Bước đầu đánh giá đa dạng sinh học của loài gymnema SP ở việt nam thông qua chỉ thị hình thái và chỉ thị ADN

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGÔ THỊ VÂN
ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN
XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG
PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG
CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP
CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT
TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGÔ THỊ VÂN
ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN
XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG
PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG
CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP
CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT
TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn :
1. Ths. Lê Thị Thu Hương
2. TS. Bùi Quang Phúc
Nơi thực hiện :
Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét
Viện Sốt rét – Ký sinh trùng -Côn trùng Trung ương
HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính
trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS. Lê Thị Thu Hương (Bộ môn Vi sinh – Sinh học,

trường Đại học Dược Hà Nội) – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và cho tôi
những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy TS. Bùi Quang Phúc (Khoa Nghiên cứu
điều trị sốt rét, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương) cùng tập thể cán bộ trong
Khoa đặc biệt chị TS. Nguyễn Thị Minh Thu đã hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm và nghiên cứu hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, các
phòng ban và các bộ môn Trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo điều kiện trong 5 năm
học và hoàn thành tốt khóa học.
Cuối cùng, tôi xin gửi đến những người thân trong gia đình, bạn bè đặc biệt nhóm NNCC,
những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi lời cảm ơn sâu sắc trong suốt quá trình
học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Ngô Thị Vân
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM 3
1.1.1. Đặc điểm hình thái 3
1.1.2. Chu kỳ phát triển 4
1.1.2.1. Chu kỳ phát triển vô tính trong người 4
1.1.2.2. Chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi 5
1.2. TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5
1.2.1. Vài nét khái quát về bệnh sốt rét 5
1.2.2. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 6

1.2.2.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới 6
1.2.2.2. Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam 6
1.2.3. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium 7
1.2.3.1. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới 7
1.2.3.2. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam 8
1.3. ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT 9
1.3.1. Nguồn gốc, tính chất của artemisinin và dẫn xuất 9
1.3.1.1. Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất của artemisinin 9
1.3.1.2. Đặc điểm một số dẫn xuất của artemisinin 9
1.3.2. Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất 10
1.3.2.1. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất 10
1.3.2.2. Nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất 11
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33, 39c, 39d, 39e 12
1.4.1. Tình hình nghiên cứu, ưu điểm của các dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin 12
1.4.2. Cấu trúc, tính chất của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 12
1.4.2.1. Nghiên cứu tổng hợp 10-[(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) và
10-[(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33) 13
1.4.2.2. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl)
methyl) acetamide (39c), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10-
(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) 13
1.4.2.3. Tính chất của 5 dẫn xuất 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16
2.1.1. Chủng ký sinh trùng sốt rét 16
2.1.2. Động vật thí nghiệm 16
2.1.3. Thuốc và hóa chất nghiên cứu 16
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 17
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.3.1. Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng P.falciparum kháng

CHQ nuôi cấy 17
2.3.1.1. Nuôi cấy KSTSR P. falciparum liên tục trong phòng thí nghiệm 17
2.3.1.2. Thử nghiệm in vitro theo phương pháp thử thuốc 48 giờ 19
2.3.2. Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hoạt lực in vitro mạnh nhất 20
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23
3.1.1. Thử nghiệm hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 23
3.1.2. Thử nghiệm độc tính cấp của hợp chất 32 32
3.2. BÀN LUẬN 33
3.2.1. Kết quả thử hoạt lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 33
3.2.2. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp dẫn xuất 32 – chất có hiệu lực in vitro mạnh nhất 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
KẾT LUẬN 37
KIẾN NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng việt
32 10β-[2’β-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin
33 10β-[2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin
39c
10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl)
acetamide
39d
10β-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl)
acetamide
39e 10β-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide
AE Arteether
AM Artemether
ART Artemisinin
AS Artesunat

BN Bệnh nhân
BNSR Bệnh nhân sốt rét
CHQ Chloroquin
C
M
Nồng độ của các mẫu thử tính theo thể tích
DHA Dihydroartemisinin
DMSO Dimethyl sulfoxide
ĐVTN Động vật thực nghiệm
HC Hồng cầu
KST Ký sinh trùng
KSTSR Ký sinh trùng sốt rét
MĐKST Mật độ ký sinh trùng
P. falciparum Plasmodium falciparum
P. vivax Plasmodium vivax
RI, II, III Mức độ kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét
SKD Sinh khả dụng
SR Sốt rét
TCYTTG Tổ chức y tế thế giới
TLPT Trọng lượng phân tử
Tiếng anh
GHS
Globally Harmonised Classification System
for Chemical Substances and Mixtures
Hệ thống phân loại độc tính cấp
theo giá trị giới hạn LD
50
IC
50
Inhibitory Concentration 50%

Nồng độ ức chế 50% ký sinh
trùng phát triển
LD50 Lethal Dose 50
Liều chết 50% động vật thí
nghiệm
MIC Minimum Inhibitory Concentration
Nồng độ tối thiểu ức chế ký
sinh trùng phát triển
WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Biểu
đồ
Tên biểu đồ Trang
3.1 Tỉ lệ ức chế chủng P. falciparum K1 của chất 32 25
3.2 Giá trị IC
50
của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1 30
3.3 Giá trị MIC của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1 31
Hình Tên hình Trang
1.1 Công thức cấu tạo của ART 9
1.2 Sự biến đổi của dẫn xuất ART trong huyết tương 11
1.3 Qui trình tổng hợp các chất 32 và 33 13
1.4 Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) 14
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
1.1 Đặc trưng lý – hóa cơ bản của 5 dẫn xuất 15
3.1
Mật độ KST chủng P. falciparum kháng CHQ trong 10 ngày
trước khi thử thuốc
23

