Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng loài stephania dielsiana y c wu tại ba vì ( hà nội ) bằng phương pháp HPTLC

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG
OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG
LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU
TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ




HÀ NỘI - 2014


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG
OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG
LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU
TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Quốc Huy
DS. Nguyễn Vũ Minh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật



HÀ NỘI - 2014


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân
thành tới TS. Nguyễn Quốc Huy, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ
bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:
DS. Nguyễn Vũ Minh, người đã hướng dẫn tận tình, đóng góp những ý kiến
quý báu và luôn tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
DS.Nghiêm Đức Trọng, DS. Tạ Khắc Công đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi
rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn.
Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Em Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, em Lê Thiên Kim – A1K66, em Lê
Trọng Sơn - A2K66 đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên
cứu khoa học tại bộ môn.
Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5

năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi.

Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy Linh


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………
3
1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU……………………………
3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố…………………………………………….
3
1.1.2. Thành phần hóa học………………………………………………………
4
1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng………………………………………….
5
1.1.3.1. Tác dụng sinh học………………………………………………………
5
1.1.3.2. Công dụng………………………………………………………………
5
1.2. OXOSTEPHANIN………………………………………………………….

5
1.2.1. Công thức phân tử và tính chất vật lý…………………………………….
6
1.2.2. Tác dụng dược lý…………………………………………………………
6
1.3. SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO……………………………….
6
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng…………………………………………………………
6
1.3.1.1. Nguyên tắc……………………………………………………………
6
1.3.1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng………………………………………………
8
1.3.2. Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao –
HPTLC…………………………………………………………………………
10
1.3.3. Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu……………………
10


1.3.2.1. Định tính………………………………………………………………
10
1.3.2.2. Bán định lượng…………………………………………………………
12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……
14
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU…………………………
14
2.1.1. Nguyên liệu……………………………………………………………….
14

2.1.1. Hóa chất và dụng cụ……………………………………………………
17
2.1.1.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm……………………………………….
17
2.1.1.2. Hóa chất………………………………………………………………
18
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………
18
2.2.1. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………
18
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………
18
2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng……………………………………
18
2.2.2.2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây…………….
23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………
24
3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM………………………………………………
24
3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC……………………….
24
3.1.1.1. Xử lý mẫu thử………………………………………………………….
24
3.1.1.2. Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn……
25
3.1.1.3. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC…………………………….
26
3.1.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng……………………………………
26

3.1.2. Định lượng oxostephanin trong cây trồng loài S.dielsiana………………
29


3.1.3. Đánh giá hàm lượng oxstephanin trong cây trồng loài S.dielsiana………
30
3.1.3.1. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các bộ phận khác nhau
của cùng 1 cây…………………………………………………………………
30
3.1.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các mẫu theo các độ
tuổi khác nhau…………………………………………………………………
32
3.1.3.3. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin tích lũy trong mẫu cây trồng
từ hạt và cây trồng từ hom………………………………………………………
33
3.1.3.4. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong mẫu củ trưởng thành
theo các mùa khác nhau…………………………………………………………
34
3.2. BÀN LUẬN………………………………………………………………
35
3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ………………………………………
35
3.2.2. Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây…………….
36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………
39
KẾT LUẬN……………………………………………………………………
39
KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………….
40

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6





DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

GACP
Good Agricultural and Collection Practices
IR
Infrared Radiation
HPTLC
High Performance Thin Layer Chromatigraphy
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
MS
Mass spectrometry
NMR
Nuclear magnetic resonance
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
STT
Số thứ tự

S.
Stephania
TLC
Thin Layer Chromatography
UV
Ultraviolet



DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số chất làm pha tĩnh cho TLC………………………………
7
Bảng 1.2. Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu……………
9
Bảng 2.1. Danh mục các mẫu cây nghiên cứu……………………………….
16
Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)……………
19
Bảng 3.1. Nồng độ oxostephanin chuẩn và diện tích pic đáp ứng…………
27
Bảng 3.2. Giá trị Rf và diện tích pic của các vết……………………………
28
Bảng 3.3 . Kết quả khảo sát độ đúng………………………………………
29
Bảng 3.4. Kết quả định lượng oxostephanin bằng HPTLC………………….
30
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phương sai……………………………………
31
Bảng 3.6. So sánh hàm lượng oxostephanin theo các cặp mẫu cây trồng từ
hạt và cây trồng từ hom………………………………………………………

