Ứng dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



LÊ THỊ MAI

ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ
SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ


\

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


LÊ THỊ MAI

ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ
SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Lê Thanh Bình
Nơi thực hiện
:

Bộ môn Dƣợc liệu



HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Lê Thanh Bình và
TS. Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội, là
người đã truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu cũng như giúp em có thêm nhiều
kiến thức về cuộc sống. Bằng những kiến thức và kinh nghiệm quý báu học được,
em đã có thể hoàn thành khoá luận đồng thời có thêm hành trang chuẩn bị bước vào
nghề.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn
Dược Liệu đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành khoá luận một
cách tốt nhất. Cảm ơn các thầy cô giáo đã cung cấp cho em những kiến thức quý
báu trong suốt 5 năm qua.
Và em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn ở bên cạnh tin tưởng,
động viên em giúp em có được kết quả như ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Mai










MỤC LỤC

Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………….
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN……………………………………………
2
1.1. Tổng quan về sắc kí lớp mỏng ………………………………
2
1.1.1. Giới thiệu chung về phương pháp …………………………
2
1.1.2. Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dược liệu ……….
4

1.1.3. Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu …………
5
1.2. Tổng quan về sắc kí khí - khối phổ ……………….………………
5
1.2.1. Sắc kí khí ……… ………………………………………….
5
1.2.2. Detector khối phổ trong sắc kí khí ………………………….
7
1.2.3. Ứng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm …………….…
7
1.2.4. Ứng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm
tinh dầu ……………………………………………………

8
1.3. Tổng quan về các dƣợc liệu nghiên cứu …………………………
9
1.3.1. Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.,
Lamiaceae)………………………………………………….

9
1.3.2. Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng,
Lamiaceae)………………………………………………….

10
1.3.3. Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae) …
11
1.3.4. Hương nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae) ………
12
1.3.5. Tràm Úc (Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel,
Myrtaceae)…………………………………………………

12

1.3.6. Tràm lá dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae) ……….
13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…
14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị …….………………………………………
14
2.1.1. Nguyên vật liệu ………….………………………………….
14
2.1.2. Hóa chất ………….………………………………………….
15
2.1.3. Thiết bị ………….…………………………………………
15
2.2. Nội dung nghiên cứu………………………………………………
15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………………
15
2.3.1. Chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương
pháp cất kéo hơi nước………………………………………

16
2.3.2. Phân lập chất đối chiếu bằng phương pháp sắc kí cột ………
16
2.3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM .…….
17
2.3.4. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí
kết hợp khối phổ ……………………………………………

17
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………
18
3.1. Chiết xuất, xác định hàm lƣợng tinh dầu trong các mẫu dƣợc
liệu nghiên cứu ………………………………………………………

18
3.2. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM …………
18
3.2.1. Tinh dầu Hoắc hương …………………………………
18
3.2.2. Tinh dầu Húng chanh
21
3.2.3. Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía
24
3.2.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài ……………………………
28
3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp sắc kí khí kết
hợp khối phổ ………………………………………………………

31
3.3.1. Tinh dầu Hoắc hương …………………….…………………
31

3.3.2. Tinh dầu Húng chanh ……………………………………….
34
3.3.3. Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía …………………
36
3.3.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài ……………………………
38

3.4. Bàn luận ……………………………………………………………
41
3.4.1. Về chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu trong các
mẫu dược liệu nghiên cứu ………………………………

41
3.4.2. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM
44
3.4.3. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí
kết hợp khối phổ ……………………………………………

45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………
48
Kết luận ……………………………………………………
48
Đề xuất ………………………………………………………
48
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẲT
DĐVN: Dược điển Việt Nam
GC-MS: Sắc kí khí kết hợp khối phổ
NXB: Nhà xuất bản
SKK: Sắc kí khí
SKLM: Sắc kí lớp mỏng


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM
3
2
Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu
14
3
Bảng 3.1. Hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên
cứu
18
4
Bảng 3.2. Kết quả phân tích mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi bằng
GC-MS
32