3.2
Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 32
24
3.3
Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 33
26
3.4
Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất
39c
27
3.5
Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất
39d
28
3.6
Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất
39e
29
3.7
Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của 5 dẫn xuất ở chủng K1
29
3.8
Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 dẫn xuất trên chủng
P.falciparum K1
31
3.9
Kết quả sau 7 ngày theo dõi chuột uống chất 32 ở nồng độ khác
nhau
32
3.10

Kết quả quan sát cân nặng và đại thể các cơ quan khi mổ toàn
bộ cả 13 lô chuột sau 7 ngày theo dõi
33
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Sốt rét (SR) là một bệnh lây theo đường máu, do ký sinh trùng (KST) Plasmodium
được truyền từ người bệnh sang người l
ành bởi muỗi thuộc giống
Anopheles
.
Y tế thế giới (WHO) năm 2012 còn 99 quốc gia sốt rét lưu hành nặng và số ca mắc sốt rét ước
tính chiếm 78% toàn cầu. Việt Nam là khu vực sốt rét lưu hành nặng, đặc biệt là khu vực trung
Nam bộ và đông Nam bộ. Trong những năm gần đây sốt rét đang tăng lên, chỉ trong năm 2011
đã có 15,6 triệu người nhiễm ký sinh trùng sốt rét và 10% trong đó bị tử vong [41].
Tình trạng xuất hiện và lan rộng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc đang đe dọa một số
chương trình phòng chống sốt rét, đặc biệt là ký sinh trùng Plasmodium falciparum đã kháng lại
cloroquin và các thuốc truyền thống khác. Từ năm 1990, thuốc artemisinin và dẫn chất artesunat
được tiến hành thử nghiệm lâm sàng và chính thức đưa vào sử dụng rộng rãi trong Chương trình
Quốc gia phòng chống sốt rét ở nước ta góp phần quan trọng trong trong việc hạ thấp tỷ lệ bệnh
và tỷ lệ tử vong do sốt rét. Tuy nhiên nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất là thời gian bán
thải ngắn và tỷ lệ tái phát cao [4]. Ngoài ra, theo báo cáo của WHO năm 2012 Plasmodium
falciparum đã kháng lại artemisinin ở nhiều khu vực như Đông Nam Á, Châu Phi đặc biệt là các
nước khu vực sông Mê-kông. Do đó, việc tìm ra thuốc điều trị mới có hiệu lực cao với
Plasmodium kháng thuốc là mục tiêu cấp bách của các nhà khoa học trên toàn thế giới [41].
Hiện nay, hướng nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất artemisinin đã cho nhiều kết quả tốt,
nổi bật là dẫn xuất mono hoặc dime của artemisinin có chứa liên kết 10-C-C bền vững. Đi từ
dihydroartemisinin và sản phẩm trung gian 10β-allyldeoxoartemisinin, các nhà khoa học của
Viện Hóa học lần đầu tiên đã sản xuất thành công 5 dẫn xuất của artemisinin là: 32, 33, 39c,
39d, 39e. Các hợp chất này bước đầu đã thể hiện hoạt tính chống sốt rét in vitro và in vivo vượt
trội so với artemisinin và arteether [36], [37].
Vì vậy, để góp phần đánh giá hiệu lực của các dẫn xuất artemisinin trên Plasmodium

falciparum chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin
trên chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin và thử độc tính cấp của dẫn xuất có
hiệu lực cao nhất trên động vật thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

Nghiên cứu hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất artemisinin 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng
Plasmodium falciparum kháng cloroquin.
 Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hiệu lực mạnh nhất trên động vật thực nghiệm.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Trên Trái Đất có tới 120 loài Plasmodium gây bệnh trên động vật nhưng chỉ có 4 loài gây
bệnh cho người: Plasmodium falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax),
Plasmodium ovale (P. ovale), Plasmodium malariae (P. malariae) [8], [10]. Cố định hồng cầu
(HC) trên phiến kính (lam kính) rồi nhuộm theo phương pháp Giemsa hay các phương pháp
tương tự (Wright, Field) để có thể quan sát và định loài ký sinh trùng sốt rét (KSTSR). Trên tiêu
bản thường thấy KSTSR gồm 2 thành phần chính là nguyên sinh chất bắt màu xanh và nhân bắt
màu đỏ, ngoài ra còn thấy các hạt sắc tố [8], [15]. Trong giai đoạn HC ở người, KSTSR có 3
dạng hình thể [8], [15]:
- Thể tư dưỡng (Trophozoite hay thể nhẫn): thể tư dưỡng non có hình nhẫn, đường kính khoảng
1/5 – 1/3 đường kính HC, gồm một nhân màu đỏ, tế bào chất màu xanh da trời và một không bào
to, chiếm phần lớn tế bào chất. Thể tư dưỡng già có hình dạng giống amip.
- Thể phân liệt (Schizonte): Nhân và tế bào chất đã phân chia. Thể phân liệt già, mỗi mảnh nhân
được một mảnh tế bào chất bao quanh (mảnh trùng/merozoite). Số lượng mảnh trùng tùy vào
loài Plasmmodium.
- Thể giao bào (Gametocyte): Là thể hữu tính, hình dạng khác nhau tùy theo loài.
* Hình thể của P. falciparum trên lam máu nhuộm theo phương pháp Giemsa [8], [15]:
- Thể tư dưỡng non: Nhẫn nhỏ có đường kính chỉ bằng 1/5 – 1/6 đường kính HC. Thể nhẫn
thường nằm ở rìa tế bào HC và hay gặp nhẫn có 2 nhân.
- Thể tư dưỡng già: Nguyên sinh chất dày hơn, nhân to ra, không bào biến mất và xuất hiện các
hạt sắc tố hình que, màu nâu ánh vàng, rải rác hoặc tập trung thành từng đám trên nguyên sinh