34












DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cụm hoa đực và hoa đực……………………………………………
3
Hình 1.2. Cụm hoa cái…………………………………………………………
3
Hình 1.3. Quả xanh và hạt……………………………………………………….
4
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của oxostephanin…………………………………
6
Hình 2.1. Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội………………….
14
Hình 2.2. Củ loài S. dielsiana……………………………………………………
15
Hình 2.3. Thân lá non loài S. dielsiana………………………………………….
15
Hình 2.4. Thân lá bánh tẻ loài S. dielsiana……………………………………
15

Hình 2.5. Thân lá già loài S. dielsiana…………………………………………
16
Hình 2.6. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC……………………………….
18
Hình 3.1. Sắc ký đồ tại độ pha loãng 50 lần……………………………………
25
Hình 3.2 . Sắc ký đồ tại độ pha loãng 100 lần…………………………………
25
Hình 3.3. Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 1…………………………
26
Hình 3.4. Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 2…………………………
26
Hình 3.5. Đường chuẩn định lượng xây dựng được từ dãy chuẩn 3…………….
26
Hình 3.6. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng……………
28
Hình 3.7. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic…………………………….
29
Hình 3.8. Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây



trồng từ hạt………………………………………………………………………
34
Hình 3.9. Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây
trồng từ hom…………………………………………………………………….
35
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin theo mùa………………
37

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú, trong đó có khoảng 4000 loài
thực vật có thể làm thuốc trong các nền Y học dân gian, 800 loài thường được dùng
trong Y Học cổ truyền chính thống và 300 loài dùng trong công nghiệp dược [40].
Như vậy có thể thấy tiềm năng về cây thuốc ở Việt Nam còn rất lớn. Nghiên cứu để
tìm ra cây thuốc mới cùng những hoạt chất mới từ dược liệu là việc làm cần thiết để
nâng cao giá trị sử dụng cũng như phát triển nền Y học cổ truyền Việt Nam.
S. dielsiana Y. C. Wu là một loài Bình vôi được ghi trong Sách đỏ Việt Nam,
thường được gọi là củ dòm hay củ gà ấp [24]. Người dân địa phương tại Ba Vì
thường dùng cả củ và thân lá để điều trị tê thấp đau nhức, đau dạ dày. Oxostephanin
một alkaloid quan trọng đã được phân lập từ củ và lá loài S. dielsiana Y. C. Wu
trồng ở Ba Vì, Hà Nội [11], [17]. Hoạt chất này sau đó đã được thử tác dụng gây
độc trên 3 dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-2), phổi (LU) và màng tim (RD)
cho kết quả IC
50
lần lượt là: 0.566; 0.755 và 1.404 [22]. Một số nghiên cứu trên thế
giới cũng đã chứng minh oxostephanin có tác dụng trên 2 dòng tế bào ung thư là
ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC) [35]. Với
những kết quả trên có thể thấy tiềm năng phát triển của loài S. dielsiana là rất lớn.
Hiện nay chúng tôi đã tiến hành trồng và theo dõi sự phát triển của loài cây này tại
Ba Vì (Hà Nội), với định hướng trồng phát triển một loài cây thuốc mới theo hướng
“Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc (GACP)” của tổ chức Y Tế Thế Giới
(WHO).
Chính vì vậy, nghiên cứu hàm lượng oxostephanin tích lũy trong cây, đặc
biệt là đánh giá hàm lượng của alkaloid này ở các bộ phận khác nhau của cây có ý
nghĩa quan trọng để xác định bộ phận thu hái, thời điểm thu hái phù hợp. Hoạt động

này cũng là bước đầu trong lộ trình tiêu chuẩn hóa dược liệu.
Với các lý do như trên, đề tài: “Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin
trong cây trồng loài Stephania dielsiana Y. C. Wu tại Ba Vì (Hà Nội) bằng
phương pháp HPTLC” đã được thực hiện với 2 mục tiêu sau:
2

1. Xây dựng quy trình định lượng oxostephanin trong cây trồng loài S. dielsiana Y.
C. Wu bằng phương pháp HPTLC.
2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng loài S. dielsiana
Y. C. Wu.



















