Chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới hạn

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ HÀ

CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ
THANH CAO HOA VÀNG
BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ HÀ

CHIẾT XUẤT ARTEMISININ TỪ LÁ
THANH CAO HOA VÀNG
BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hân
2. ThS. Phạm Thị Hiền
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công Nghiệp Dược
2. Viện Công Nghệ Dược Phẩm
HÀ NỘI - 2014


LỜI CÁM ƠN

Khóa luận được thực hiện tại Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công
Nghệ Dược Phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội. Trong thời gian nỗ lực
nghiên cứu hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, ủng
hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy:
TS. Nguyễn Văn Hân – giảng viên Bộ môn Công Nghiêp Dược – Trường Đại
Học Dược Hà Nội đã hết lòng tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp tôi từng bước nâng
cao nhận thức và phương pháp luận; động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
ThS. Phạm Thị Hiền – Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia – Trường Đại
Học Dược Hà Nội đã chia sẻ, giải đáp những vướng mắc trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận.
Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia
đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học

Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học
tập tại trường.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè,
những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó
khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lê Thị Hà


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1 Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 2
1.1.1 Khái niệm 2
1.1.2 Thiết bị và nguyên tắc hoạt động 5
1.1.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu
tới hạn 7
1.1.4 Ứng dụng 8
1.2 Tổng quan về artemisinin 8
1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8
1.2.2 Tác dụng dược lý của artemisinin 9
1.3 Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất
artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng 9
1.3.1 Vị trí phân loại 9
1.3.2 Đặc điểm thực vật 10
1.3.3 Bộ phận dùng, phân bố 11
1.3.4 Thành phần hóa học 11
1.3.5 Tác dụng, công dụng 12

1.4 So sánh phương pháp chiết xuất artemisinin truyền thống với phương
pháp chiết xuất artemisinin bằng dung môi siêu tới hạn 12
1.4.1 Phương pháp chiết xuất truyền thống – sử dụng dung môi n-hexan 12
1.4.2 So sánh hai phương pháp chiết xuất artemisinin 13
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 14
2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 14


2.1.1 Nguyên liệu 14
2.1.2 Hóa chất 14
2.1.3 Máy móc, thiết bị 14
2.2 Phương pháp nghiên cứu 15
2.2.1 Phương pháp định lượng 15
2.2.2 Phương pháp chiết xuất bằng cacbon dioxid siêu tới hạn 16
2.2.3 Phương pháp tinh chế 17
2.3 Nội dung nghiên cứu 17
2.3.1 Lựa chọn đồng dung môi chiết xuất 17
2.3.2 Áp suất chiết xuất 18
2.3.3 Nhiệt độ chiết xuất 19
2.3.4 Thời gian chiết xuất 19
2.3.5 Tinh chế dịch chiết 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21
3.1 Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng 21
3.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất 22
3.2.1 Lựa chọn đồng dung môi 22
3.2.2 Áp suất chiết xuất 24
3.2.3 Nhiệt độ chiết xuất 26
3.2.4 Thời gian chiết xuất 27
3.3 Tinh chế dịch chiết 28

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 31
4.1 Về khảo sát ảnh hưởng các thông số tới quá trình chiết xuất 31
4.2 Về quy trình tinh chế dịch chiết 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT
Chữ viết tắt
Giải thích
1
P
c

Áp suất tới hạn
2
T
c

Nhiệt độ tới hạn
3
K
c

Điểm tới hạn (P
c
,T
c

)
4
T
t
Điểm ba
5
sCO
2
cacbon dioxid siêu tới hạn
6
DĐVN
Dược Điển Việt Nam
7
HL
Hàm lượng
8
STT
Số thứ tự




DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Danh mục các bảng
Trang
1
Bảng 1.1 Điểm tới hạn của một số dung môi
4
2

Bảng 1.2 So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và
siêu tới hạn
4
3
Bảng 1.3 Một số nghiên cứu chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
8
4
Bảng 1.4 Vị trí phân loại của cây thanh cao hoa vàng (Artemisia
annua L.)
10
5
Bảng 1.5 Hiệu suất chiết xuất artemisinin, thời gian chiết xuất, chi
phí vận hành, chi phí đầu tư
13
6
Bảng 2.1 Tên, tiêu chuẩn và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong
thí nghiệm
14
7
Bảng 3.1 Kết quả đo quang của dung dịch artemisinin
21
8
Bảng 3.2 Hiệu suất chiết xuất artemisinin trong 100g dược liệu với
các đồng dung môi khác nhau
23
9
Bảng 3.3 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và
hiệu suất của quá trình tinh chế dịch chiết
30