chất. Thể này ít thấy ở máu ngoại vi.
- Thể phân liệt: Nhân và nguyên sinh chất phân chia thành 8 – 32 mảnh. Khi chín muồi, mỗi
mảnh nhân có 1 vòng nguyên sinh chất bao quanh tạo thành 8 – 32 mảnh trùng. Rất hiếm thấy ở
máu ngoại vi, thường chỉ thấy ở thể SR nặng hoặc SR ác tính, bình thường chúng tập trung trong
máu mao mạch.
- Thể giao bào: Giao bào đực hình quả thận, đầu tròn, nguyên sinh chất có màu tím hoa cà, nhân
không có giới hạn rõ rệt. Những hạt sắc tố màu nâu, thô, ít, phân bố rải rác trong nguyên sinh
chất, xen kẽ có những hạt sắc tố màu đen. Giao bào cái hình quả chuối hay lưỡi liềm, nguyên
sinh chất có màu xanh da trời, nhân bắt màu đỏ tập trung ở giữa, xung quanh là những hạt sắc tố
màu đen [8], [15].
1.1.2. Chu kỳ phát triển
Chu kỳ của KSTSR gồm 2 giai đoạn phát triển rất phức tạp gồm 1 chu kỳ phát triển vô tính
trong người và 1 chu kỳ sinh sản hữu tính trong muỗi Anopheles.
1.1.2.1. Chu kỳ phát triển vô tính trong người
a) Giai đoạn tiền hồng cầu (Giai đoạn trong gan)
Khi muỗi đốt người, thoa trùng có trong tuyến nước bọt của muỗi SR thuộc giống
Anopheles truyền vào người, xâm nhập vào máu, chỉ tồn tại trong máu ngoại vi khoảng 30 phút.
Sau đó, một bộ phận (thoát khỏi tác động của miễn dịch tế bào) xâm nhập vào tế bào gan, phát
triển rồi phân chia thành thể phân liệt. Thể phân liệt phát triển đầy đủ sẽ phá vỡ tế bào gan, giải
phóng ra rất nhiều mảnh trùng của gan, các mảnh trùng này sẽ đi vào máu và ký sinh trong tế
bào HC [4], [8], [15].
Đối với P. falciparum và P. malariae: Tất cả các thoa trùng vào gan đều phát triển và trưởng
thành, phân chia thành các mảnh trùng rồi vào máu trong thời gian tương đối ngắn [8], [15].
Đối với P. vivax và P. ovale, ngoài sự phát triển tức thì của đa số thoa trùng, có một số thoa
trùng không phát triển ngay mà tạo thành thể ngủ ở lại tế bào gan, có thể sau 1, 2, 3 – 6 tháng
mới phát triển muộn hơn thành thể ẩn gây các cơn SR tái phát xa – giai đoạn ngoại HC [8], [15].
Thời gian hoàn thành giai đoạn tiền HC: P. falciparum là 5-7 ngày, P. malariae là 14-16
ngày, P. vivax là 7-8 ngày, P. ovale là 9-10 ngày [8], [15].
b) Giai đoạn phát triển trong hồng cầu (Giai đoạn trong máu)
Trong máu, các mảnh trùng được giải phóng từ tế bào gan sẽ xâm nhập vào HC, phát triển

1 chu kỳ sinh sản vô tính ở đó. Lần lượt ở thể tư dưỡng non, rồi phát triển thành thể tư dưỡng
già, sau đó nhân và nguyên sinh chất được phân chia ra làm nhiều mảnh để tạo thành thể phân
liệt. Thể phân liệt phát triển đầy đủ sẽ phá vỡ HC, giải phóng ra các mảnh trùng của HC. Hầu
hết các mảnh trùng này lại tiếp tục xâm nhập vào các HC bình thường mới để sinh sản vô tính
trong HC. Một số mảnh trùng biệt hóa thành thể hữu tính: các giao bào đực và giao bào cái. Nếu
không được muỗi truyền bệnh hút vào dạ dày, các giao bào này sẽ tự tiêu hủy trong máu [4], [8],
[15].
Thời gian để hoàn thành một chu kỳ của KSTSR trong HC khác nhau tùy loài KSTSR: P.
falciparum khoảng 48 giờ, gây sốt cách nhật hoặc sốt hàng ngày nếu nhiễm nhiều dòng khác
nhau; P. vivax và P. ovale khoảng 48 giờ, gây sốt cách nhật; P. malariae khoảng 72 giờ gây sốt
3 ngày một cơn [8], [15].
1.1.2.2. Chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi
Sau khi được muỗi Anopheles hút vào dạ dày, các giao bào đực và cái phát triển thành giao
tử. Giao tử đực và cái phối hợp với nhau tạo thành hợp tử rồi trứng di động. Trứng di động chui
qua thành dạ dày muỗi, phát triển trên mặt ngoài của thành dạ dày, tròn lại, to dần, phân chia
thành nhiều thoa trùng bên trong. Cuối cùng, thoa trùng được giải phóng, di chuyển về tuyến
nước bọt của muỗi, khi muỗi đốt người thoa trùng xâm nhập cơ thể người và bắt đầu chu kỳ sinh
sản vô tính trong người [4], [8], [15].
1.2. TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
1.2.1. Vài nét khái quát về bệnh sốt rét
Bệnh sốt rét là bệnh lây nhiễm do ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Plasmodium gây ra
[10].
Lâm sàng bệnh SR thường được phân ra làm hai loại là SR thể thông thường và SR ác tính.
Đồng thời còn có một số thể SR đặc biệt khác: SR ở trẻ em, SR ở phụ nữ có thai, SR bẩm sinh,
SR do truyền máu, SR mạn tính, SR nội tạng tiến triển [8]. Bệnh biểu hiện điển hình bằng những
cơn sốt rét với 3 triệu chứng cơ bản: rét run, sốt, ra mồ hôi [15]. Tần số và các mức độ các cơn
sốt rét tùy thuộc vào loài KSTSR, nhưng thông thường là 2-3 ngày. Khi đó các đợt ký sinh trùng
đồng thời nhân lên, hồng cầu bị phá hủy hoặc có thể kết dính vào nhau và với thành mạch máu
xuất hiện tử vong các tế bào này làm tắc nghẽn mạch máu cung cấp máu cho não (SR thể não)
và các tổ chức khác [10], [39].