5
Bảng 3.3. Kết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương khô bằng GC-
MS
33
6
Bảng 3.4. Kết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương ủ bằng GC-
MS
34
7
Bảng 3.5. Kết quả phân tích tinh dầu Húng chanh bằng GC-MS
35
8
Bảng 3.6. Kết quả phân tích tinh dầu Hương nhu trắng bằng GC-
MS
37
9
Bảng 3.7. Kết quả phân tích tinh dầu Hương nhu tía bằng GC-
MS
38
10
Bảng 3.8. Kết quả phân tích tinh dầu Tràm Úc bằng GC-MS
39
11
Bảng 3.9. Kết quả phân tích tinh dầu Tràm lá dài bằng GC-MS
40


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Tên bảng

Trang
1
Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí
6
2
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ
7
3
Hình 2.1. Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến
16
4
Hình 3.1. Hình ảnh sắc kí đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương quan
sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu
20
5
Hình 3.2. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh quan sát dưới
ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi
phun thuốc thử hiện màu
23
6
Hình 3.3. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương
nhu tía quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm
26
7
Hình 3.4. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương
nhu tía quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện
màu
27
8
Hình 3.5. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan

sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu
30
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nói chung,
số lượng và chủng loại tinh dầu trên thị trường Việt Nam cũng ngày càng tăng cao.
Tuy nhiên hiện nay các biện pháp kiểm soát chất lượng tinh dầu còn chưa thực sự
được quan tâm, do đó làm thế nào để đánh giá chất lượng tinh dầu vẫn còn là một
câu hỏi lớn.
Trong khi hiện nay sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký khí (SKK) là hai
phương pháp bắt buộc phải tiến hành khi đánh giá chất lượng tinh dầu theo quy
định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu của Dược điển Châu Âu thì theo thống
kê, ở Dược điển Việt Nam IV chỉ có 7 chuyên luận về tinh dầu trên tổng số 283
chuyên luận về dược liệu. Đặc biệt chưa có chuyên luận nào quy định sử dụng
phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc
ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu.
Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu ở nước ta hiện nay
chưa được chú trọng; các phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến và hiện đại chưa được
áp dụng phổ biến trong kiểm nghiệm tinh dầu. Do đó cần có thêm nhiều nghiên cứu
về tinh dầu đồng thời áp dụng các kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra và
đánh giá chất lượng các loại tinh dầu đang lưu hành .
Vì vậy đề tài: ―Ứng dụng sắc kí lớp mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm
một số loại tinh dầu‖ được thực hiện với mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM
và sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) để phân tích nhằm đưa ra điều kiện sắc ký
tối ưu nhất trong kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dầu, tạo cơ sở bước đầu cho
việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM và SKK đối với một số tinh dầu thường dùng.
Nội dung nghiên cứu của khoá luận:
1. Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các dược liệu nghiên cứu
2. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp SKLM

3. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp GC-MS


2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về sắc kí lớp mỏng
1.1.1. Giới thiệu chung về phƣơng pháp
 Khái niệm
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) là một kĩ thuật tách các chất được tiến hành khi cho
pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách [1],
[25].
 Nguyên tắc
Quá trình tách xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh. Pha tĩnh là
chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp
mỏng trên một giá đỡ phẳng. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần
được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp. Pha động thấm theo lớp mỏng chủ yếu dưới
tác dụng của lực mao quản. Trong quá trình di chuyển của pha động, nhờ các quá
trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau, mà
những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động với các tốc độ khác nhau.
Kết quả, mỗi chất trong hỗn hợp phân tích sẽ ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng
nên được tách riêng [5], [17].
 Cơ chế
Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc
phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tuỳ thuộc vào tính chất pha tĩnh
và pha động [5].
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển R
f
= a/b. Trong đó:

a – khoảng cách di chuyển của chất phân tích
b – khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ thời điểm chấm mẫu.
R
f
có giá trị từ 0 đến 1
Các yếu tố ảnh hưởng đến R
f
trong SKLM bao gồm chất lượng và hoạt tính
của chất hấp phụ; bề dày của lớp mỏng; tính chất, thành phần và độ tinh khiết của
pha động; độ bão hoà dung môi trong bình sắc kí; phương pháp khai triển sắc kí; tốc
3