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
STT
Danh mục các hình ảnh, đồ thị
Trang
1
Hình 1.1 Giản đồ pha của cacbon dioxid
2
2
Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành pha siêu tới hạn của CO
2
3
3
Hình 1.3 Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
5
4
Hình 1.4 Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp)
7
5
Hình 1.5 Lá và cành của cây thanh cao hoa vàng
10
6
Hình 1.6 Các công thức của thành phần hóa học có trong cây thanh
cao hoa vàng
12
7
Hình 3.1 Bản mỏng sau khi cạo vết artemisinin
21
8
Hình 3.2 Dịch chiết artemisinin thu được khi sử dụng đồng dung

môi n-hexan (200bar, 50
o
C)
22
9
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng
sCO
2
kết hợp với các đồng dung môi khác nhau
23
10
Hình 3.4 Dịch chấm sắc kí của dược liệu được chiết xuất bằng sCO
2

kết hợp n-hexan ở các áp suất chiết xuất khác nhau
24
11
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng
sCO
2
kết hợp với n-hexan dưới các áp suất khác nhau
25
12
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng
sCO
2
kết hợp với n-hexan ở các nhiệt độ khác nhau
27
13
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng

sCO
2
kết hợp với n-hexan theo thời gian
28
14
Hình 3.8 Các giai đoạn tinh chế dịch chiết artemisinin từ lá thanh
cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới hạn
29
15
Hình 3.9 Sản phẩm thô (trên) và sau tinh chế (dưới) của artemisinin
29

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc dùng dung môi hữu cơ để chiết xuất dược liệu ngày càng chứng tỏ có
nhiều nhược điểm: độc hại, dễ cháy nổ và ô nhiễm môi trường. Hơn nữa, giá thành
cao của dung môi hữu cơ, những qui định ngày càng nghiêm ngặt về môi trường và
yêu cầu ngày càng tăng về mức độ sạch của sản phẩm đòi hỏi phải phát triển một kỹ
thuật mới trong chiết xuất dược liệu.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu ban đầu về việc sử dụng sCO
2
để tách một số
chất đã được tiến hành tại Viện Công Nghệ Hóa Học, Viện Dược Liệu [8], [10],
[12]. Tuy nhiên công nghệ chiết xuất bằng sCO
2
cũng như thiết bị vận hành vẫn còn
mới mẻ, cần được đi sâu vào nghiên cứu.
Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần thiết cho việc
sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường. Đặt nền móng cho nghiên cứu chiết

các chất bằng sCO
2
ở Việt Nam với mục đích góp phần nghiên cứu phương pháp
chiết xuất mới, đề tài “Chiết xuất artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng bằng
dung môi siêu tới hạn” được thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới
hạn.
2. Khảo sát ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất
artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới hạn.



2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
1.1.1 Khái niệm
Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là quá trình chiết rắn – khí trong đó
dung môi là chất khí ở điều kiện siêu tới hạn. Độ nhớt thấp và sức căng bề mặt gần
như bằng không, cho phép dung môi siêu tới hạn thấm vào dược liệu sâu hơn và
nhanh hơn so với dung môi lỏng. Hơn nữa việc loại dung môi khí ra khỏi chất chiết
cũng đơn giản hơn so với dung môi lỏng.
Giản đồ pha của một chất
Hình 1.1 là giản đồ pha của 1 chất tinh khiết theo áp suất (P) và nhiệt độ (T)
ở dạng tổng quát.
Trong đó các pha rắn, lỏng và khí được phân cách nhau bởi đường thăng hoa,
đường áp suất nóng chảy và đường áp suất hơi. Cả 3 cùng cắt nhau tại “điểm ba”
(T
t
). Tại đó ba pha cùng tồn tại, nghĩa là cũng tồn tại ba thể tích mol khác nhau.

