dự có mặt của anion
monocloacetat được thêm vào trong suốt quá trình điện phân. Điện cực sử dụng có
thể là điện cực carbon.
- Cực âm: Điện cực sợi carbon
- Cực dương: Kim loại
- Dung dịch cực âm: dung dịch L-cystin/NaOH. Nồng độ L-cystin
ban đầu 0,8- 1,3M. pH dung dịch khoảng 8- 13,5
- Dung dịch cực dương: Dung dịch Na2SƠ4
- Mật độ dòng điện; 250- 2000 Pdvcỉ
- Nhiệt độ; 40- 50°c
Nồng độ L-cystin trong sản phẩm cuối luôn thấp hơn 0,5%
1.1.3.3. Các phương pháp tom hơp Carbocvstein đi từ nsuyên liêu khác

a. Phương pháp của Kazuo Nakayasu và cộng sự (1984) [25]
Các tác giả tiến hành tổng hợp CMC (I) đi từ nguyên liệu ban đầu là acid
thioglycollic (V) bằng phản ứng với p-cloroalanin (VI) trong môi trưòmg kiềm
(dung dịch KOH), pH 10-13, ở nhiệt độ 20°c. Sau đó acid hóa khối phản ứng về pH
2-4, sản phẩm I sẽ kết tủa.
Phưong trình phản ứng;
0
'OH
Ồ
b. Phương pháp của Kenzo Yokozeki và các cộng sự (1988)[29]
Từ chất ban đầu là DL-2-aminothiazolin-4-carboxylic acid (ATC), sử
dụng vi khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum hoặc Pseudomonas molytica, quá
trình sinh tổng họp nên CMC gồm 4 bước:
- Bước 1: Sử dụng enzym ATC racemase phân tách hỗn hợp đồng phân
racemic DL-ATC thành D-ATC và L-ATC
- Bước 2: Thủy phân L-ATC thành S-carbamyl-L-cystein (L-SCC) bằng
enzym L-ATC hydrolase
10
- Bước 3: Thủy phân L-SCC thành L-cystein bằng enzym L-SCC
hydroxylaze
- Bước 4: L-cystein phản ứng với anion monocloacetat tạo thành CMC.
Ps. thiazolinophilum và Ps. desmolytica có thể tạo ra cả 3 enzym trên với sự có mặt
của DL-ATC trong môi trưòng nuôi cấy.
c. Phương pháp của Ken-Ichi Ishiwata và cộng sự (1989)[18]
Các tác giả tiến hành tổng hợp CMC (I) tìr L-serin với enzym tryptophan
synthease (thu được từ nuôi cấy vi khuẩn Escherichia Coli trong môi trường dinh
dưỡng thích hợp. Enzym tryptophan synthease sẽ xúc tác cho phản ứng thay thế vị
trí ß của L-serin bằns một chất nền là thioslvcolic hoặc tốt hơn là alkylthioglycolat
tạo thành -^-(l-EthylhexyloxycarbonylmethyO-l-cystein, sau đó S-{2-
ethylhexyloxycarbonylmethyl)-l-cystein sẽ bị thủy phân trong môi trường kiềm tạo

sản phẩm I.
d. Phương pháp của Jingmin Zeng và cộng sự (2005)[30]
Các tác giả tổng họp CMC (I) đi từ nguyên liệu là polycystein theo sơ đồ sau:
^SH
HC-
ể
'HN'
Glyoxal
-CH
Reaưangement
Thiohemiacetal

►
Ö
.CH
HoN'
Po ly cy Stein
X O O H
Ö
1.2. Tổng quan về L-cystin
1.2.1. Cấu trúc hỏa hoc:
Công thức cấu tạo [21]:
o
Công thức phân tử: C6H12N2O4S2
11
- Phân tử lượng; 240,30
- Thành phần: C: 29,99%; H: 5,03%; N: 11,66%; O: 26,63%; S; 26,69%
- Tên khoa học: ß,ß’-diamino-ß,ß’-dicarboxydiethyl disulfid.
1.2 .2 . Tính chất
a, Tỉnh chất vát lý [21]:

- Dạng bột kết tinh màu trắng
- Thực tế không tan trong alcol
- Tan trong nước ở pH< 2 hoặc pH>
8
- Năng suất quay cực [a]n^^ = - 223.4° trong dung dịch HCl 1,0N.
- Nhiệt độ nónơ chảy khoảns 260-26 l°c
b. Tỉnh chất hóa hoc [13]:
L-cystin có cấu trúc của một a-amino acid, do vậy nó mang tính chất hóa học
cơ bản của một a-amino acid. Tham gia các phản ứng với Ninhydrin, phản ứng với
Flourescamin, phản ứng Sanger, phản ứng Edman và vì chứa s nên có phản ứng
Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh.
1.2.3. Phương pháp điều chế:
L-cystin có thể điều chế bàng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta có thể
tổng hợp được L-cystin từ serin hay acid acrylic, hoặc có thể sinh tổng hợp từ các
enzym [10]. Tuy nhiên phương pháp thủy phân L-cystin từ protein vẫn đon giản
và có ý nahĩa môi trưÒTig hơn cả.
L-cystin là một trong những sản phẩm thu được từ dịch thủy phân của
keratin có trong tóc, sừng, móng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng L-cystin có tỉ lệ
cao trong keratin của tóc, sừng, móng và lông [2, 5, 6 , 7]: Tóc (14,0%), lông lợn
(14,4%), sừng (12,1%), len (10,3%)- Do vậy, các nguồn keratin khác nhau chính là
nguồn nguyên liệu chủ yếu để tách chiết L-cystin.
1.3. Tổng quan về L-cystein
1.3.1. Cấu trúc hỏa hoc \2\\.
12
'OH
- Công thức phân tử: C3H7NO2S. KLPT: 121,16.
- Tên khoa học; 2-amino-3-mercaptopropionic acid.
1.3 .2 . Tính chất
a. Tính chất vât lý [21 ]:
- Góc quay cực: [a]D^^=+6.5° (trong dung dịch HCl 5N).

- pKa: pKi= l,71;pK2=8,33;pK3=10,78
- Dễ tan trong nước, alcol, acid acetic, amoniac; không tan trong ether, aceton,
ethyl acetat, benzen, disulfid carbon, tetrachlorocarbon.
- Trong môi trường nước trung tính hoặc kiềm nhẹ, L-cystein dễ bị oxy hóa
thành cystin bởi không khí. Nó ổn định hơn trong dung dịch acid.
- Dạng muối HCl (C3H7NO2S.HCI): tan được trong nước, alcol, aceton; dung
dịch có tính acid; phân hủy và oxy hóa chậm; có khả năng hút ẩm; dạng dược
dụng: L-cystein hydrochlorid monohydrat C3H7NO2S.HCl.H2O.
b, Tỉnh chất hóa hoc [13]:
- Với cẩu trúc có chứa cả hai nhóm -COOH và nhóm -NHi nên L-cvstein có
những tính chất hóa học cơ bản của một aminoacid.
Tính chất của nhóm thiol:
Do s và o thuộc cùng một phân nhóm trong bảng tuần hoàn các nguyên tổ hóa học
(phân nhóm VI.A) nên chúng có một số tính chất hóa học tương tự nhau. Tính chất
hóa học của các hợp chất chứa nhóm thiol tưong tự như của alcol; các thiol tạo ra
các thioete, thioacetal, thiocetal, thioester.
Ví dụ;
• Tạo thioete khi tác dụng với alcol;
R-SH + R'OH

► R-S-R+H 2O
13
• Tác dụng với aldehyd và ceton tạo thành thioacetal và thiocetal;
2R-SH + R'-CH=0

► R'-CH(SR)2
Thioacetal
2R-SH + 7 = 0

► ỵ C \ 2

/ R . /
R" R
• Dễ bị oxy hóa:
Khi oxy hóa nhẹ nhàng thiol bởi oxy của không khí thì tạo thành dialkyl disulfid;
2R-SH + -Ơ 2

► R-S-S-R + H2O
(dialkyl disulfid)
Khi oxy hóa mạnh thiol với acid nitric tạo ra alkyl sulfonic:
[0]
R-SH

► R-SO3H
HNO3 (alkyl sulfonic)
• Phản ứng với dung dịch chì acetat cho kết tủa chì mercaptid có màu
vàng đặc trưng để nhận biết.
• Nguyên tử lưu huỳnh trong nhóm thiol có độ âm điện nhỏ hơn nguyên
tử oxy trong alcol nhưng lại thể hiện tính acid yếu.
14
CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯOnVG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. N2 uvên vât liêu và thiết bi
Đề tài sử dụng một số nguyên liệu, hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí
nghiệm Tổng họp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược.
2.1.1. Nguyên liêu và hỏa chất nghiên cửu
Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu
STT
Tên nguyên liệu và hóa chất
Nguồn gốc
1