3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Loài S. dielsiana Y. C. Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê
(Menisperaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculaceae), phân lớp Hoàng Liên
(Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
[2], [3], [6], [7].
S. dielsiana Y.C.Wu có tên thường dùng là củ dòm [22], [24], tên khác là
bình vôi nhựa tím, cà tòm ( dân tộc Tày - Tuyên Quang), củ gà ấp [22], [24]. Củ
dòm là dạng cây dây leo nhỏ, sống nhiều năm. Rễ củ to. Thân leo cuốn dài khoảng 3
m. Thân non màu tím hồng nhạt. Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím
hồng [23], [24]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực do 3-5 xim nhỏ hợp thành
xim tán kép. Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình
quạt tròn, màu vàng cam. Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô [12]. Cụm
hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu. Hoa nhỏ; đài 1, màu
tím hồng; cánh hoa 2, hình quạt tròn, màu vàng cam và có các vân tím; bầu hình
trứng, đầu nhụy có 4-5 thùy dạng dùi [24].

Hình 1.1. Cụm hoa đực và hoa đực

Hình 1.2. Cụm hoa cái
4

Quả hình trứng đảo, hơi dẹt. Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở
giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [24].

Hình 1.3. Quả xanh và hạt
Loài S. dielsiana Y.C.Wu phân bố nhiều ở Việt Nam và Trung Quốc. Tại
Việt Nam, loài này phân bố chủ yếu ở Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang,

Chiêm Hóa), Bắc Kạn, Thái Nguyên (Đại Từ, Tam Đảo), Bắc Giang, Bắc Ninh,
Quảng Ninh, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Nam (Trà My, Trà Mai, Trà Giác) [10], [12],
[13], [22], [24], [27].
1.1.2. Thành phần hóa học.
Alkaloid là thành phần chính của loài nghiên cứu, ngoài ra còn có một số thành
phần khác như tinh bột, đường khử tự do, acid hữu cơ [17]. Theo Nguyễn Linh Chi,
hàm lượng alkaloid toàn phần trong mẫu củ tăng dần từ 2.68% ở cây 8 tháng tuổi
lên 4.85% ở cây 28 tháng tuổi đối với cây trồng từ hạt; từ 2.06% ở cây 7 tháng tuổi
lên 4.52% ở cây 34 tháng tuổi đối với cây trồng từ hom [11].
Trong một số nghiên cứu trên thế giới, các alkaloid đã được phân lập từ loài bao
gồm: Magnoflorin (C
20
H
24
NO
4
) [32], [39]; Cyclanolin (C
20
H
24
O
4
N
+
) [39]; L-
tetrahydropalmatin (C
21
H
25
NO

4
) [33], [34], [38], [39].
Từ loài S.dielsiana thu hái ở Ba Vì (Hà Nội) đã phân lập được 4 alkaloid từ củ là:
L-tetrahydropalmatin, oxostephanin, dehydrocrebanin [17], thailandine [21]. Kết
quả định lượng bằng phương pháp HPLC cho hàm lượng L-tetrahydropalmatin
trong mẫu củ cây 20 tháng tuổi, 34 tháng tuổi và cây trưởng thành lần lượt là
0.035%, 0.33% và 0.4% [11], [17].

5

1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng
1.1.3.1. Tác dụng sinh học
- Nước sắc từ củ loài S. dielsiana phơi khô đem thử tác dụng sinh học trên
động vật thí nghiệm cho thấy với liều 2.5 g và 5 g/kg ttc có tác dụng giảm đau ngoại
biên theo kiểu aspirin, không có tác dụng giảm đau trung ương theo cơ chế tương tự
morphin; với liều 50 mg/kg, tác dụng giảm đau đến chậm từ 10-30 phút sau khi cho
chuột uống [17].
- Tác dụng chống viêm cấp được thực hiện trên 2 mô hình: (i) Mô hình gây phù
chân chuột bằng carrageenin: Kết quả cho thấy tác dụng chống viêm cấp của dịch
chiết loài S. dielsiana ở liều 1.5 g và 3 g/kg chỉ có tác dụng sau 24 giờ, tác dụng
chống viêm này chậm, không giống tác dụng của indomethacin với liều 5 mg/kg;
(ii) Mô hình gây tràn dịch màng bụng: củ loài S. dielsiana với liều 1.5 g và 3 g/kg
không có tác dụng. Ở tác dụng chống viêm mạn dùng mô hình gây u hạt, với liều thí
nghiệm 5 g/kg củ loài S. dielsiana có tác dụng làm giảm u hạt, kết quả cho thấy củ
dòm có tác dụng gần tương tự tác dụng chống viêm của prednisolon với liều
5mg/kg. Như vậy củ loài S. dielsiana có tác dụng giảm đau ngoại biên và chống
viêm, tuy nhiên tác dụng này còn phụ thuộc vào liều dùng và thời gian tác dụng
chậm [22].
1.1.3.2. Công dụng
Theo Võ Văn Chi [9], [10], rễ loài được dùng uống, chữa đau lưng, mỏi