1.2.2. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam
1.2.2.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới
Bệnh sốt rét có mặt, lưu hành rộng khắp ở vùng nhiệt đới, vùng cận nhiệt đới và các vùng
khí hậu ôn hòa [10]. Bệnh SR lan truyền ở vùng cận sa mạc Sahara, Châu Phi có mặt ở hầu hết
mọi nơi, đến các khu vực riêng biệt không đồng đều như Đông Nam Á, Ấn Độ, Trung và Nam
Mỹ [4].
Bệnh SR vẫn là gánh nặng sức khỏe toàn cầu với gần một nửa dân số trên thế giới có nguy
cơ mắc sốt rét, mỗi năm có khoảng 250 triệu ca mắc trong đó 1 triệu ca tử vong [28]. Trong đó
châu Phi chiếm 90% và được cho là khu vực có SR lưu hành nặng với gần 1 triệu trẻ em dưới 5
tuổi hàng năm chết do sốt rét đơn thuần hoặc phối hợp với các bệnh khác. Tính trung bình cứ
125 đứa trẻ chết trong 1 giờ và 2 đứa trẻ chết trong 1 phút [4]. Sau châu Phi, khu vực châu Á –
Thái Bình Dương là nơi bị ảnh hưởng nặng nề với 21 triệu người mắc sốt rét hàng năm [34]. Tại
các nước khu vực Đông Nam Á, mặc dù trong những năm gần đây, tỷ lệ mắc sốt rét xác định
trong khu vực đã giảm xấp xỉ 75% từ 2000 đến 2011 [41], nhưng bệnh SR vẫn đang lưu hành
với ở hầu hết các nước với 88% dân số trong tổng số 1320 triệu người sống trong khu vực [4].
1.2.2.2. Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam
Bệnh SR ở Việt Nam chủ yếu do P. falciparum gây ra (là loài thường gây SR ác tính)
chiếm 80-85%, P. vivax chiếm 15-20%, P. malariae chiếm 1-2% [23].
Việt Nam là quốc gia có khoảng 20% dân số sống trong vùng sốt rét lưu hành, do điều kiện
khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ và độ ẩm rất thích hợp cho bệnh sốt rét lưu hành ở nhiều địa
phương khu vực các tỉnh miền núi phía Bắc, các tỉnh ven biển miền Trung, khu vực Tây Nguyên
và Đông Nam Bộ [4], [17], [41].
Từ năm 1958, chương trình thanh toán sốt rét được thực hiện ở miền Bắc và mở rộng ra cả
nước năm 1976 đã thu được nhiều kết quả tốt. Nhưng cuối những năm 70 – 80 do thiếu nguồn
lực, di biến động dân cư, hậu quả chiến tranh và nhiều nguyên nhân khác nên bệnh sốt rét đã
quay trở lại và ngày càng nghiêm trọng. Năm 1991 Việt Nam chuyển sang chiến lược PCSR do
WHO đề xướng đã có kết quả nổi trội theo đánh giá giai đoạn 2001 – 2005 bệnh nhân sốt rét
(BNSR) giảm 69%, chết do sốt rét giảm 87% [2].
Theo báo cáo của WHO năm 2012 tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã giảm trên 75%, điều
này chứng tỏ bệnh SR đã được y tế và cộng đồng rất quan tâm đặc biệt ở vùng sâu, vùng xa,