Acid acetic
Trung Quốc
2
Acid acetic băng
Merck
3
Acid forniic
Merck
4
Acid hydrocloric
Trung Quốc
5 Acid monocloacetic
Trung Quốc
6
Acid percloric
Merck
7
Acid sulfuric
Trung Quốc
8
Anhydrid acetic
Merck
9
Bột kẽm
Trung Quốc
10
n-Butanol
Trung Quốc
11
L-cystein hydroclorid monohydrat

Merck
12
L-cystin
Việt Nam
13
Ethanol Trung Quốc
14
Giấy chỉ thị vạn năng
Trung Quốc
15 Kali hydrophtalat
Merck
16
Natri acetat
Trung Quốc
17
Natri hydroxyd
Trung Quốc
18
Ninhydrin
Trung Quốc
19
Nước cất
Việt Nam
20
Tetrahydrofuran
Trung Quốc
15
2.1.2. Thiết bi. máy móc và dung cu nghiên cửu
Bảng 2.2: Thiết bị, mảy móc và dụng cụ nghiên cứu
STT

Tên thiêt bị, máy móc
Nguồn gốc
1
Bản mỏng Silicagel GF254 70- 230 mesh
Đức
2
Bình cầu 2 cổ và 3 cổ lOOml
Đức
3 Bình cầu đáy tròn loại 50ml, lOOml
Đức
5 Bình phun sắc ký
Trung Quốc
6
Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S
Đức
7
Cân phân tích Mettler Toledo AB204S
Thụy Sỹ
8 Cốc có mỏ lOOml, 250ml, 500ml
Trung Quốc
9
Đũa thủy tinh, pipet paster
Trung Quốc
10
Máy cất quay Buchi B491
Thụy Sỹ
11
Máy chuẩn độ đo thế 751 GDP Titrino Metrohm
Đức
12

Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ- Melt
Mỹ
13 Máy đo pH
Đức
14
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ’H-NMR
Brucker AV- 500MHz (Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam)
Mỹ
15
Máy đo phô hông ngoại GX- Perkin Elmer (Khoa Hóa-
Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)
Mỹ
16 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA
Đức
17 Nhiệt kế thủy ngân
Trung Quốc
18 Phân cực kế Đức
19 Phễu lọc Buchner
Trung Quốc
20
Pipet chính xác Iml, 5ml, lOml
Trung Quốc
21 Tủ sấy Memmert
Đức
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát môt số yếu tố ảnh hưỏmg đến tổng hơp CMC đi từ hai nguyên
liêu: L-cvstin vả L-cvstein:
a. Tổng hợp CMC từ L-cysteỉn
16

Khảo sát một số yểu tố ảnh hưởng đến phản ứng sau:
Tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng (L-cystein) và tác nhân alkyl hóa (acid
monocloacetic)
Nhiệt độ phản ứng alkyl hóa
Thời gian phản ứng alkyl hóa
Sử dụng phần mềm MODDE 5.0 và INFonn v3.1 để tối ưu hóa phản ứng.
h. Tổng hợp CMC từ L-cystin:
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưỏng đến phản ứng sau:
Loại dung môi dùng trong giai đoạn tạo phức hợp cysteinat
Tinh chế phức hợp cysteinat
Nhiệt độ phản ứng alkyl hóa
Thời gian phản ửng alkyl hóa
^ Tỷ lệ mol giữa chất tham gia phản ứng (L-cystin) và tác nhân alkyl hóa (acid
monocloacetic).
2.2.2. Xác đinh cấu trúc và kiểm tra đô tinh khiết của sản phẩm thu đươc
2.2.3. Kiểm nghiêm CMC theo môt số tiêu chuẩn BP 2009
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tồng hơp hóa hoc
^ Tổng hợp CarbocyStein từ L-cyStein hydroclorid monohydrat
Trong một số phương pháp tổng hợp CMC đi từ L-cystein, đề tài sử dụng
phương pháp của tác giả L. Michaelis và cộng sự.
Tông hợp Carbocystein từ L-cystin
Tiến hành phản ứng tổng họp CMC từ L-cystin dựa trên các phương pháp của
các tác giả R.B.Turner và D.M.Voitle về khử hóa L-cystin, của các tác giả L.
Michaelis và Maierhop về alkyl hóa L-cystein tạo CMC.
2.3.2. Kiểm tra đô tinh khiết
Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu được bằng SKLM và đo nhiệt độ
nóng chảy.
SKLM: Tính giá trị hệ số lưu giữ Rf
17

