Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI







NGUYỄN ĐẮC TÙNG


BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA
NUCIFERIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ








HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐẮC TÙNG


BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA
NUCIFERIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội.


HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN

Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn
chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, TS. Nguyễn Văn Hải,
ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền – những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn
tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá
trình làm thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Phạm Thị

Hiền cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công
nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Dược lực – Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thiện được đề
tài nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
quá trình học tập ở trường.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các
bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công
nghiệp dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn
đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc.

Xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên
Nguyễn Đắc Tùng
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây 3
1.1.1 Cây sen 3
1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen 4
1.1.2.1 Chiết xuất 4
1.1.2.2 Tinh chế và phân lập. 5
1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây 6
1.2 Hợp chất Nuciferin 6

1.2.1 Công thức, tính chất 6
1.2.2 Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dƣợc liệu 7
1.2.3 Tác dụng dƣợc lý. 7
1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid) 7
1.2.3.2 Tác dụng dƣợc lý của dịch chiết sen và của nuciferin 8
1.2.3.3 Một số tác dụng dƣợc lý đã đƣợc nghiên cứu ở sản phẩm demethyl hóa 10
1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp demethyl hóa 11
1.3.1 Phƣơng pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether 11
1.3.2 Các phƣơng pháp demethyl hóa nuciferin 14
1.4 Các phƣơng pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol 16
1.4.1 Phƣơng pháp sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi Acetonitril 16
1.4.2 Phƣơng pháp sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi DMF 17
1.4.3 Phƣơng pháp sử dụng NaOH trong nƣớc 17
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 Nguyên vật liệu 19
2.2 Thiết bị và dụng cụ 20
2.3 Nội dung nghiên cứu 21
2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen 21
2.3.2 Thực hiện demethyl hóa nuciferin 21
2.3.3 Thực hiện O-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin bằng tác nhân EC 21
2.3.4 Thử tác dụng sinh học 22

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22
2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 22
2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm 23
2.4.3 Thử tác dụng sinh học 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. 24
3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 24
3.1.1 Quy trình chiết nuciferin 24
3.1.2 Tinh chế Nuciferin. 24
3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin
(N-methyl-asimilobin, II) 24
3.2.1 Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr 24
3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI 27
3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid 27
3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-
methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) 28
3.3.1 Sử dụng môi trƣờng NaOH loãng 29
3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K
2
CO
3
31
3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K
2
CO
3
31
3.3.4 Đề xuất quy trình 32
3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp 34
3.5 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid
(II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V) 37

BÀN LUẬN 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………….…49
1. KẾT LUẬN 49
2. ĐỀ XUẤT 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DMF
Dimethylformamid
DPPH
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
EC
2-Cloroethanol
ESI-MS

(Electrospray Ionization Mass Spectrometry)
EtOH
Ethanol
EtSNa
Natri thioethoxid
1
H-NMR
n
(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
IR
(Infrared Spectroscopy)
IUPAC
Hiệp hội Hóa học Quốc tế
(International Union of Pure and Applied Chemistry)
MeOH

Methanol
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
SN
2

Phản ứng thế ái nhân lƣỡng phân tử (Nucleophilic Substitution)
SOD
Superoxid
t
o
nc

Nhiệt độ nóng chảy

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.
Một số alkaloid trong lá sen…………………………………………
4
Bảng 2.1.
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm
19
Bảng 2.2.
Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm…………
20
Bảng 3.1.
Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng bán
tổng hợp (II)…………………………………………………………
26
Bảng 3.2.

Khảo sát lƣợng KI ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng monodemethyl
hóa nuciferin…………………………………………………………
27
Bảng 3.3.
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr)……………
34
Bảng 3.4.
Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của
nuciferin………………………………………………………………
34
Bảng 3.5.
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của N-methyl-asimilobin
hydrobromid (IR, KBr)……………………………………
35
Bảng 3.6.
Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm
N-methyl-asimilobin hydrobromid (
1
H-NMR, DMSO)………………
36
Bảng 3.7.
Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2-
hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (
1
H-NMR, MeOD)………………
37
Bảng 3.8.
Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH…………….
38
Bảng 3.9.

Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD………
39
Bảng 3.10.
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và
IC
50
của mẫu thử……………………………………………………
40
Bảng 3.11.
Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC
50

của mẫu thử…………………………………………………………….
40

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)…………………………………….
3
Hình 2. Công thức chung các alkaloid phổ biến trong lá sen ……………… …
4
Hình 3. Công thức cấu tạo của nuciferin ………………………………………
6
Hình 4. Công thức cấu tạo nhân aporphin………………………………………
7
Hình 5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin………………………………
11
Hình 6. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin……….
12
Hình 7. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF…………
12

Hình 8. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl
3
trong CH
3
CN…
12
Hình 9. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr
3
trong CH
3
CN…
13
Hình 10. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng H
2
SO
4
……………
13
Hình 11. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và NaI………………
14
Hình 12. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và AcOH……………
14
Hình 13. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF…
15
Hình 14. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac
2
O ……………
15
Hình 15. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%
16

Hình 16. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi CH
3
CN ……
16
Hình 17. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi DMF …………
17
Hình 18. Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trƣờng NaOH loãng………………….
17
Hình 19. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%
25
Hình 20. Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin.
26
Hình 21. Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin
26
Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin………
28
Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin…………………
29
Hình 24. Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa………………
30
Hình 25. Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa……………….
31

Hình 26. Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất (II) để tổng hợp sản
phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V)………………

33
Hình 27. Vai trò xúc tác của KI trong phản ứng demethyl hóa…………………
42
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở nhiều quốc gia trên thế giới, nhất là ở các nƣớc đang phát triển, xu thế
con ngƣời bắt đầu sử dụng nhiều các loại thuốc chữa bệnh và bồi dƣỡng sức
khỏe có nguồn gốc từ thảo dƣợc hơn là sử dụng thuốc tân dƣợc vì nó ít độc hại
hơn và ít tác dụng phụ hơn. Hơn nữa, hiện còn nhiều triệu chứng và bệnh hiểm
nghèo chƣa có thuốc đặc hiệu để chữa trị, ngƣời ta hi vọng rằng từ nguồn động
thực vật tự nhiên hoặc từ vốn trí tuệ bản địa của các cộng đồng, qua nghiên
cứu sàng lọc có thể cung cấp cho nhân loại những hợp chất có hoạt tính sinh
học cao để làm ra các loại thuốc mới có hiệu quả chữa bệnh nhƣ mong muốn
[1].
Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn dƣợc liệu phong phú đa
dạng làm thuốc với những bài thuốc y học cổ truyền đã có hiệu quả trong việc
phòng và chữa trị nhiều bệnh. Những tác dụng cũng nhƣ chất lƣợng của những
bài thuốc đang dần dần đƣợc chứng minh và kiểm soát.
Trong rất nhiều loại dƣợc liệu đƣợc sử dụng để chữa bệnh, có Sen là một
loài rất phổ biến ở Việt Nam. Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn.,
họ Sen – Nelumbonaceae. Từ xƣa đến nay sen đã đƣợc sử dụng trong rất nhiều
bài thuốc y học cổ truyền ở các nƣớc phƣơng Đông nhƣ Việt Nam, Trung
Quốc, Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen.
Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính.
Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra đƣợc rất nhiều tác dụng mới của dịch
chiết các bộ phận cây sen cũng nhƣ của nuciferin, điển hình nhƣ tác dụng

chống ung thƣ [36], chống HIV [41], chống tăng lipid máu [36], hay có tác
dụng chống oxy hóa mạnh [37].
Nhờ có ƣu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng nhƣ là tiềm năng của
nó trong y dƣợc học, cây sen trong những năm gần đây đƣợc đƣa vào nghiên
cứu rất nhiều ở Việt nam. Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách
2

chiết với hiệu suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là
một hƣớng phát triển để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh. Đề tài
“Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin” đƣợc
thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Bán tổng hợp một số dẫn chất nuciferin.
2. Thử tác dụng chống oxy hóa của các dẫn chất bán tổng hợp đƣợc.
3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây
1.1.1 Cây sen
Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae.
Phân bố: Vùng nhiệt đới
châu Á, Châu Mĩ và ở Việt
Nam.
Đặc điểm thực vật: Cây
mọc dƣới nƣớc, sống nhiều
năm. Thân rễ hình trụ mọc bò
lan trong bùn, lá hình tròn mọc
lên khỏi mặt nƣớc, cuống dài có
gai, đính ở giữa phiến lá, mép lá
uốn lƣợn tròn. Hoa to màu hồng
hay trắng có mùi thơm. Nhiều