Hình 1.1 Giản đồ pha của cacbon dioxid
Đường áp suất hơi bắt đầu từ điểm ba và kết thúc tại điểm giới hạn K
c
. Khi
đường áp suất hơi dịch chuyển về phía K
c
, tỉ trọng pha lỏng giảm dần, tỉ trọng pha
khí tăng dần và đạt tới cùng một giá trị tại điểm tới hạn, tức là chỉ còn lại 1 pha duy
nhất, gọi là pha siêu tới hạn. Vùng siêu tới hạn bắt đầu từ điểm tới hạn K
c
, tiếp giáp
bởi pha lỏng và pha khí, và ở áp suất rất cao, nó tiếp giáp với pha rắn [1].
3





Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành pha siêu tới hạn của CO
2
Trong đó giai đoạn:
1. Ranh giới giữa 2 pha lỏng - khí dễ dàng quan sát.
2. Khi gia tăng nhiệt độ ranh giới giữa hai pha bắt đầu mờ đi nhưng vẫn dễ
dàng quan sát được.
3. Tiếp tục gia tăng nhiệt độ tỷ trọng chất khí và chất lỏng sẽ gần nhau hơn,
ranh giới phân cách hai pha vẫn còn nhưng khó quan sát.
4. Khi đạt được áp suất tới hạn, nhiệt độ tới hạn thì không còn sự phân cách
giữa hai pha, ranh giới giữa hai pha cũng không tồn tại. Hình thành một pha
đồng nhất gọi là pha siêu tới hạn.

Tính chất của dung môi siêu tới hạn
Ở trạng thái siêu tới hạn: Tỉ trọng của dung môi thay đổi theo áp suất và nhiệt độ.
 Tỉ trọng càng nhỏ nó càng giống với một chất khí, tỉ trọng càng tăng nó càng
giống với một chất lỏng.
 Ở nhiệt độ hằng định, tỉ trọng dung môi tăng mạnh theo áp suất, các phần tử
dung môi bị nén lại gần nhau hơn và khả năng hòa tan tăng lên.
 Các tính chất khác ví dụ độ nhớt, hằng số điện môi cũng thay đổi theo áp
suất và nhiệt độ.


4

Bảng 1.1 Điểm tới hạn của một số dung môi [1]
Dung môi
Phân tử lượng
(g/mol)
Nhiệt độ tới hạn
(
o
C)
Áp suất tới
hạn(bar)
Tỉ trọng
(g/cm
3
)
Cacbon dioxid
44,01
31,04
73,83

0,469
Nước
18,02
374,20
221,20
0,348
Methanol
32,04
512,60
61,40
0,276
Ethanol
46,07
513,90
61,40
0,276
Methan
16,04
-82,49
46,40
0,162
Aceton
58,08
508,1
46,4
0,278
Trong lĩnh vực chiết xuất, dung môi siêu tới hạn được coi là những dung môi
“lai” với các tính chất trung gian của chất khí và chất lỏng, một dung môi có độ
nhớt thấp, tốc độ khuếch tán cao và hầu như không có sức căng bề mặt.
Bảng 1.2 So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn

Đặc tính vật lí
Khí
Siêu tới hạn
Lỏng
Tỷ trọng ρ (kg.m
-3
)
0,6 – 2
200 - 500
600 - 1600
Độ nhớt động lực học µ(mPa.s)
0,01 - 0,3
0,01 - 0,03
0,2 - 3
Độ nhớt động học η
a
(10
6
m
2
.s
-1
)
5 – 500
0,2 - 0,1
0,1 - 5
Hệ số dẫn nhiệt λ (W/mK)
0,01 - 0,025
Maximum
b

0,1-0,2
Hệ số khuếch tán D (10
6
m
2
s
-1
)
10 – 40
0,07
0,0002 - 0,002
Sức căng bề mặt σ (dyn/cm
2
)
-
-
20 - 40
Trong đó:
a
Độ nhớt động học được tính bằng công thức: η = µ/ ρ
b
Hệ số dẫn nhiệt lớn nhất trong vùng siêu tới hạn, giá trị còn phụ thuộc vào
nhiệt độ [15].
Những đặc tính này thay đổi trong một giới hạn rộng khi thay đổi áp suất,
nhất là xung quanh điểm tới hạn, làm cho dung môi siêu tới hạn có tính linh hoạt
5

cao. Như vậy dung môi siêu tới hạn vừa có khả năng hòa tan tốt (giống chất lỏng),
vừa có tốc độ khuếch tán cao (giống chất khí).
Phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn có ưu điểm là tiến hành

ở nhiệt độ thấp. Do vậy chỉ có những dung môi có nhiệt độ tới hạn thấp và áp suất
tới hạn không quá cao (để có thể dễ dàng đạt được) là thích hợp cho mục đích chiết
xuất. Một số dung môi thích hợp được nêu ở bảng 1.1. Trong đó có cacbon dioxid
và nước là những dung môi thông dụng nhất.
1.1.2 Thiết bị và nguyên tắc hoạt động
Quá trình chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn được thực hiện trong điều
kiện thay đổi áp suất và nhiệt độ. Thiết bị chiết xuất phải được trang bị bộ phận điều
chỉnh áp suất và nhiệt độ ở cả bình chiết và bình tách.