độ di chuyển của pha động; đoạn đường pha động đi được; vị trí đưa chất tan lên
bản mỏng; lượng mẫu đưa lên bản mỏng; ảnh hưởng của các chất tan khác, chất tạo
phức, pH, nhiệt độ; độ chính xác của phép đo khoảng cách…[1].
 Pha tĩnh
Pha tĩnh là các hạt có kích thước 10-30μm được rải đều và kết dính thành lớp
mỏng đồng nhất dày khoảng 250 μm trên giá đỡ hình vuông. Bản mỏng có sẵn trên
thị trường có kích thước khác nhau, thường 5x20 cm hoặc 20x20cm, nhiều khi có
thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân
tích.
Bảng 1.1: Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM
STT
Pha tĩnh
Cơ chế sắc kí
Ứng dụng phân tích
1
Silica
Hấp phụ
Acid amin, hydrocarbon, alcaloid,

vitamin
2
Dẫn chất siloxan
Phân bố
Các chất ít phân cực
3
Cellulose
Phân bố
Acid amin, carbohydrat, nucleotid
4
Alumina
Hấp phụ
Hydrocarbon, alcaloid, chất màu
thực phẩm, lipid
5
Cát biển
Phân bố
Đường, acid béo
6
Cellulose trao đổi
ion
Trao đổi ion
Acid nucleic, nucleotid, ion kim
loại, halogenid
7
Gel Sephadex
Loại cỡ
Polymer, protein, phức kim loại
Trong đó Silicagel thường dùng nhất theo cơ chế sắc kí hấp phụ. Các loại bản
mỏng silica gel: Silicagel G: có trộn thạch cao 5%; Silicagel H: không trộn thạch

cao; Silicagel GF
254
: có trộn thạch cao và chất huỳnh quang (fluorescent)[1][25].
 Pha động
Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 hay nhiều dung môi.
Nguyên lí lựa chọn: Tuỳ thuộc tính chất phân cực và ái lực với pha tĩnh để
chọn lựa dung môi sao cho phù hợp. Khảo sát lựa chọn theo nguyên tắc tam giác
4

Stahl, nghĩa là muốn tách những chất không hoặc ít phân cực, phải dùng chất hấp
phụ có hoạt năng cao và dung môi khai triển yếu (ít phân cực) hoặc ngược lại[1].
 Phát hiện sắc kí đồ
Phát hiện các vết tách dưới ánh sáng thường bằng mắt, quan sát được các vết
có màu. Ngoài ra, có thể sử dụng hệ thống đèn tử ngoại với 2 bước sóng thường sử
dụng là 254 nm và 366nm. Cũng có thể quét bản mỏng qua bộ phận Scanner
Densitometer trong khoảng bước sóng 200-800 nm để lựa chọn bước sóng phát hiện
phù hợp. Trong một số trường hợp cần dùng thuốc thử để hiện vết trên sắc kí đồ thì
sử dụng bình phun thuốc thử[1].
 Ưu điểm của phương pháp [1], [22], [23], [24], [25]
- Yêu cầu trang thiết bị cần thiết rất đơn giản
- Cho kết quả nhanh, rất thuận tiện cho theo dõi phản ứng, dự đoán nhanh các
chất…
- Thời gian thực hiện ngắn
- Khá kinh tế nên rất hiệu quả trong thăm dò kết quả của nhiều quá trình khác
nhau
 Nhược điểm [1]
- Khả năng phân tách còn hạn chế.
- Không thể tự động hoá hoàn toàn.
- Độ lặp lại R
f

thấp do pha động thay đổi trong quá trình triển khai.
- Tăng giãn rộng của pic sắc ký do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp.
1.1.2. Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dƣợc liệu [3], [24]
SKLM là một phương pháp được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau như: dược phẩm, hoá sinh, lâm sàng… để phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng
tiêu chuẩn. Đối với kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng,
SKLM có thể được ứng dụng để phân tích định tính, thử tinh khiết và định lượng
các hoạt chất trong mẫu phân tích.
 Thử tinh khiết
5