vùng dân tộc thiểu số, nơi bà con còn chưa có nhiều kiến thức về bệnh SR [41].
1.2.3. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium
1.2.3.1. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới
Trong những năm gần đây, kháng thuốc đang là thách thức lớn trong phòng chống sốt rét
trên toàn cầu, đặc biệt là chủng Plasmodium falciparum được phát hiện từ đầu thế kỷ 20.
Năm 1910 P. falciparum được phát hiện kháng quinin đầu tiên ở Brazil và hiện đã kháng ở
nhiều vùng Đông Nam Á, Nam Mỹ, Châu Phi (Tanzania) [16], [40]. Năm 1949, P. falciparum
và P. malariae kháng proguanin được phát hiện ở Brazil và sau đó lan ra Kennya, Tanzania, Chi
Lê, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Peter, 1970) [16]. Năm 1957, trường hợp đầu tiên P.
falciparum kháng chloroquin (CHQ) phát hiện ở biên giới Colombia và Venezuela, tiếp sau đó
là Thái Lan (Harinasuta, 1961). Theo thống kê của WHO, tình trạng kháng CHQ đã lan rộng
khắp thế giới chiếm 75/95 quốc gia kháng thuốc, bên cạnh đó, hiện tượng kháng CHQ gấp 10
lần so với 50 năm trước [16], [20].
Ngoài ra, còn phát hiện thêm rất nhiều trường hợp P. falciparum kháng thuốc khác như
pyrimethamin, piperaquin (PQ), Fansidar…Đặc biệt hơn nữa là tình trạng P. falciparum kháng
lại artemisinin (ART) và dẫn xuất – thuốc có hiệu lực hàng đầu hiện nay. Trong đó là hiện tượng
kháng với ART xảy ra tại khu vực Đông Nam Á, đáng chú ý là vùng sông Mê Kông với 4 nước:
Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam [16], [20], [41].
Như vậy, hiện nay KSTSR đã kháng với hầu hết các loại thuốc SR ở rất nhiều nước trên
thế giới, đây là trở ngại rất lớn cho công tác phòng chống SR [16]. Vấn đề đặt ra hiện nay cho
toàn thế giới là tìm ra thuốc hoặc dẫn xuất có hiệu lực điều trị cao và không bị P. falciparum
kháng.
1.2.3.2. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam
Tình trạng P. falciparum kháng CHQ lần đầu tiên tại Việt Nam được ghi nhận ở Nha Trang
năm 1961, sau đó lan ra cả Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, miền Nam, như Tây Nguyên (1964),
Đồng Hới (1967), Quảng Trị (1973), công trường 7 Quảng Bình (1967), Bình Định (1968), Tây
Ninh (1964), Phan Thiết (1974) [11]. Hiện nay, xu hướng kháng CHQ đang tăng trở lại, nghiên
cứu tại Quảng Trị năm 1999 cho thấy P. falciparum có mức kháng RII với CHQ là 7,1%, tại
Quảng Trực, tỉnh Đăk Lăk tỷ lệ thất bại điều trị (RI, RII và RIII) của phác đồ CHQ là 48% [22],
đến năm 2008-2009 tỷ lệ kháng CHQ ở Quảng Trị là 75%, tại Đăknông lên đến 81% [7].

Fansidar ra đời năm 1964 và nhanh chóng bị kháng ở Việt Nam với tỷ lệ kháng cao trên 50% RI,
RII, RIII (1986 – 1994) [15].
Đặc biệt là đã xuất hiện tình trạng P. falciparum kháng lại artemisinin và dẫn xuất. Theo
nghiên cứu tại tỉnh Sông Bé và Gia Lai (1996) ART dùng với tổng liều 60 mg/kg trong 5 ngày
thì tỷ lệ tái phát là 16,7%, tại miền trung Tây Nguyên (1996) với liều dùng 1000 mg/kg trong 5
ngày thì tỷ lệ tái phát là 34,5%, kể cả với phác đồ phối hợp ART + mefloquin, ART +
tetracyclin thì tỷ lệ tái phát lần lượt là 6,42%; 14,4% [24], [29]. Hiệu lực điều trị artesunat với P.
falciparum tuy cao nhưng tỷ lệ thất bại muộn cần cân nhắc: tại Gia Lai (2001 – 2002) với liều
dùng ngày đầu 4 mg/kg, ngày 2-4 giảm xuống 2 mg/kg thì TLTBM là 46,7%; Bình Phước (Đăk
Nhau – Bù Đăng) (2009) với tổng liều 16 mg/kg trong 7 ngày thì TLTBM là 14,6% [6], [12].
Như vậy việc giám sát sử dụng thuốc và tìm ra hướng dùng thuốc mới là điều quan trọng
trong công cuộc chống lại KSTSR kháng thuốc hiện nay.
1.3. ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT
1.3.1. Nguồn gốc, tính chất của artemisinin và dẫn xuất
1.3.1.1. Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất của artemisinin
Artemisinin là một hoạt chất chống SR được chiết xuất từ cây Thanh hao hoa vàng với tên
khoa học là Artemisia annua L., họ cúc Arteraceae [21]. Năm 1971 được các nhà khoa học
Trung Quốc chiết xuất thành công và đưa vào sử dụng rộng rãi từ năm 1972, ở Việt Nam ART
bắt đầu đưa vào sử dụng điều trị cho khu vực có P. falciparum kháng thuốc từ năm 1991 [4].
ART có tinh thể hình kim, không màu, điểm chảy 156 - 157⁰C, công thức phân tử là
C
15
H
22
O
11
, trọng lượng phân tử (TLPT) là 282 và cấu tạo như ở hình 1.1 [3], [21], [31].
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART [21], [31].
ART là sesquiterpen lacton có cầu nối peroxid nội phân tử và hoạt tính chống SR chủ yếu
dựa vào cầu nối này [21], [31], [38]. Trong công thức trên vòng A là dạng cycloxan, vòng B là