Hình 1.3 Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
Hệ thống gồm một nguồn cung cấp CO
2
, một máy bơm, một bộ làm lạnh,
một bộ tăng nhiệt, bình chiết chứa dược liệu, bình tách thu sản phẩm và bình ngưng
tụ.

Bình chứa
CO
2

Bình
tách

Bình
chiết
Làm
lạnh
Bơm
Làm
nóng

Điều
chỉnh
P, t
0
C
Bình ngưng tụ
(CO
2
lỏng)
6

Nguyên tắc hoạt động:
- CO
2
đi từ bình chứa qua bộ phận làm lạnh đến dưới nhiệt độ ngưng tụ để loại

bọt khí trước khi tới bơm.
- Dung môi nén được làm nóng đến nhiệt độ chiết xuất (cao hơn nhiệt độ tới
hạn) trước khi đi vào bình chiết chứa sẵn dược liệu.
- Bình chiết cũng được làm nóng để duy trì trạng thái siêu tới hạn của dung
môi.
- Dung môi chảy qua khối dược liệu cố định và hòa tan chất tan.
- Sau đó dung môi qua khỏi bình chiết từ phía trên, qua một van tiết lưu vào
bình tách.
- Khi áp suất giảm khả năng hòa tan của dung môi giảm và chất chiết được
tách ra. Để thu được hoàn toàn chất chiết, dung môi được làm nóng đến nhiệt
độ cao hơn nhiệt độ bão hòa để đạt tới trạng thái khí (vì khả năng hòa tan của
chất khí là không đáng kể).
- Chất chiết được rút qua van ở đáy bình tách.
- Dung môi dạng khí được tách ra rồi quay trở lại máy nén để lặp lại chu kì
chiết tiếp theo.
- Hệ thống có thể chứa nhiều bình chiết, nhiều bình tách với các áp suất tách
khác nhau.
Một số lưu ý:
 Xử lí mẫu chiết: Trong vài trường hợp đặc biệt, mẫu cần chiết có thể được
điều chỉnh pH, hoặc thêm dung môi hoặc làm thấm ướt. Nếu hợp chất có tính
phân cực, một lượng nhỏ nước được thêm vào để làm thấm ướt mẫu cần
chiết giúp việc chiết xuất thêm dễ dàng. Nếu hợp chất chiết có tính không
phân cực, một lượng dầu nhỏ hoặc chất béo trộn thêm vào mẫu chiết.
 Chất cho thêm (modifier): CO
2
chỉ phù hợp để chiết xuất các hợp chất có độ
phân cực kém cho đến trung bình. Nếu muốn chiết xuất các chất có tính phân
cực cao, cần bổ sung thêm methanol, ethanol hoặc methylen clorid.
 Thể tích áp dụng: vài ml cho tới hàng nghìn lít. Có loại thiết bị cấu tạo bộ
phận nhận mẫu rời, có loại cấu tạo với bộ phận nhận mẫu được nối trực tiếp

với máy sắc ký khí hoặc HPLC để khảo sát ngay sản phẩm vừa thu nhận [1].
7


Hình 1.4 Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp)
1.1.3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu
tới hạn.
Ưu điểm
- Độ nhớt thấp, khả năng khuếch tán tốt, khả năng hòa tan cao; áp suất hơi cao,
điểm siêu tới hạn của CO
2
dễ đạt. CO
2
(khi được dùng) là dung môi chiết rẻ
tiền, không độc hại và không ô nhiễm.
- Chất chiết ít bị tác động bởi nhiệt, quá trình chiết nhanh.
- Khả năng hoà tan và tính chọn lọc của dung môi có thể điều chỉnh được bằng
cách thay đổi áp suất và nhiệt độ.
- Dễ dàng tách hoàn toàn dung môi ra khỏi các chất chiết. Không cần giai
đoạn cất loại dung môi.
Nhược điểm
- Làm việc ở điều kiện áp suất cao, không thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng.
- Thiết bị chuyên dụng, đắt tiền.
- Chiết xuất mẫu mới: cần có nhiều nghiên cứu tìm các thông số tối ưu để
chiết xuất thành công [1].
8

1.1.4 Ứng dụng
Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn đã được nghiên cứu áp dụng ở qui mô
công nghiệp với 2 mục đích [1]:

 Chiết lấy hoạt chất từ dược liệu. Ví dụ chiết xuất thebain từ Papaver
bracteatum, chiết xuất cyclosporin từ nấm Beauvaria nivea, chiết xuất các
alcaloid, tinh dầu, polyphenol, flavonoid… từ nhiều loại cây.
 Tách loại các thành phần không mong muốn khỏi sản phẩm. Ví dụ tách
cafein từ cà phê, loại alcol từ đồ uống…
Bảng 1.3 Một số nghiên cứu chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
Đối tượng
Tác giả
Điều kiện chiết xuất
Hiệu suất
Concret từ cây dó
bầu
Nhiều tác giả,
2008 [10]


Tinh dầu tiêu
Nhiều tác giả,
2007 [12].