Là một ứng dụng rất phổ biến của SKLM nhằm kiểm tra sự tinh khiết của các
hợp chất: khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau để phát hiện các
vết lạ ngoài vết chính của hợp chất.
Một ứng dụng thử tinh khiết rất hay gặp khác của SKLM là sử dụng để nhận
biết sơ bộ thành phần của hỗn hợp phản ứng, các phân đoạn chiết xuất, các phân
đoạn của sắc kí cột…
 Định tính
Mỗi chất trong một hệ sắc kí có một giá trị R
f
đặc trưng. Do vậy để định tính
một chất cụ thể ta cần so sánh R
f
của mẫu thử với mẫu chuẩn tiến hành sắc kí trong
cùng điều kiện. Để việc định tính được chính xác, không được thay đổi điều kiện thực
nghiệm khi so sánh và phải thực hiện một loạt phép đo để xác định giá trị trung bình.
 Định lượng và bán định lượng
Bằng các biện pháp chính xác hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể áp
dụng SKLM để định lượng. Tuỳ theo phương tiện sử dụng mà độ chính xác của
phép định lượng ở cấp độ khác nhau.

1.1.3. Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu
SKLM là một trong những kĩ thuật sắc kí đầu tiên đã và đang được sử dụng
trong nhiều năm để phân tích tinh dầu. Phương pháp này cung cấp các thông tin rất
có giá trị so với các phương pháp đơn giản khác vì vậy mà nó được thực hiện như là
một tiêu chuẩn để mô tả đặc tính của tinh dầu trong Dược điển.
Mặc dù rất đơn giản và thực hiện nhanh chóng, kĩ thuật này đang dần trở nên
lỗi thời đối với phân tích các hỗn hợp phức tạp như tinh dầu. Tuy nhiên, trong các
cuộc khảo sát nhanh về các thành phần hoá học của tinh dầu hoặc sự khác nhau về
thành phần tinh dầu của các loài, phương pháp này vẫn còn rất hữu ích [18].
1.2. Tổng quan về sắc kí khí - khối phổ
1.2.1. Sắc kí khí
 Khái niệm
Sắc kí khí là một phương pháp tách dựa trên sự phân bố khác nhau giữa các
chất của hai pha không trộn lẫn vào nhau, trong đó pha động là chất khí đi qua pha
6

tĩnh chứa trong cột. Sắc kí khí được áp dụng để tách những chất hoặc dẫn xuất của
chúng mà có thể hoá hơi ở nhiệt độ phân tích.
Sắc kí khí dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc loại theo kích thước (dùng
rây phân tử) [3], [12].
 Nguyên tắc [12]
Mẫu được bơm đưa vào trong và theo dòng khí mang (thường là N
2
) đưa lên
cột sắc kí (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau
đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò.
Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lí và biểu hiện kết quả bằng sắc kí đồ.
Các chất được xác định nhờ giá trị thời gian lưu (là thời gian từ khi bơm mẫu đến
khi rửa giải) trên sắc kí đồ.

Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí
 Ưu điểm của phương pháp[12]
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
- Không cần làm bay hơi mẫu
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Độ nhạy cao nhờ đầu dò
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100μl)
- Dễ dàng kết hợp với khối phổ
 Nhược điểm[12]
7

- Máy móc hiện đại
- Yêu cầu phải có trình độ kĩ thuật, chuyên môn cao.
1.2.2. Detector khối phổ trong sắc kí khí [18]
* Khái niệm
Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của
các hợp chất hoá học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của
phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z).
Về bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector, nhưng là một detector
đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện, khối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa
giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng.
* Nguyên tắc hoạt động
Mẫu từ máy sắc kí khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hoá trong buồng ion
để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích
khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z. Các ion được bộ phận phát hiện thu
nhận, tín hiệu thu được chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.
 Cấu tạo
Máy khối phổ gồm có 3 bộ phận chính là: nguồn ion hoá, bộ phân tích khối và
bộ phát hiện [9].