vòng lacton, còn vòng C và D đều là dị vòng bão hòa trong đó vòng D là một trioxan, dạng liên
quan đến hoạt tính chống SR của ART [21].
ART ít tan trong nước và dầu, rất dễ bị thủy phân vòng lacton trong dung môi phân cực
[31], [38]. Do vậy sinh khả dụng (SKD) và độ bền vững của ART không cao, và đây cũng chính
là hạn chế của ART khi dùng [3].
1.3.1.2. Đặc điểm một số dẫn xuất của artemisinin
Với mục đích tăng cường khả năng hòa tan, tăng hoạt lực chống SR, đầu tiên năm 1976 các
nhà khoa học Trung Quốc đã tổng hợp thành công dihydroartemisinin (DHA) bằng cách khử hóa
nhóm CO lacton thành OH bán acetal với tác nhân khử hóa là natri borohydric [21]. Mặc dù
DHA có hoạt lực mạnh hơn gấp 2 lần ART nhưng nó vẫn ít tan trong nước, dầu nên DHA được
sử dụng như là 1 chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp các dẫn xuất khác [21].
Thông qua phản ứng ether hóa DHA, đã có các dẫn xuất mới ra đời và được ứng dụng
nhiều nhất là artemether (AM) và arteether (AE) TLPT lần lượt là 298 và 312, đặc tính lý hóa
tương tự ART, ưu điểm hơn ART là dễ tan trong dầu, dung môi hữu cơ như ethanol, aceton,
chloroform [31], [38].
Artesunat (AS) là sản phẩm của phản ứng ester hóa DHA, cải thiện được khả năng tan
trong nước của ART, được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á và Châu Phi để diệt ký
sinh trùng sốt rét P. falciparum [14].
Ngoài ra, còn nhiều phương pháp tổng hợp các dẫn xuất của ART từ DHA đang được
nghiên cứu hiện nay có khả năng mang lại nhiều hiệu quả cao [21].
1.3.2. Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất
1.3.2.1. Cơ chế tác dụng của Artemisinin và dẫn xuất
Qua nhiều nghiên cứu về cơ chế tác dụng từ khi chiết xuất thành công ART nhưng cơ chế
tác dụng của ART và dẫn xuất vẫn còn nhiều tranh cãi. Nó có thể là sự phối hợp nhiều cơ chế
như tác động lên màng, ức chế tổng hợp protein, gốc tự do hay oxy hoạt động… [21].
Theo kết quả của nhóm “nghiên cứu quinghaosu” Trung Quốc, ART tác động lên màng
của KSTSR là tác dụng chính. Đầu tiên là làm biến đổi cấu trúc màng, sau đó tạo ra các không
bào tự tiêu, cuối cùng làm tan rã bên trong KST [35].
Theo Gu H.M và cộng sự cho rằng DHA và AM có khả năng ức chế in vitro với tổng hợp
protein ở hồng cầu người nhiễm P. falciparum, trong đó ức chế tổng hợp acid nucleic xảy ra

chậm hơn tổng hợp protein [20]. Do đó có thể thấy tác dụng của thuốc không tập trung vào quá
trình tổng hợp acid nucleic và tác dụng chọn lọc của thuốc đối với hồng cầu bị nhiễm [21].
Theo Meshnick và cộng sự, sắt đóng vai trò quan trọng trong cầu nối peroxide nội và sự
tạo thành gốc tự do. ART và dẫn xuất sau khi vào máu tương tác với hemozoin (sản phẩm tiêu
hóa hemoglobin của KSTSR) sản sinh ra các gốc tự do có carbon trung tâm. Các gốc tự do này
gây tổn hại tế bào như peroxy hóa lipid, oxy hóa protein, alkyl hóa protein… và giết chết KST.
Tác dụng này rõ rệt nhất ở thể tư dưỡng của KSTSR. Mặc dù tác dụng diệt KST của ART bắt
đầu sau khi tiếp xúc chậm (4-5 giờ) hơn với CHQ nhưng tác dụng ức chế đạt tối đa rất nhanh
đặc biệt với P. falciparum kháng CHQ (do có hemozoin) [21], [30], [32], [33], [38].
1.3.2.2. Nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất
ART và các dẫn xuất có tác dụng nổi bật là cắt sốt nhanh, sạch thể vô tính của KSTSR
nhanh và kể cả thể giao bào [4], [20]. Nồng độ IC
50
của ART từ 10
-8
– 10
-7
mol/L (3 – 30 μg/L),
nồng độ thấp nhất ức chế là 3 x 10
-8
mol/L. Hoạt tính của DHA cao hơn ART từ 4 – 5 lần (IC
50
từ 0,36 – 7 nmol/L), dẫn xuất khác của ART đều có hoạt tính cao hơn ART như AS cao hơn 4 –
5 lần, AM và AE hơn khoảng 2 lần [38]. Đặc biệt ART và dẫn xuất có hiệu quả tốt trên KSTSR
kháng thuốc hoặc đa kháng thuốc [4], [38].
Nhưng do đặc điểm cấu tạo đặc biệt của ART và dẫn xuất như khả năng tan trong nước và
trong dầu kém, độ nhờn của thuốc cao, có chứa liên kết 10-hemiacetal dễ bị chuyển hóa thành
DHA dưới sự oxy hóa bởi men P-450 trong gan nên SKD của thuốc giảm và thuốc hấp thu chậm
[26], [37]. Ảnh hưởng của chuyển hóa khiến ART và dẫn xuất có thời gian bán thải ngắn, vì vậy
sau khi điều trị, bệnh nhân vẫn còn tỷ lệ tái phát lại ký sinh trùng và tỷ lệ tái phát cao hay thấp