nhức chân, đau lưng, đau bụng, giúp ngủ rất say. Còn dùng đắp chỗ sưng bắp chuối,
nhọt cứng, apxe do viêm. Người ta thường giã lẫn với muối và gừng. Nhân dân ở
Bắc Thái (Thái Nguyên và Bắc Cạn), Hà Tây (Hà Nội) thường dùng củ thái nhỏ nấu
nước uống, chữa kiết lỵ ra máu, đau bụng kinh niên và đau dạ dày.
1.2. OXOSTEPHANIN
Oxostephanin là alcaloid đã được phân lập từ 3 loài: S. zippeliana, S.
japonica, S. suberosa [31], [32]. Ở Việt Nam, oxostephanin có trong loài S.
dielsiana Y. C. Wu [17].
6

1.2.1. Công thức phân tử và tính chất vật lý
Oxostephanin thuộc nhóm aporphin, có công thức phân tử là C
18
H
11
NO
4
(Hình 1.4),
tồn tại ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng, nóng chảy ở 160-162˚C. Phổ UV có 3
cực đại hấp thụ tại các bước sóng (nm): 217, 249, 270, 358, 421 [20].
N
O
O
O
OCH
3
5
43
2
1

7
8
9
10
11
3a
6
6a
6b
7a
11a
11b

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của oxostephanin
1.2.2. Tác dụng dược lý
Nghiên cứu trên thế giới cho kết quả oxostephanin có tác dụng gây độc trên 2 dòng
tế bào là ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC)
[43]. Ngoài ra, oxostephanin còn có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư gan
(Hep-2), ung thư phổi (LU) và ung thư cơ vân (RD) [17].
1.3. SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
1.3.1.1. Nguyên tắc
- Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp
mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng
thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha
tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha
động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp
và được hút lên bản sắc kí bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên
tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1].
- R

f
là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ
số lưu giữ R
f
. Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:
7

R
f
=  


Trong đó:
d
R
: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm).
d
M
: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
R
f
có giá trị dao động từ 0 đến 1.
- Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 – 30 µm, được rải đều và kết
dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản
mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5 – 20 cm, nhiều khi
có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
phân tích [1]. Chất hấp phụ thường dùng nhất là các loại silica gel (>90%) rồi đến
nhôm oxyd (<5%). Các loại khác (than hoạt, Polyamid, Florisil, Celite,

Kieselguhr)…ít được sử dụng [5].
Bảng 1.1. Một số chất làm pha tĩnh cho TLC [5]
Pha tĩnh
Cơ chế sắc ký
Ứng dụng phân tích
Silica
Hấp phụ
Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin
Dẫn chất siloxan
Phân bố
Các chất ít phân cực
Cellulose
Phân bố
Acid amin, carbohydrat, nucleotid
Alumina
Hấp phụ
Hydrocarbon, alkaloid, chất màu thực phẩm,
lipid
Cát biển
Phân bố
Đường, acid béo
Cellulose trao đổi
ion
Trao đổi ion
Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,
halogenid
Gel Sephadex
Loại cỡ
Polymer, protein, phức kim loại
- Pha động cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường

rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố
giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường chủ yếu dựa vào kinh
nghiệm. Một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC [1]:
+ Dung môi cần có độ tinh khiết cao.
8

+ Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số R
f
nằm trong khoảng 0.2
– 0.8, đạt độ phân giải cực trị.
+ Chất phân tích dạng ion hay phân cực rửa giải tốt bằng dung môi phân cực
như hỗn hợp n-butanol – nước. Thêm một ít acid acetic hoặc ammoniac vào nước sẽ
làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng.
+ Khi dùng silica hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha
động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số R
f
của chúng. Nếu
thêm một ít dung môi phân cực như ethyl ethylic vào dung môi không phân cực như
methylbenzene sẽ làm tăng đáng kể trị số R
f
.
+ Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể sử
dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina.
1.3.1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
Đầu tiên là lựa chọn bản mỏng sắc ký có kích thước phù hợp, hoạt hóa trong
thời gian và nhiệt độ thích hợp. Sau đó, thực hành sắc ký lớp mỏng có 4 bước sau.
Bước 1: Đưa chất phân tích lên bản mỏng
- Lượng và thể tích mẫu chấm: Lượng mẫu đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan
trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến trị số R
f