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ
1.2.3. Ứng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm [1]
 Phân tích định tính
8

- So sánh thời gian lưu t
R
của chất phân tích với t
R
của chất chuẩn đối chiếu
trong cùng điều kiện sắc kí.
- So sánh sắc kí đồ của mẫu phân tích với sắc kí đồ của mẫu phân tích đã thêm
chất chuẩn đối chiếu.
- So sánh khối phổ của chất phân tích với chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều
kiện sắc kí và so sánh phổ khối của chất phân tích với phổ khối các chất có trong
thư viện phổ. Phương pháp này cho kết quả tin cậy nhất.
 Phân tích định lượng
Sắc kí khí có thể ứng dụng để định lượng bằng một số phương pháp như:
- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một thành phần
trong mẫu phân tích được xác định bằng tỉ số (tính theo phần trăm) giữa diện tích
pic của các thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các thành phần có mặt
trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và của các thành phần có hàm lượng
nhỏ hơn giới hạn phát hiện của chúng).
- Phương pháp ngoại chuẩn: Đường chuẩn được lập dựa trên mối tương quan
giữa các lượng chất chuẩn đối chiếu khác nhau và diện tích pic tương ứng của
chúng. Nồng độ các chất phân tích trong mẫu thử được định lượng dựa trên đường
chuẩn này.
- Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều
kiện như phân tích mẫu bình thường. Dựa trên lượng chuẩn thêm và tín hiệu các
mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính được nồng độ chất có trong

mẫu.
- Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, người ta chọn một chất
chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu. Tỷ số
diện tích của các chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng
để xây dựng đường chuẩn.
1.2.4. Ứng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu
Sắc kí khí - khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng được ứng
dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu. Mặc dù thiết bị đắt
9

tiền và tốn nhiều thời gian hơn nhưng khả năng phân tách của GC-MS là vượt trội
hơn hẳn so với các kĩ thuật phân tách khác [18].
Sự phù hợp của sắc kí khí đối với kiểm nghiệm tinh dầu: phạm vi khối lượng
hoạt động của sắc kí khí là từ 2 (phân tử H
2
) đến khoảng 1500 đơn vị khối lượng;
đồng thời các chất phải có khả năng hoá hơi tại nhiệt độ quy định. Trong khi đó
thành phần của tinh dầu chủ yếu là các terpenoid, có khối lượng phân tử khoảng
dưới 400, và rất dễ bay hơi nên đặc biệt phù hợp để sử dụng sắc kí khí phân tích
[20].
Sau khi qua cột sắc kí khí, các tinh dầu phức tạp có thể cho các pic chồng chất,
che khuất nhau, nên sẽ luôn tồn tại một tỉ lệ không chắc chắn về mức độ tinh khiết
của pic ghi chép được. Khi đó khối phổ trở nên hiệu quả vì có thể nhận ra các pic
chồng chất và xác định số lượng các thành phần tại vị trí xảy ra sự chồng chất pic
[20].
Sắc kí khí tách các cấu tử riêng biệt của tinh dầu và định lượng tổng số cấu tử
hiện diện. Xác định đặc tính thực vật của tinh dầu bằng cách so sánh sự hiện diện và
số lượng của mỗi thành phần. Sắc kí khí có thể sàng lọc các thành phần không tự
nhiên, thành phần bị khuyết, hoặc các thành phần có tỷ lệ không tự nhiên cao, có
biểu hiện pha trộn hay giả mạo. Cùng với việc kết hợp với khối phổ, GC-MS có khả

năng xác định các thành phần trong tinh dầu theo tên và phát hiện sự giả mạo[20].
Tóm lại, các loại tinh dầu thường là một hỗn hợp phức tạp của rất nhiều chất
khác nhau, trong đó có một số chất có cấu trúc hoá học tương tự nhau, đồng thời
khả năng phân tách của SKLM lại rất hạn chế, nên việc sử dụng SKLM trong kiểm
nghiệm tinh dầu gặp rất nhiều khó khăn. Do khả năng phân tách tốt các hỗn hợp
phức tạp chứa các thành phần dễ bay hơi như tinh dầu nên GC-MS có thể sử dụng
trong cả định tính, thử tinh khiết, định lượng từng thành phần cấu thành trong tinh
dầu.
1.3. Tổng quan về các dƣợc liệu nghiên cứu
1.3.1. Hoắc hƣơng (Pogostemon cablin (Blanco) Benth., Lamiaceae)
10