tùy thuộc vào thời gian dùng thuốc ngắn hay dài (7 ngày tỷ lệ tái phát vẫn còn 10%) [4].
Hình 1.2. Sự biến đổi của dẫn xuất ART trong huyết tương [37].
Ngoài ra, theo nghiên cứu dược lý độc tính trên thần kinh của ART và dẫn xuất trên động
vật, hầu hết các dẫn xuất đều có độc tính, nhưng DHA (sản phẩm chuyển hóa của hầu hết các
ete) thì ảnh hưởng nặng nề trên thần kinh trung ương [20].
Như vậy, hiện nay hướng nghiên cứu của các dẫn xuất ART với mục đích khắc phục nhược
điểm của ART được phát triển theo 2 hướng: hướng thứ nhất là tạo ra các dẫn xuất mới đi từ
ART và DHA, hướng thứ 2 là phối hợp 1 dẫn xuất của ART với 1 thuốc SR khác có thời gian
bán thải dài hơn [20].
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33,
39c, 39d, 39e
1.4.1. Tình hình nghiên cứu, ưu điểm của các dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin
Tình hình kháng thuốc ngày càng gia tăng đã đòi hỏi một hướng điều trị hoặc thuốc điều trị
mới và việc tổng hợp các dẫn xuất mới của ART đã được các nhà khoa học trên thế giới quan
tâm nghiên cứu, đặc biệt là thay đổi cấu trúc lacton của DHA, tạo ra các dẫn xuất bền hơn và có
hoạt tính cao hơn. Ví dụ như các dẫn xuất fluoro–artemisinin, 11-aza-artemisinin [13].
Theo các nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất non-acetal của ART, gọi là 10-
deoxoartemisinin có độ bền vững 15-22 lần hơn các dẫn xuất acetal trong điều kiện mô phỏng
của dạ dày [27]. Bên cạnh đó dẫn xuất mới 10-deoxoartemisinin với dị vòng, amin và nhóm thân
nước đã thể hiện hoạt tính chống sốt rét in vitro cao hơn 10 – 25 lần so với ART [36].
Điều này cho thấy những hợp chất có bộ khung cơ bản của ART nhưng không chứa nhóm
chức lacton, acetal mà thay vào đó là các dẫn xuất chứa liên kết 10-C-C, chứa nitơ có khả năng
tan tốt trong nước và trong dầu, tiện lợi cho việc sử dụng nhờ khả năng tạo muối tan với acid
nhờ tính bazơ của nitơ đang là hướng đi mới và đúng đắn trong việc phòng chống sốt rét [37].
1.4.2. Cấu trúc, tính chất của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e
Theo hướng nghiên cứu trên Viện Hóa học đã nghiên cứu tổng hợp thành công 5 dẫn xuất
từ DHA và sản phẩm trung gian 10β-allyldeoxoartemisinin.
1.4.2.1. Nghiên cứu tổng hợp 10-[(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) và 10-
[(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33)
Qui trình tổng hợp đi từ DHA (9) qua 4 bước phản ứng (tạo 34, 35, 36) thu được các chất

32, 33 theo hình 1.3 [27], [36], [37].
Hình 1.3. Qui trình tổng hợp các chất 32 và 33 [27], [36], [37].
Chất phản ứng và điều kiện phản ứng :

Benzoyl chloride, pyridin, CH
2
Cl
2
, nhiệt độ phòng, 16h, 97%.

Allyltrimethylsilane, ZnCl
2
, ray phân tử, 1,2-dicloetan, 0⁰C, 1h, 90%.

m-CPBA, nhiệt độ phòng, 24h, CH
2
Cl
2
, 85%.

Imidazol, C
2
H
5
OH/H
2
O, nhiệt độ phòng, 20h.
1.4.2.2. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl)
methyl) acetamide (39c), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10-
(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) [37]

Từ hợp chất 35 được điều chế từ DHA ở trên qua 2 bước để tạo thành các dẫn xuất amid
theo hình 1.4 [37].
Hình 1.4. Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) [37].
Sau khi tổng hợp 5 dẫn xuất đều được đánh giá kết quả thông qua phổ cộng hưởng từ hạt
nhân
1
H – NMR để xác định lại cấu trúc hợp chất [37].
Vậy, tất cả dẫn xuất 32, 33, 39 (c, d, e) của ART là những hợp chất lần đầu tiên được
nghiên cứu và điều chế ở Việt Nam đã thỏa mãn các yêu cầu về tổng hợp và hóa học. Về mặt qui
trình tổng hợp, đảm bảo tính ổn định, các bước dễ thực hiện (nhiệt độ phòng, thời gian vừa phải,
hóa chất phổ biến), hiệu suất phản ứng cao và rất cao (85-97%). Về mặt hóa học các hợp chất
trên vừa có độ bền cao (liên kết 10-C-C) và khả năng tan tốt (tạo muối tan nhờ nitơ) [37].
1.4.2.3. Tính chất của 5 dẫn xuất
Cả 5 dẫn xuất đều tan tốt trong nước và trong dầu hơn ART như Dimethyl sulfoxide
(DMSO), đặc biệt các dẫn xuất 32, 33 tan tốt trong C
2
H
5
OH, còn các dẫn xuất 39c, 39d, 39e thì
tan tốt trong CH
2
Cl
2
[37]. Độ bền hóa học cao, bền vững hơn trong môi trường pH acid dạ dày
[27].
Một số chỉ số cơ bản về đặc tính lý, hóa cơ bản của 5 dẫn xuất được nêu chi tiết ở bảng 1.1
sau:
Bảng 1.1. Đặc trưng lý – hóa cơ bản của 5 dẫn xuất [37].
STT Tên hợp chất TLPT (gam/mol) Độ tinh khiết (%)
1 NT – 32 392 99