Phospholipid từ
lòng đỏ trứng vịt
Viện hóa học,
2010
368 bar, 51
o
C, 10%
ethanol [8].
11,6%

1.2 Tổng quan về artemisinin
1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa
Artemisinin có công thức hóa học và tính chất cụ thể như sau:


Công thức cấu tạo:


9


Công thức phân tử:
C
15
H
22
O
5

Khối lượng phân tử:
282,33
Tên khoa học:
(3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-Octahydro-3,6,9-trimethyl-
3,12-epoxy-12H-pyrano [4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-
on
Tính chất:

Artemisinin là tinh thể hình kim không màu hoặc bột kết
tinh trắng, tan nhiều trong ethanol, aceton, cloroform, ethyl
acetat, ít tan trong n-hexan, benzen, toluen và hầu như

không tan trong nước, nó dễ bị thủy phân và phân hủy trong
các dung môi phân cưc ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên,
artemisinin khá bền vững trong các dung môi không phân
cực.
Nhiệt độ nóng chảy:
156 – 157°C
Năng suất quay cực:
[ ]
D
17
= +66,3 [6].
1.2.2 Tác dụng dược lý của artemisinin
Đến hiện nay, artemisinin vẫn được dùng để điều trị sốt rét do có khả năng
diệt thể phân liệt trong máu của mọi ký sinh trùng sốt rét đặc biệt tốt với sốt rét thể
não do chủng Plasmodium falciparum gây ra kể cả khi đã kháng cloroquin.
Artemisinin có tác dụng diệt giao bào, có tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu và
cả ở thể ngủ, thời gian tác dụng ngắn [5].
Ngoài việc dùng artemisinin để điều trị sốt rét, artemisinin đang được nghiên
cứu sử dụng trong điều trị ung thư [14].
1.3 Tổng quan về cây thanh cao hoa vàng và một số phương pháp chiết xuất
artemisinin từ lá cây thanh cao hoa vàng
1.3.1 Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây thanh cao hoa vàng
(Artemisia annua L.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới [7]:
10

Bảng 1.4 Vị trí phân loại của cây thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.)
Bộ
Cúc (Asterales)
Họ

Cúc (Asteraceae)
Chi
Ngải (Artemisia)
Loài
Artemisia annua L.
Ngoài ra
Tên đồng nghĩa:
Artemisia stewartii Clarke, A. wade Edgew
Tên khác:
Thanh hao, thảo cao, ngải hoa vàng, ngải si, ngải hôi,
ngải mèo, hoàng hoa cao, nhả ngài bầu sláy (Tày).
Tên nước ngoài:
Amoise chinoise (Pháp)
Các thầy thuốc Trung Quốc đã sử dụng nước sắc của cây thanh cao hoa vàng
để điều trị sốt. Ở Việt Nam, vào thế kỷ XIV, Tuệ Tĩnh cũng đã dùng thanh cao hoa
vàng trong điều trị và đến những năm 1990 bắt đầu được nghiên cứu về thành phần
hóa học và phương pháp chiết xuất [11].
1.3.2 Đặc điểm thực vật
Cây thảo mọc đứng, sống hàng năm,
phân nhiều cành. Thân hình trụ có rãnh
dọc, màu lục hoặc hơi tím, cao 0,5-2,0
m. Lá kép mọc so le, lá ở giữa thân
thường xẻ 3 lần lông chim thành những
thùy nhỏ và sâu, lá ở giữa ngọn lúc cây
sắp ra hoa thường hẹp, xẻ 1 – 2 lần lông
chim, mặt trên có lông lục nhạt, cả hai
mặt đều có lông nhỏ mịn [9], [11].