Từ lâu cây Hoắc hương đã được đưa trồng rộng rãi để lấy tinh dầu ở nhiều
nước Đông Nam Á, đặc biệt là ở Inđônêsia và ở Trung Quốc. Hiện nay, chúng được
trồng ở các vùng nhiệt đới như châu Á và châu Phi với qui mô lớn để lấy tinh dầu.
Những nước sản xuất Hoắc hương nhiều nhất hiện nay là Ấn Độ, Malaysia,
Philipin, Mangat, Inđônesia [11]. Ở Việt Nam, cây Hoắc hương được biết từ rất lâu
đời và được coi là một vị thuốc trong y học dân gian. Cây hiện được trồng ở khắp
các làng bản trên hầu hết các khu vực từ Bắc vào Nam. Lá Hoắc hương có chứa tinh
dầu, hàm lượng 2,2-2,6% (tính trên trọng lượng khô tuyệt đối). Nếu ủ men trước khi
cất, có thể đạt hàm lượng cao hơn [4]. Tinh dầu Hoắc hương là một hỗn hợp phức
tạp của những chất hoá học khác nhau, trong đó thành phần chính là patchouli alcol
(32-38%) - là thành phần quyết định phẩm chất tinh dầu; ngoài ra còn có chứa các
hợp chất hydrocarbon sesquiterpenic như elemen, caryophyllen, patchoulen,
guaien… Hoắc hương là vị thuốc dùng trong y học cổ truyền, tính ấm, vị cay đắng,
tác dụng vào kinh vị và đại tràng, có tác dụng giải cảm nắng, thanh nhiệt ở tỳ vị
trong trường hợp đầy bụng, ăn không tiêu, đi tả, nôn. Hoắc hương cũng là một trong
số rất ít loài cho tinh dầu có tác dụng định hương. Đây là nguồn nguyên liệu không
thể thiếu trong các kĩnh vực hương phẩm và mỹ phẩm. Tinh dầu Hoắc hương còn có
tính kháng khuẩn nên được sử dụng trong nhiều chế phẩm diệt côn trùng, nhậy.

Tinh dầu Hoắc hương là loại tinh dầu có giá trị cao trên thị trường thế giới [2], [7],
16].
1.3.2. Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Lamiaceae)
Tên gọi khác: rau tần; tần dầy lá; cần dầy lá; rau thơm lùn.
Húng chanh có nguồn gốc ở Inđônêsia, một số tài liệu lại ghi là ở Châu Phi.
Hiện chỉ gặp Húng chanh phân bố ở các khu vực thuộc vùng nhiệt đới. Đến nay,
Húng chanh đã được đưa trồng ở nhiều nước Đông Nam Á và Nam Á. Ở nước ta,
loài Húng chanh đã được đưa trồng rải rác ở nhiều địa phương từ Bắc vào Nam. Chi
Húng chanh gồm khoảng 200 loài và phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới, cận
nhiệt đới. Châu Phi được coi là trung tâm đa dạng và phong phú nhất của chi Húng
chanh. Trong hệ thực vật Việt Nam, chi Húng chanh hiện đã biết 7 loài.
11

Lá Húng chanh có chứa tinh dầu, hàm lượng từ 0,05-0,12% (tính trên nguyên
liệu tươi). Thành phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu Húng chanh ở nước ta gồm:
carvacrol (39,5-82,8%); γ-terpinen (2,3-19,0%); α-terpinen (vết-16,8%); β-
caryophyllen (2,6-5,9%); α-bergamoten (1,9-3,0%); myrcen (vết-1,9%)… Húng
chanh là cây lấy tinh dầu và được dùng làm gia vị trong chế biến thực phẩm, có tác
dụng lợi phế, trừ đờm, chữa ho, chữa cảm sốt, tiêu chảy, sát trùng hoặc đắp lên các
vết do rết và bọ cạp cắn.Tinh dầu Húng chanh có tác dụng chữa cảm, cúm, sốt cao,
sốt không ra mồ hôi được, viêm phế quản, ho, hen, ho ra máu, viêm họng, khản
tiếng, nôn ra máu, chảy máu cam. Theo những nghiên cứu gần đây, tinh dầu Húng
chanh còn có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn như Staphylococcus, Shigella
flexneri, Shiga, Streptococcus, D.pneumoniae… Hoạt tính kháng sinh mạnh này của
Húng chanh là do nhóm các chất phenolic, đặc biệt là hàm lượng cao của các hợp
chất carvacrol trong tinh dầu quyết định. Trên thị trường ngày nay, tinh dầu Húng
chanh là loại tinh dầu có giá trị rất cao, do đó cần có các phương pháp kiểm tra
thích hợp để đảm bảo chất lượng tinh dầu lưu hành trên thị trường, hạn chế sự giả
mạo [6], [8].
1.3.3. Hƣơng nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae)