. Nếu lượng chất quá lớn,
vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các vết có trị số R
f
gần nhau sẽ chồng lên nhau và
không tách riêng được. Nếu lượng chất quá nhỏ có thể khó phát hiện vết. Lượng
mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0.1 – 50 µg. Tùy theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng
mà thể tích mẫu cũng khác nhau. Trường hợp mẫu đưa dưới dạng điểm, thể tích
mẫu khoảng 1-5 µl; còn trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dạng vạch thì lượng
mẫu đưa lên khoảng 0.1 – 0.2 µl [1], [5].
- Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng: Đường xuất phát cách mép dưới bản mỏng và mép
của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi từ khi bắt đầu đến
điểm đưa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định. Tốt nhất là cách mép dưới bản mỏng
1.5 cm và cách mép dung môi từ 0.8 - 1cm. Khoảng cách giữa các vết và giữa vết
với mép ngoài bản mỏng tốt nhất nên là 1 cm để tránh hiệu ứng bờ [1], [5].

9

Bước 2: Khai triển sắc ký
- Thiết bị triển khai sắc ký thường là bình thủy tinh có nắp đậy kín, kích
thước phù hợp với bản mỏng. Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình
(nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi), người ta đặt tờ giấy lọc áp
sát thành bình .
- Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô được cho vào bình sắc ký đã bão hòa
pha động. Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm vẫn cách
bề mặt pha động khoảng 1 cm [5].
Bước 3: Hiện sắc ký đồ, dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần phân tích
để lựa chọn cách phát hiện thích hợp vết sắc ký.
- Sử dụng thuốc thử hiện màu [5]: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy đủ nhất tất
cả các vết, thường phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc nhúng cả bản
mỏng vào thuốc thử. Đôi khi làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo

màu và cường độ vết màu.
Bảng 1.2. Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu
STT
Hợp chất
Thuốc thử hiện màu
1
Alkaloid
Dragendoff
2
Anthraquinon
KOH/MeOH
3
Coumarin
Diazo – hóa
4
Steroid
Liebermann – Burchard
5
Hữu cơ nói chung
H
2
SO
4
20% ( không đặc hiệu)
6
Iridoid
Trim – hill
7
Không no
Hơi iod ( không đặc hiệu)

8
Polyphenol
NaOH/MeOH, FeCl
3

9
Saponin
VS, AS, hỗn dịch máu
10
Terpenoid
VS, AS (không đặc hiệu)
- Soi dưới ánh sáng đèn UV [1]: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối
hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 hoặc 366 nm. Một số
10

bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh
quang.
- Dùng densitometer [1]: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng
khi soi dưới đèn UV-VIS. Chất phân tích bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký.
Bước 4: Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm [1].
1.3.2. Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao – HPTLC
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ
thuật SKLM. Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động
như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc
ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết
(TLC Scanner 3,4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [39].
Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là [14]:
- Khả năng phân tách tốt hơn. Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao có
kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng
cũng tốt hơn.

- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng
có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn.
- Thời gian triển khai ngắn hơn.
- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển khai
sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu. Các yếu tố về môi
trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn
chế tới tối đa các thay đổi.
HPTLC ngày càng đươc ứng dụng nhiều trong định tính, định lượng.
1.3.3. Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu
1.3.3.1. Định tính
- Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối
đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi
khác nhau. Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng R
f
= 0.30 – 0.75
thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết. Việc khẳng định sự
11

tinh khiết của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phổ học khác (UV, IR,
NMR, MS) [5].
- So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau,
khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau. Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3
vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn). Nếu trên cả
3 sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số R
f
, về hình dạng vết, về
màu sắc vết trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu
chuẩn là đồng nhất [5].
- Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch
chiết của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu

chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng). Sau đó so
sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu
sắc các vết, tỷ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu
chuẩn [5].
- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất
định, trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là
không đổi về số vết, về trị số R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ
lệ tương đối giữa các vết… Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu trong
công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu [5].
Theo kết quả thống kê trong tài liệu [14], SKLM là một trong các tiêu chuẩn
định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển. Dược
điển thảo dược Hoa Kỳ có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010) có 873
chuyên luận và con số này trong Dược điển Việt Nam IV là 168. Hình ảnh sắc ký
đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu. Ứng dụng này giúp xây dựng “dấu
vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát
hiện sự nhầm lẫn, giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu.