Hình 1.5 Lá và cành của cây thanh cao
hoa vàng

Cụm hoa hình đầu, cuống rất ngắn, đường kính 1,5 cm, các đầu tụ họp thành chùy ở
ngọn thân và đầu cành, tổng bao gồm các lá bắc hình sợi chỉ thuôn không lông, xếp
thành 2 – 3 hàng, hoa màu vàng, dạng ống, dài không quá 1mm, phía ngoài là hoa
cái, bên trong là hoa lưỡng tính, tràng của hoa cái có tuyến ở trong ống, ống tràng
11

hơi loe ở đỉnh, rồi chia thành 4 thùy nhọn, vòi nhụy xẻ; tràng của hoa lưỡng tính
rộng và xẻ thành 5 thùy; nhị 5, bao phấn ngắn .
Quả bế, hình trái xoan hoặc hình trứng ngược, có vân dọc, dài 0,4 – 0,5mm,
có tinh dầu. Toàn thân và lá vò ra có mùi thơm đặc biệt.
Mùa hoa quả vào tháng 9 – 11 [11].
1.3.3 Bộ phận dùng, phân bố
Bộ phận dùng: lá được phơi khô.
Phân bố:
Trên thế giới: rải rác ở vùng ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới Bắc bán
cầu, bao gồm một số nước ở Đông Âu, Bắc Mỹ, Tây –Nam Á và Đông Á.
Việt Nam: mọc tự nhiên ở bốn tỉnh (Lạng Sơn, Cao Bằng, Quang Ninh, Bắc
Giang). Được trồng ở các tỉnh trung du và đồng bằng Bắc Bộ như Vĩnh Phúc, Phú
Thọ (Thanh Sơn), Tuyên Quang, Bắc Ninh,… [9], [11].
1.3.4 Thành phần hóa học
Thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng phần trên mặt đất chứa
artemisinin (thành pần chính), acid artemisinic, artenuin (quinghaosu I), artenuin B
(quinghaosu II), desoxyartemisinin (quinghaosu III), quinghaosu IV, artenuin E
(quinghaosu V), artemisininlacton (artenuin F), artemisiten (dehydroartemisinin),
artemisinic acid methyl ester. Ngoài ra cây thanh cao hoa vàng còn chứa lipid
flavonoid, coumarin, polyacetylen, tinh dầu sterol. Hàm lượng artemisinin trong lá
cây thanh cao hoa vàng đạt từ 0,01% đến 0,9% [11].
Một số thành phần chính có trong cây thanh cao hoa vàng ngoài artemisinin
[11]:
O

H
H
H
CH
3
CH
2
O
O
CH
3
O
O

H
H
H
CH
3
CH
3
O
O
O
CH
3

HO
2
C

CH
2
H
H
CH
3
H
3
C


Artemisiten
Desoxyartemisinin
(Qinghaosu III)
Acid artemisinic
12

HO
2
C
CH
2
H
H
CH
3
H
3
C
O

H
2
C
COOCH
3
H
H
CH
3
H
3
C
H
CH
3
O
CH
2
O
OH
H
3
C

H
CH
3
H
O
O

H
3
C



CH
3
H
O
O
H
H
3
C
CH
2
O

O
OH
3
C
O
O
O
H
CH
3
H

CH
3

O
O
O
H
H
CH
3
O
CH
3
H
3
C



Hình 1.6 Các công thức của thành phần hóa học có trong cây thanh cao hoa vàng
1.3.5 Tác dụng, công dụng
Thanh cao hoa vàng có vị đắng (khổ), tính hàn(lạnh); vào hai kinh can, đởm.
Tác dụng: Thanh nhiệt, sát khuẩn, có tác dụng cắt cơn sốt rét.
Công dụng:
Chữa bệnh ra mồ hôi trộm, hâm hấp sốt lâu ngày (lao nhiệt), mồ hôi không
thoát ra được, sốt rét. Bệnh đái ra máu, mũi chảy máu, kích thích tiêu hóa, chữa
phong thấp, nhức mỏi cơ thể và trí não uể oải. Dùng ngoài da có tính chất sát trùng,
chữa mụn nhọt lở ngứa. Trong y học hiện đại, thanh cao hoa vàng là nguồn nguyên
liệu để chiết xuất artemisinin dùng trong điều trị sốt rét [9], [11].
1.4 So sánh phương pháp chiết xuất artemisinin truyền thống với phương pháp

chiết xuất artemisinin bằng dung môi siêu tới hạn
1.4.1 Phương pháp chiết xuất truyền thống – sử dụng dung môi n-hexan
Dược liệu được xử lí, tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/5, 30 – 50°C, 3 giờ. Chiết
3 lần, dịch chiết lần 3 sử dụng làm dung môi chiết lần 1 của mẻ khác.
Acid
epoxyartemisinic
Acid artemisinic
methylester
Arteannuin E
Arteannuin E
Artemisinin G
Qinghaosu
IV