lá noãn chứa trong một đế hoa chung hình nón ngƣợc sau thành quả có vỏ
cứng màu nâu đen. Cây Sen đƣợc trồng ở các ao hồ khắp nơi trong nƣớc ta.
Mùa thu hái: tháng 7 – 9 [6,7].
Thành phần hóa học: Lá sen có chứa alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có
nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, O-
norciferin, armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin,
dehydroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin.
Trong đó nuciferin là alcaloid chính. Ngoài ra trong lá sen còn có flavonoid,
tanin, acid hữu cơ. Trong tâm sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó
có liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, nuciferin, pronuciferin,
methylcorypallin, demetylcorlaurin [3,6,7,12].
Hình 1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)
4





Công dụng: Alcaloid toàn phần trong lá sen có tác dụng an thần, hạ huyết
áp nhẹ. Lá sen đƣợc dùng để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20 g/ngày.
Lá sen kết hợp với một số dƣợc liệu khác làm thuốc an thần. Tâm sen chữa mất
ngủ, an thần, di mộng tinh. Ngày dùng 4 – 10 g dƣới dạng thuốc hãm hay sắc
uống [6,7].
1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen
1.1.2.1 Chiết xuất
- Phƣơng pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trƣờng kiềm: Chiết
xuất alcaloid toàn phần từ lá sen, tâm sen, gƣơng sen theo cùng qui trình sau:
Bột dƣợc liệu đƣợc làm ẩm bằng NH
4
OH 10% sau đó chiết bằng cồn 70

o
. Dịch
chiết cồn đƣợc cất dƣới áp suất giảm để thu hồi cồn. Hòa tan cắn vào nƣớc,
acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 2. Lọc loại bỏ cặn. Dịch lọc acid đƣợc chiết
bằng ether dầu hỏa để loại tạp. Dich chiết acid đƣợc thêm NH
4
OH 10% đến pH
Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen
Một số Alkaloid
R1
R2
R3
Nuciferin
CH
3

CH
3

CH
3

N – nor – Nuciferin
CH
3

CH
3

H

O – nor – Nuciferin
H
CH
3

CH
3

Roemetine
- CH
2
-
CH
3

Anonaine
- CH
2
-
H
Hình 2. Công thức chung các
alkaloid phổ biến trong lá sen
5

= 10 – 11 rồi chiết bằng CHCl
3
. Dịch chiết CHCl
3
đƣợc cất thu hồi dung môi,
còn lại cắn alcaloid toàn phần [5].

- Phƣơng pháp chiết bằng cồn: Bột lá sen đƣợc chiết bằng cồn lạnh trong
4 ngày. Dịch chiết đƣợc cô thành cắn dƣới áp suất giảm. Sau đó hỗn hợp đƣợc
chiết cân bằng giữa 2 pha CHCl
3
và dung dịch NH
4
OH 5%. Lấy pha hữu cơ,
rửa lại bằng nƣớc, lắc vài lần với HCl 2N vài lần (pha acid sẽ lấy đi tạp dạng
dầu màu nâu). Pha CHCl
3
đƣợc cô ở áp suất giảm thu đƣợc cặn, nghiền nhỏ
trong dung dịch NH
4
OH ấm sau đó chiết bằng CHCl
3
. Lấy pha hữu cơ, làm
khan, cô dƣới áp suất giảm thu đƣợc cắn alkaloid toàn phần [6, 11].
1.1.2.2 Tinh chế và phân lập.
- Phân lập alcaloid bằng sắc kí cột sử dụng silica gel 60 GF254(Merck):
Hoạt hóa silica gel ở nhiệt độ 110
o
C trong 1 giờ. Lắc silica gel với hệ
dung môi đã chọn thành hỗn dịch, rót từ từ vào cột, sau đó cho dung môi chảy
qua liên tục với thời gian là 5 giờ để ổn định cột. Cắn alkaloid toàn phần ở
trên đƣợc hòa vào một lƣợng nhỏ với hệ dung môi đã chọn tạo thành dịch
alkaloid đậm đặc rồi trộn với một lƣợng silica gel vừa đủ đƣa vào cột sắc kí đã
chuẩn bị ở trên. Rửa giải bằng hệ dung môi đã chọn theo tỉ lệ độ phân cực tăng
dần. Tốc độ chảy khoảng 30 giọt/phút, hứng mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào
các ống nghiệm riêng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng. Chọn riêng các phân
đoạn chỉ có một vết trên sắc kí đồ, bốc hơi dung môi thu đƣợc cắn alcaloid.