12

1.3.3.2. Bán định lượng
Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi
soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao),
nếu có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất)
có trong mẫu thử. HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp
so sánh. Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn.
Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của

chất đó trên sắc ký đồ để từ đó xây dựng đường chuẩn định lượng. Đo tín hiệu đáp
ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong mẫu thử và nội suy nồng độ từ đường
chuẩn đã xây dựng ở trên [5].
Trên thế giới, nhiều lĩnh vực đã ứng dụng HPTLC trong bán định lượng như:
nghiên cứu lâm sàng, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp, pháp y, môi
trường [14]. Trong nghiên cứu dược liệu, theo xu hướng phát triển các sản phẩm
chăm sóc sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc thực vật, định lượng hoạt chất
trong dược liệu bằng HPTLC là một nội dung nghiên cứu được quan tâm phát triển.
Năm 2010, nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ.
Kết quả hàm lượng berberin là khoảng 4.0%. Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại
của phương pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7% [29]. Cũng ứng dụng quy trình
trên, năm 2012, Nguyễn Thị Thu Hằng cũng đã định lượng berberin trong thân và
rễ của 1 số cây loài Berberis. bằng phương pháp HPTLC. Kết quả hàm lượng
berberin trong mẫu rễ là 3.98% và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [15].
Quy trình định lượng tetrandrine trong củ S. tetrandra S. More (phòng kỷ, họ Tiết
dê - Menisperaceae) bằng phương pháp HPTLC là một trong số các bộ quy trình
định lượng đang được hãng Camag xây dựng [39]. Tetrandrine là thành phần hoạt
chất chính, có tác dụng lợi tiểu và làm giảm tình trạng thấp khớp. Dược điển Trung
Quốc quy định hàm lượng của tetrandrine trong dược liệu phải trên 0.7%. HPTLC
không chỉ giúp xác định nhanh hàm lượng tetrandrine mà hình ảnh sắc ký đồ còn
giúp phân biệt vị thuốc này với một vị thuốc khác cũng có tên là phòng kỷ nhưng
13

thuộc họ Mộc thông (Aristolochiaceae), trong thành phần có chứa acid độc
aristolochic là chất gây suy thận và ung thư [18].

14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu nghiên cứu là củ và thân lá cây củ dòm (đã được giám định tên
khoa học là Stephania dielsiana Y.C.Wu, tiêu bản được lưu giữ ở phòng Tiêu bản –
Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản là HNIP/17701/10) trồng tại Xã Tản
Lĩnh, Huyện Ba Vì, Hà Nội.

Hình 2.1. Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội
- Mẫu nghiên cứu để xây dựng quy trình định lượng: Mẫu củ và thân lá cây trồng
loài S. dielsiana trưởng thành, được thu hái nhiều lần tại các thời điểm khác nhau
trong năm.
- Mẫu nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo các bộ phận khác nhau
của cây, theo tuổi và theo nguồn gốc cây, lấy trên cùng một cây. Các mẫu được thu
15

hái trên các cây trồng từ hạt, trồng từ hom của cây 1 tuổi, 2 tuổi, trưởng thành, thu
hái các bộ phận sau:
+ Mẫu củ.

Hình 2.2. Củ loài S. dielsiana
+ Mẫu thân lá non: phần ngọn cây, dài 50 – 60 cm, lá và thân có màu tím hồng.
Thân mềm nhẵn, kích thước phát triển chưa đầy đủ.

Hình 2.3. Thân lá non loài S. dielsiana
+ Mẫu thân lá bánh tẻ: tiếp theo phần non, dài khoảng 150-200 cm, màu xanh đậm.
Thân cây dai chắc, kích thước đã phát triển đầy đủ.

Hình 2.4. Thân lá bánh tẻ loài S. dielsiana
+ Mẫu thân lá già: phần cuối, phía gần gốc cây. Lá bắt đầu chuyển màu vàng, thân
có màu nâu xám, bề mặt xù xì, có khía dọc.