Arteannuin C
13

Tạo kết tủa thô artemisinin và loại sáp. Artemisinin thô đã loại hết sáp được
hòa tan trong cồn sôi, thêm than hoạt và đun sôi với sinh hàn hồi lưu, lọc nóng loại
than hoạt và để kết tinh ở nhiệt độ thường, tối thiểu 24 giờ. Vẩy ly tâm rửa tinh thể
bằng cồn và sấy ở 80°C [2], [3].
1.4.2 So sánh hai phương pháp chiết xuất artemisinin
Dựa trên dữ liệu đã nghiên cứu được, các nhà nghiên cứu có thể so sánh về
hiệu suất chiết xuất, thời gian chiết xuất, chi phí trong quá trình chiết xuất… giữa
các dung môi như bảng 1.5:
Bảng 1.5 Hiệu suất chiết xuất artemisinin, thời gian chiết xuất, chi phí vận hành, chi
phí đầu tư [13]:

Hiệu suất chiết
xuất (%)

Thời gian
chiết (giờ)
Chi phí vận hành
(€/Kg của
artemisinin)
Chi phí đầu tư cho
2,5.10
6
Kg dược
liệu/năm (m€)
n-hexan
69
8 – 10
28
0,7
sCO
2

82
3 – 6
42
4,1
Trong đó:
 Hiệu suất chiết xuất : Là tỷ lệ giữa khối lượng artemisinin thu được so với
artemisinin có trong dược liệu.
 Thời gian chiết: Là thời gian để chiết kiệt artemisinin từ trong dược liệu
 Chi phí vận hành: Bao gồm các chi phí điện và chi phí cho quá trình chiết
xuất khác.
 Chi phí đầu tư: Bao gồm chi phí trang thiết bị, chi phí chiết xuất, hàng tồn
kho và dung môi.

Nhận thấy phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn sCO
2
để chiết arteminsin
sẽ cho hiệu suất chiết xuất cao hơn, artemisinin trong dược liệu sẽ được chiết kiệt
hơn.
14

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu
Lá thanh cao hoa vàng được trồng ở vùng Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc, lá được
thu hái vào tháng 6 năm 2013.
2.1.2 Hóa chất
Bảng 2.1 Tên, tiêu chuẩn và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong
thí nghiệm
STT
Tên hóa chất
Nguồn gốc
1
Artemisinin chuẩn 99,3%
Việt Nam
2
n-hexan
Trung Quốc
3
Ethanol 96%
Việt Nam
4
Aceton

Trung Quốc
5
Cacbon dioxid lỏng
Việt Nam
6
Ethyl acetat
Trung Quốc
7
Cloroform
Trung Quốc
8
Natri hydroxyd
Việt Nam

2.1.3 Máy móc, thiết bị
Máy móc
 Hệ thống chiết xuất siêu tới hạn Separex (Pháp).
 Máy cất quay chân không Büchi B-490 (Thụy Sỹ).
 Máy đo quang phổ UV-VIS Hitachi (Mỹ).
 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ).
 Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
 Tủ sấy MEMMERT (Đức).
15

Dụng cụ
 Bình nón: 100ml.
 Ống đong : 100ml, 500ml.
 Bình định mức 10ml.
 Cốc có mỏ 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml.
 Pipet: 1ml, 10ml.

 Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius).
 Phễu lọc.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp định lượng
a) Định lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng:
Định lượng theo DĐVN IV, sử dụng phương pháp quang phổ tử ngoại kết
hợp với phương pháp sắc ký lớp mỏng [4]. Cách tiến hành như sau:
 Bản mỏng: silica gel G.
 Hệ dung môi: n-hexan : ethyl acetat (70:30)
 Dung dịch thử: Cân chính xác 1g dược liệu, chiết với ether dầu hỏa (30 -
60°C) trong bình soxhlet dung tích 50ml trên cách thủy trong 6 giờ, cất thu
hồi dung môi lấy cắn. Hòa tan cắn trong 1ml cloroform và cho vào bình định
mức 10ml, tráng cốc đựng cắn bằng ethanol rồi thêm cùng dung môi cho đến
vạch. Lọc qua giấy lọc, bỏ 0,5 đến 1ml dịch lọc đầu, lấy khoảng 2ml dịch lọc
tiếp theo.
 Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác 0,010g artemisinin chuẩn, hòa tan trong
10ml ethanol (pha dùng trong ngày).
 Bản silica gel G (20cm×20cm) đã được hoạt hóa ở 110°C trong 2 giờ được
chia vạch thành 5 băng, chấm lần lượt mỗi băng 0,1ml các dung dịch thử
(băng 1 và 2) và dung dịch đối chiếu (băng 3 và 4) chấm thành vạch dài 2cm,
rộng 0,3cm ; băng 5: chấm 0,1ml ethanol làm mẫu trắng.
Tiến hành sắc ký, sau khi triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 18cm, lấy
bản mỏng ra, để khô dung môi ngoài không khí trong 1 giờ. Phun nước cất làm ướt
bản mỏng để xác định các vùng có artemisinin. Các vết artemisinin chuẩn sẽ xuất
16