Kết tinh lại nhiều lần sẽ thu đƣợc alkaloid tinh khiết. Riêng các phân đoạn có 2
hoặc 3 vết đƣợc tiến hành phân lập tiếp bằng sắc kí lớp mỏng điều chế [3,6].
- Phân lập alcaloid bằng sắc kí lớp mỏng điều chế:
Chấm dung dịch chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thƣớc
20 x 20 cm đƣợc tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110
o
C trong 1 giờ. Hệ dung môi khai triển là CHCl
3
: MeOH : NH
4
OH = 50 : 9 : 1.
Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó phun thuốc thử Dragendorff lên
6

một góc để phát hiện và đánh dấu vết alcaloid. Cạo lấy silica gel chứa chất cần
tách, phản hấp phụ bằng CHCl
3
và lọc. Để CHCl
3
bốc hơi tự nhiên, sau đó hòa
tan lại bằng cồn ethanol rồi để tủ lạnh, cho kết tinh lại nhiều lần thu đƣợc 2
alcaloid tinh khiết là KN1 và KN2. Qua phân tích cấu trúc nhận dạng đƣợc
KN1 là nuciferin [3,6].
1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây
Một số sản phẩm chứa cao lá sen: Chế phẩm Sen vông của xí nghiệp dƣợc
phẩm Trung ƣơng 2 chứa cao lá sen, cao lá Vông, lƣu hành tại thị trƣờng Việt
Nam và xuất khẩu; chế phẩm Sevona của xí nghiệp dƣợc phẩm Trung ƣơng 25
chứa cao lá sen và một số dƣợc liệu khác, lƣu hành tại Việt Nam và xuất khẩu
sang các thị trƣờng Nhật, Cuba, một số nƣớc Châu Âu; chế phẩm trà thuốc
Seivo của trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi và

ích mẫu; chế phẩm thuốc an thần Seroga của xí nghiệp dƣợc phẩm Trung ƣơng
25 chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi, cao táo nhân và cao thiên ma.
1.2 Hợp chất Nuciferin
1.2.1 Công thức, tính chất
- Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
2
.
- Khối lƣợng phân tử: 295,2.
- Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-
dimethoxy-6-methyldiabenzoquinolin (IUPAC)
[2,3]; hoặc 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-
tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin; 1,2-
dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-
dibenzo[de,g]quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6-
methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin
[12].

Hình 3. Công thức
cấu tạo của nuciferin
7

- Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu
vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl
3
, MeOH, EtOH nóng, hầu
nhƣ không tan trong nƣớc, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165

0
C, phổ UV (đo trong
MeOH) cho λ
max
tại bƣớc sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [2,3].
- Phổ
1
H-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 7,48 (3H, s, N-CH
3
), 6,40 (3H, s, C
1
-
OCH
3
), 6,16 (3H, s, C
2
-OCH
3
), 3,38 (1H, s, C
3
-H). 2,74 (3H, m, C
8
-H +
C
9
-H + C
10
-H). 1,60 (1H, d, C