• Dung môi hòa tan; dung dịch HCl IM
• Hệ dung môi chạy sắc ký: n-Butanol: Acid acetic băng: Nước cất= 6:2:2
• Thuốc thử hiện màu; Dung dịch Ninhydrin 1% trong aceton
2.3.3. Xác đinh cấu trúc sản phẩm
Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân proton (*H-NMR)
2.3.4. Phương pháp khác
a. Định lượng CMC theo tiêu chuẩn BP 2009
Phương pháp chuẩn độ acid- base trong môi trường khan:
Hòa tan 0,150g chế phẩm trong lOml acid foraiic khan, đun nóng nhẹ và lẳc tới khi
hòa tan hoàn toàn. Thêm 50ml acid acetic khan. Chuẩn độ với acid percloric 0,1M,
xác định điểm kết thúc bằng máy đo điện thế.
Iml dd acid percloric tương đương với 17,92mg CMC
Nguyên tắc chuẩn độ: Chuẩn độ base yếu trong môi trường khan
CMC có nhóm NH2 ký hiệu là R-NH2
^ Phương trình chuẩn độ;
R-NH2 + CH3COOH

► R- NHs^CHsCOO'
R- NHs^CHaCOO- + HCIO4

► R- NH3^C104’ + CH3COOH
Gọi thể tích acid percloric tại điểm tương đương là V (ml)
^ Khối lượng chế phẩm là mi (mg)
o Khối lượng CMC là;
m = v X 17,92 (mg)
■=> Hàm lượng CMC có trong chế phẩm là:
TTT-
Hàm lượng CMC = X 100%
m l

Yêu cầu; Hàm lưọng CMC trong chế phẩm từ 98,5 % đến 101%
b. Xử lý kết quả, sổ liệu nghiên cứu bằng phần mềm Excel.
c. Toi im hóa quy trình tổng hợp CMC từ L-cysteỉn bằng phần mềm
MODDE 5.0 và IN Form vi. 7.
__
_
TRL'’ỜN(} ĐH ĐliỤC HÀ MỘĨ
T H I I V IỆ M
N gày

‘1,. thàng - năm 20Ảẩ.
^ '^ < c B:


■ ■ -
18
CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thực nghiệm và kết quả
3.1.1. Tồng hơp CMC từ L-cvstein hvdroclorid monohvdrat
Phưong trình phản ứng;
o o
III
o
NaOH
c
OH
II
Quá trình phản ứng diễn ra như sau:
Hòa tan hỗn hợp gồm: 0,63g (3,59mmol) L-cystein hydroclorid monohydrat
(II), 0,36g (3,8mmol) acid monocloacetic (III), Iml nước và l,7ml dung dịch

NaOH 6,7 M. Sau đó khuấy thêm 5 phút, rồi điều chỉnh pH của dung dịch về 5 bằng
acid acetic. Làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h, L-cystein dư sẽ tủa lại.
Lọc loại tủa L-cystein, thu lấy dịch lọc. Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2 bằng acid
h
ydrocloric 6M. Sau đó làm lạnh dịch pH 2 bằng nước đá trong 2h. CMC (I) sẽ kết
tinh dưới dạng muối nội. Lọc thu lấy tinh thể. Hòa tan tinh thể CMC trong 200ml
nước sôi, lọc nóng thu dịch lọc. Dịch lọc được để kết tinh lạnh qua đêm. CMC sẽ
kết tinh dưới dạns tinh thể trắna, ỉóng lánh. Lọc, rửa bằns nước lạnh, sấy ở 60°c.
Hiệu suất phản ứng khoảng 70%, nhiệt độ nóng chảy 204- 21 l°c.
■=> Đe xác định quy trình tối ưu cho tổng họp CMC với hiệu suất phản ứng cao
nhất, tiến hành tối ưu hóa quy trình tổng họp, sử dụng phần mềm MODDE
5.0 vàlNPorm v3.1.
^ Dùng phần mềm MODDE 5.0 để thiết kế các thí nghiệm, dựa trên mặt hợp tử
tại tâm rút gọn, kết quả được xử lý bằng phần mềm INForm v3.1 để tìm ra
mối quan hệ giữa các biến độc lập và các biển phụ thuộc,
a,
Thiết kế thí nghiệm

Lựa chọn biến đầu vào;