hiện màu trắng đục trên sắc ký đồ. Vạch đường ngay ở phía trên và phía dưới vết
artemisinin đã được xác định sao cho cách đều hai mép của vết 0,5cm đến 0,7cm.
Cạo riêng biệt các vùng có artemisinin của vết 1, 2, 3 và 4. Cạo vùng không chứa
artemisinin của vết 5 làm mẫu trắng, cho vào mỗi mẫu bột silica gel cạo được nói

trên 1ml ethanol, lắc kỹ.
 Thêm 9ml dung dịch NaOH 0,05N, lắc kỹ, cho vào tủ ấm 50°C trong 30
phút. Lấy ra để nguội 15 phút, lọc lấy dịch lọc trong và đo độ hấp thụ của các
dung dịch so với dung dịch mẫu trắng ở bước sóng 292nm (phục lục 4.1
DĐVN IV). Kết quả đo của mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu là giá
trị trung bình của 2 lần đo nhắc lại.
Lượng artemisinin có trong dược liệu khô kiệt tính theo % bằng:

Trong đó
D
t
: độ hấp thụ của dung dịch thử
D
ĐC
: độ hấp thu của dung dịch đối chiếu
P: khối lượng dược liệu đã cân (g)
B: độ ẩm dược liệu (%)
b) Định lượng artemisinin trong dịch chiết:
Theo phương pháp sắc ký lớp mỏng, DĐVN IV, tiến hành định lượng
artemisinin trong dịch chiết như sau:
 Xử lí dịch chiết: Cất thu hồi dung môi, cân tổng lượng cắn thu được (m
1
), từ
đó tính lượng cắn cần pha theo mục 2.2.1a : m
1
/a (g). Trong đó a (g) – khối
lượng dược liệu sử dụng.
 Tiến hành định lượng theo DĐVN IV. Kết quả định lượng, khối lượng
artemisinin được tính toán theo phương trình sau:
Khối lượng sản phẩm = a × hàm lượng artemisinin trong cắn

2.2.2 Phương pháp chiết xuất bằng cacbon dioxid siêu tới hạn
Quy trình chiết xuất gồm 2 giai đoạn, cụ thể như sau:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu
17

Lá thanh cao hoa vàng được sấy khô ở điều kiện nhiệt độ 50 – 60°C trong 1
giờ, lấy ra xay thô thành bột (rây qua cỡ rây 1mm).
Giai đoạn 2: Chiết xuất
Khối lượng dược liệu: 100g được ngâm trương nở trong 50ml đồng dung
môi trong 0,5 giờ.
Dung môi chiết và các điều kiện chiết xuất (nhiệt độ, áp suất) thay đổi theo khảo sát
cụ thể.
Tiến hành
Cân bột dược liệu, ngâm trương nở trong 50ml đồng dung môi tiến hành
chiết trong các điều kiện khảo sát cụ thể. Dịch chiết được thu vào bình nón có nút.
Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng và trong dịch chiết
được tiến hành như mục 2.2.1.
2.2.3 Phương pháp tinh chế
Tiến hành tinh chế Artemisinin trong dịch chiết của đồng dung môi khảo sát,
cơ bản gồm 3 bước:
Bước 1: Tạo tủa artemisinin thô.
Bước 2: Loại sáp, tẩy màu bằng than hoạt.
Bước 3: Kết tinh sản phẩm.
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Lựa chọn đồng dung môi chiết xuất
Nhằm tìm ra đồng dung môi kết hợp với sCO
2
cho hàm lượng artemisinin
trong dịch chiết cao nhất, cũng như tính chọn lọc của đồng dung môi thông qua hàm
lượng artemisinin trong cắn.

Tiến hành
Cân 100g dược liệu đã xử lí cho vào cốc có mỏ 1000ml, thêm 50ml đồng
dung môi trộn sao cho thấm đều dược liệu, đậy kín (≥ 0,5 giờ). Tiến hành chiết xuất