11
-H) [3,11,12].
1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu
- Chiết xuất: Sủ dụng phƣơng pháp chiết nhƣ phần 1.2.2.1 thu đƣợc
alkaloid toàn phần.
- Phân lập và tinh chế: Sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại trong cồn nóng
thu đƣợc tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt.
1.2.3 Tác dụng dược lý.
1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid)
Trong những năm gần đây, tác dụng của các
alkaloid có nhân aporphin đang là chủ đề của rất
nhiều nghiên cứu bởi mối liên hệ với cấu trúc
nhân apomorphin cũng nhƣ là các tác dụng không
thể không thừa nhận của các bài thuốc y học cổ
truyền có chứa những alkaloid trên, chính vì thế
nhiều nghiên cứu về các aporphinoid đã đƣợc thực
hiện. Sau đây là một số tác dụng đƣợc lý chung
của các aporphinoid đã đƣợc tìm thấy:
- Tƣơng tác với các receptor thuộc hệ dẫn truyền thần kinh.
- Tác dụng gây co cơ.
- Ảnh hƣởng đến hoạt động của nhiều enzym.
- Tác dụng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do.
Hình 4. Công thức cấu
tạo nhân aporphin
8

- Ảnh hƣởng đến quá trình kết tập tiểu cầu.
- Hạ huyết áp và chống loạn nhịp tim.
- Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus.
- Gây độc tế bào và tác dụng chống khối u.

- Tác dụng miễn dịch.
- Tác dụng chống viêm và tác dụng vảo vệ tế bào.
- Tác động gây đột biến, gây độc cho gen và phá hủy cấu trúc nhiễm sắc
thể [22,39].
1.2.3.2 Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin
Với y học cổ truyền, ngƣời ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong
những bài thuốc khác nhau dung để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày
nay khoa học đã chứng minh đƣợc nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ
truyền có nguồn gốc từ các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính)
cũng nhƣ tìm ra nhiều tác dụng mới của sen.
- Tác dụng chống HIV: Với một số alkaloid đƣợc phân lập từ lá Nelumbo
nucifera ( Nymphaceae ), ngƣời ta đã chứng minh đƣợc tác dụng chống HIV
tốt thông qua các đánh giá các giá trị EC
50
và TI (chỉ số điêu trị). Nuciferin là
alkaloid chính trong lá và phôi của Nelumbo nucifera, đây là một alkaloid
aporphin, tác dụng chống HIV ở EC
50
là 0,8 µg/ml và TI là 36 [41].
- Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của
hạt Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in
vitro và in vivo. Tổng hàm lƣợng của các phenolic trong dịch chiết đƣợc tìm
thấy là 7,61 ± 0,04% ( kl/kl). Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng dọn gốc
tự do tốt thể hiện qua các giá trị IC
50
thu đƣợc. Tác dụng chống oxy hóa sử
dụng phƣơng pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) cho IC
50
có giá trị là
6,12 ± 0,41 µg/ml. Còn với phƣơng pháp sử dụng nitric oxid là 84,86 ± 3,56

µg/ml. Các giá trị IC
50
ở trên đều ít hơn so với giá trị IC
50
ở rutin trong thử tác
9

dụng chống oxy hóa với các phƣơng pháp tƣơng tự. Ngoài ra, ngƣời ta đánh
giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ , không thấy có dấu
hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lƣợng cơ thể. [37].
- Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid đƣợc chiết
đƣợc từ lá sen đã đƣợc thử nghiệm. Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã
đƣợc thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống
nấm. Tuy nuciferin không có tác dụng này, nhƣng ngƣời ta phát hiện ra một
mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có liên quan mật thiết với nhóm thế ở vị trí C1
và C2 trên vòng aporphin (hình 5). Đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu mới
với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [40].
- Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích
tiết insulin in vitro tốt hơn Glyburid. Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách
đóng các kênh K
+
- ATP , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đƣờng của
Nelumbo nucifera [27,28].
- Dịch chiết ethanol của sen có tác dụng chống béo phì ở ngƣời, đồng thời
có tác dụng chống béo phì và chống oxy hóa ở chuột đƣợc cho ăn một chế độ
giàu chất béo [19].
- Dịch chiết lá sen có đặc tính ức chế mạnh CYP2D6 in vitro (CYP2D6 là
một enzyme trong hệ thống Cytochrome P450 có liên quan đến chuyên hóa các
thuốc trong cơ thể). Kết quả cho thấy dịch chiết cồn ức chế mạnh mẽ CYP2D6
với giá trị IC