2 NT – 33 392 99
3 NT – 39c 416 95
4 NT – 39d 416 95
5 NT – 39e 429 95
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Chủng ký sinh trùng sốt rét
 KSTSR P. falciparum kháng chloroquin (K1) được cung cấp bởi Khoa Nghiên cứu điều trị
sốt rét, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương và được nuôi cấy liên tục trong
labô.
2.1.2. Động vật thí nghiệm
 130 con chuột nhắt trắng (Mus musculus L.), chủng Swiss, thuần chủng.
 Tiêu chuẩn: Trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 giống đực – cái (động vật cái phải không được
mang thai, chưa sinh sản lần nào), trọng lượng 202g, do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương
cung cấp.
2.1.3. Thuốc và hóa chất nghiên cứu
 Bột 5 dẫn xuất của ART 32, 33, 39c, 39d, 39e do Viện hóa học Việt Nam cung cấp:
 10-[2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32).
 10-[2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33).
 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c).
 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d).
 10-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e).
 Bột ART có độ tinh khiết cao do Viện kiểm nghiệm cung cấp.
 Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 (RP) của hãng Gibco (Hepes, glucoza, gentamicin,
NaHCO
3
5%), RPHS (môi trường RPMI, NaHCO
3
, huyết thanh người 10%).

 Hồng cầu và huyết thanh người nhóm O.
 Dịch treo 40% (4ml cặn HC lành + 6ml RPHS), dịch treo 4% (50μl dịch treo 40% + 450 μl
RPHS).
 Dung môi hòa tan: Dimethyl sulfoxide (DMSO) của hãng Sigma, bột gôm arabic 1%.
 Hóa chất khác: Ethanol, methanol tuyệt đối, Giemsa, dầu soi, đệm phosphate pH=6,8; dung
dịch acid picric 1%, nước cất, dung dịch chống đông herparin, sorbitol 27%, sorbitol 5%.
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
 Phiến nhựa 96 giếng vô trùng, bình nến (Desicator), tủ sấy, nồi hấp, tủ ấm.
 Bình đựng ni tơ lỏng
 Kính hiển vi, lam kính, pipet Dragendorff, pipet các loại.
 Cân điện tử, máy đo pH.
 Bộ dụng cụ pha thuốc: pipet Eppendorf, bộ chày cối, ống đong, cốc có mỏ, bình nón, đũa
thủy tinh.
 Bộ dụng cụ mổ chuột: bông, cồn 70, kéo, xylanh 1ml, kính lúp, panh…
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nuôi cấy KSTSR P. falciparum kháng CHQ liên tục trong phòng thí nghiệm để ổn định
chủng trước khi tiến hành thực nghiệm. Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c,
39d, 39e trên chủng P.falciparum kháng CHQ theo phương pháp thử 48 giờ của Nguyễn
Đình Phúc và chọn ra chất có hoạt tính chống SR mạnh nhất để thử độc tính cấp trên
động vật.
 Thử độc tính cấp của chất có hoạt tính in vitro cao nhất trên động vật thực nghiệm ở các
mức liều dùng khác nhau theo đường uống.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng P.falciparum
kháng CHQ nuôi cấy
2.3.1.1. Nuôi cấy KSTSR P. falciparum liên tục trong phòng thí nghiệm [5]
Chủng P. falciparum kháng CHQ (K1) được nuôi liên tục trong labô theo phương pháp
bình nến của Trager và Jensen, thực hiện trên nguyên tắc vô trùng trong thu thập mẫu và nuôi
cấy.

Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị
 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy đầy đủ (RPHS): Từ môi trường RPMI 1640 (RP) thêm
NaHCO
3
5% (42μl/ml), huyết thanh người nồng độ 10%. Bảo quản ở 4C trong vòng 1 tuần.
 Chuẩn bị huyết thanh: Máu không chống đông cho vào chai hoặc lọ thủy tinh, để lọ nằm
nghiêng ở nhiệt độ phòng 1 – 2 giờ sau đó để tủ lạnh 4C qua đêm, dùng pipet hút nhẹ nổi ở
trên chia vào lọ nhỏ theo yêu cầu công việc nếu có lẫn HC thì li tâm, bất hoạt huyết thanh ở
56C trong 30 phút, để nguội bảo quản ở tủ lạnh đá trong 30 ngày.
 Chuẩn bị HC lành: Máu tĩnh mạch có chứa chất chống đông sau khi li tâm 2 lần, hút bỏ phần
huyết thanh ở trên, thêm môi trường RP theo tỉ lệ 5:1, li tâm 2000 vòng/ 5 phút, hút bỏ phần
nổi, rửa 2 lần với môi trường RP và rửa lần 3 với môi trường đầy đủ huyết thanh 10%
(RPHS). Trộn cặn hồng cầu với môi trường RPHS để có dịch treo 40% (4:6). Chia nhỏ vào
lọ, bảo quản ở 4C trong 30 ngày.

Chuẩn bị HC nhiễm: Dùng panh kẹp lấy mẫu chứa 500μl máu có chủng P. falciparum K1
cần nuôi cấy trong bình nitơ lỏng, tan đông bằng tủ ấm trong 5 phút. Cho máu vào tube li
tâm, thêm đồng lượng sorbitol 27% (500l), li tâm 2000 vòng/5 phút. Hút phần trong ở trên,
trộn đều với 1000μl sorbitol 5%, li tâm 2000 vòng/5 phút (2 lần). Hút hết phần nổi ở trên,