50
là 12,05 µg/mL và ức chế yếu các enzym khác . Ngoài ra, phần
alkaloid trong dịch chiết gây một tác dụng ức chế rõ rệt hơn về hoạt động
CYP2D6 với giá trị IC
50
là 0,96 µg/mL . Ba alkaloid aporphin phân lập từ hỗn
hợp alkaloid (nuciferin, nornuciferin, và 2-hydroxy-1-methoxyaporphin) ức
chế đáng kể CYP2D6 với giá trị IC
50
tƣơng ứng là 3,78 , 3,76 và 3,15 µM [32].
- Một nghiên cứu tổng quan vào năm 2007 trên ―Journal of Agricultural
Technology‖ đã chỉ ra rất nhiều tác dụng của sen theo y học cổ truyền nhƣ: lợi
10

tiểu, bài tiết mồ hôi, kháng nấm, hạ sốt, điều trị tiêu chảy, nôn mửa, bệnh
phong…. Lá đƣợc sử dụng nhƣ thuốc hiệu quả cho các chứng nôn ra máu ,
chảy máu cam , ho ra máu , tiểu máu và băng huyết cơ thể trong thời gian sốt
và viêm da… Ngoài ra, các tác dụng khác cũng đƣợc chứng minh bằng kỹ
thuật hiện đại nhƣ: Chống oxy hóa, chống ung thƣ, kháng virus, chống béo
phì,… [36].
Có thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid
với nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác
dụng tốt với nhiều bệnh mà hiện con ngƣời vẫn còn đang trong quá trình
nghiên cứu và chƣa tìm ra phƣơng pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid
trong sen có một giá trị tiềm năng lớn về mặt khoa học trong tƣơng lai.
1.2.3.3 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu ở sản phẩm
demethyl hóa
- Thành phần alkaloid từ nụ hoa và lá của hoa sen ( Nelumbo nucifera,
Nymphaeaceae) có khả năng ức chế hoạt động tạo melanin trong các tế bào
khối u ác tính B16: Dịch chiết methanol từ nụ hoa và lá của hoa sen (Nelumbo

nucifera, Nymphaeaceae) đã đƣợc chứng minh là có tác dụng ức chế hoạt động
tạo của khối u ác tính tế bào B16 4A5 ở chuột. Trong số các thành phần phân
lập đƣợc, nuciferin, N-methyl-asimilobin, lirinidin, và 2-hydroxy-1- methoxy-
6a, 7-dehydroaporphin đã cho thấy: Nuciferin và N-methyl-asimilobin ức chế
sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM, N- methyl-asimilobin
ức chế sự biểu hiện của TRP -1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế
sự biểu hiện của TRP- 2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [15].
11


5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin
- Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế
acetylcholinesterase và theo điều tra ban đầu thấy có một mối tƣơng quan giữa
cấu trúc và tác dụng: N-methyl-asimilobin (1), một cất ức chế mạnh
acetylcholinesterase (AChE), cùng với hai alkaloid aporphin có tác dụng kém
hơn là nuciferin (2) và nornuciferin (3) đƣợc tách ra từ Nelumbo nucifera. N-
methyl-asimilobin (1) ức chế 50% hoạt động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2
µg ml
-1
trong khi giá trị IC
50
tiêu chuẩn của Physostigmine là 0,013 ± 0,002
µg ml
-1
.[17].
1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp demethyl hóa
1.3.1 Phương pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether
A. Phương pháp thế ái nhân
a. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Kirschk và cộng sự
(1995)

Điều kiện phản ứng: Sử dụng LiI và quinolin ở nhiệu độ 140–180
o
C
trong 10–30 phút. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm demethyl hóa
với hiệu suất 65–88% [29,38].

Hình 6. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin
12

b. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Bernard và cộng sự
(1989)
Điều kiện phản ứng: Sử dụng tác nhân LiCl trong dung môi DMF, 4–72
giờ. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm demethyl hóa với hiệu suất
98% [8].

Hình 7. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF
B. Phương pháp acid-base Lewis
a. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Parker và cộng sự
(1981)
Điều kiện phản ứng: Sử dụng AlCl
3
trong CH
3
CN, phản ứng diễn ra
trong 3 giờ ở 0
o
C. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm monodemethyl
hóa với hiệu suất 75%. Sử dụng phƣơng pháp này có thể demethyl hóa chọn
lọc ở acetophenol [24,38].

Hình 8. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl
3
trong CH
3
CN
b. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Horie và cộng sự (1975)
Điều kiện phản ứng: Giống nhƣ phản ứng của Parker và đồng sự, ở đây
tác giả sử dụng AlBr
3
trong dung môi

CH
3
CN [18].
13


Hình 9. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr
3
trong CH
3
CN
C. Phương pháp base trên một acid Bronsted
a. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Li và cộng sự (2000)
Điều kiện phản ứng: phản ứng diễn ra trong môi trƣờng H
2
SO
4
ở nhiệt
độ 70

o
C trong 14 giờ. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm
monodemethyl hóa với hiệu suất 52% [31].

Hình 10. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng H
2
SO
4
b. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Guigen và cộng sự
(1993)
Điều kiện phản ứng: Sử dụng HBr 48% với xúc tác NaI ở nhiệt độ 90–
94
o
C, bình kín. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm demethyl hóa với
hiệu suất 90,2 % [16,38].
14


c. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Kawasaki và cộng sự
(1971)
Điều kiện phản ứng: phản ứng diễn ra trong môi trƣờng 48% HBr, AcOH,
đun hồi lƣu trong 30 phút. Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm
didemethyl hóa với hiệu suất 85%.[25,38]

Hình 12. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và AcOH
1.3.2 Các phƣơng pháp demethyl hóa nuciferin
Hình 11. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và NaI
15

a. Phƣơng pháp monodemethyl hóa nuciferin của Feutrill và cộng sự

(1970)





Hình 13. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF
Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và natri thioethoxide (lƣợng gấp 2,6-
2,7 số mol của nuciferin) vào dung môi DMF đun hồi lƣu (sục N
2
) ở nhiệt độ
100
o
C trong 3 giờ. Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản
phẩm monodemethyl nuciferin với hiệu suất khoảng 94-98% [14,26].
b. Phƣơng pháp didemethyl hóa nuciferin của Neumeyer và cộng sự
(1973)

Hình 14. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac
2
O
Tiến hành phản ứng: 4g Nuciferin, 6 ml HI 57% và 4,5 ml Ac
2
O đƣợc
làm nóng ở 140
o
C trong 30 phút. Kết thúc phản ứng: Xử lý thu đƣợc sản phẩm
didemethyl nuciferin (hiệu suất 82%) tinh thể hình kim không màu, t
o
nc

286
o
C
(C
17
H
17
NO
2
HI) [21,33].
c. Phƣơng pháp tridemethyl hóa nuciferin của Joseph và cộng sự (1975)
16


Tiến hành phản ứng: Nuciferin ( 0,48 g, 0,0015 mol) đƣợc làm nóng
trong 25 ml HBr 48% (sục khí trơ N
2
) ở nhiệt độ 120 – 125
o
C trong 3 giờ.
Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng bằng cách loại bỏ dung môi, hòa
tan vào cồn, tẩy màu bằng than hoạt, bay hơi hết dung môi. Sau đó kết tinh lại
trong n-Butanol-heptan, thu đƣợc sản phẩm tridemethyl nuciferin (hiệu suất
87%) có t
o
nc
222 – 224
o
C (C
16

H
18
BrNO
2
) [23].
1.4 Các phƣơng pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol
2-cloroethanol là một tác nhân alkyl hóa quan trọng, đặc biệt nhất là tác
nhân để tạo ra nhiều thuốc chống ung thƣ nhƣ Clorambucil, Melphalan,…
Một ví dụ quan trọng khác là Troxerutin – một hoạt chất có ý nghĩa quan
trọng trong điều trị suy tĩnh mạch mạn tính, là sản phẩm của quá trình O-alkyl
hóa rutin bằng tác nhân 2-cloroethanol.
Dƣới đây là một số phản ứng quan trọng có cơ chế tƣơng tự với phản
ứng O-alkyl hóa tạo dẫn chất của nuciferin:
1.4.1 Phương pháp sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi acetonitril

Cho vào bình cầu nguyên liệu, dung môi acetonitril. Thêm vào tác nhân
2-chloroethanol và xúc tác K
2
CO
3
. Đun hồi lƣu phản ứng trong 18 giờ.
Hình 15. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%
Hình 16. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K
2
CO
3

trong dung môi CH
3
CN