Tên khác: É lớn lá; hương nhu.
Hương nhu trắng được gieo trồng và mọc tự nhiên ở nhiều nước nhiệt đới và
cận nhiệt đới. Nguồn gốc của Hương nhu trắng là vùng nhiệt đới ở Châu Phi. Cây
Hương nhu trắng được trồng ở nhiều nơi trên thế giới: Liên Bang Nga, Ấn Độ, Sri
Lanka. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi. Hương nhu trắng có
chứa 0,78-1,38% tinh dầu (hoa 2,77%; lá 1,38%; toàn cây 1,14%, tính trên trọng
lượng khô tuyệt đối). DĐVN IV quy định, dược liệu phải chứa ít nhất 1% tinh dầu.
Thành phần hoá học tinh dầu Hương nhu trắng rất đa dạng, trong đó eugenol là chất
chính (60-70%), DĐVN IV quy định hàm lượng eugenol không dưới 60%; ngoài ra
trong tinh dầu còn có D-germacren (8,8%), β-ocimen (7%)… Hương nhu trắng là
nguồn nguyên liệu cất tinh dầu để tách eugenol dùng trong nha khoa và tổng hợp
vanillin. Tinh dầu Hương nhu còn là nguyên liệu để làm dầu cao xoa xuất khẩu.
12

Hương nhu trắng còn được dùng làm thuốc chữa cảm mạo nhức đầu, xông cho ra
mồ hôi, chữa lở miệng, đau bụng. Hương nhu trắng cũng có tác dụng chống viêm,
giảm đau và hạ nhiệt… Tinh dầu Hương nhu trắng có thể được dùng thay thế cho
một số loại tinh dầu khác có chất lượng cao hơn và giá trị hơn (tinh dầu đinh hương
và xạ hương) [3], [7].
1.3.4. Hƣơng nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae)
Tên khác: É đỏ, é tía, é rừng.
Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới, châu Á, được trồng rải rác ở Trung
Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm gia vị. Ở Việt Nam, Hương nhu tía mới
được trồng hạn chế trong vườn các gia đình hoặc các cơ sở chữa bệnh theo y học cổ
truyền. Phần trên mặt đất có chứa tinh dầu - đây là phần đáng chú ý và có giá trị cao
trong cây. Theo DĐVN IV, dược liệu phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu (tính theo
dược liệu khô tuyệt đối) [3]. Về thành phần hoá học, tinh dầu Hương nhu tía Việt
Nam chứa các thành phần chính là eugenol (trên 70%), methyl eugenol (trên 12%)
và β-caryophyllen. Hương nhu tía mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian để
chữa cảm sốt, đau bụng đi ngoài, nôn mửa, cước khí, thuỷ thũng. Tinh dầu Hương

nhu tía thể hiện tác dụng tốt trong điều trị nấm Candida [19]. Ở nước ta, tinh dầu
Hương nhu tía chưa được khai thác, sử dụng nhiều.
1.3.5. Tràm Úc (Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae)
Tên khác: Tràm lá hẹp, dầu trà.
Có nguồn gốc từ Australia, được Viện Dược liệu di thực vào nước ta từ năm
1986. Lá Tràm Úc có chứa tinh dầu, thành phần hoá học chính của tinh dầu Tràm
Úc trồng ở Việt Nam gồm: terpinen-4-ol; terpinolen; 1,8-cineol… Tinh dầu Tràm
Úc được sử dụng nhiều trong Y tế, làm thuốc chữa các bệnh về đường hô hấp, thần
kinh suy nhược, phong thấp, phù thũng… Ngoài ra, tinh dầu Tràm Úc còn có tác
dụng sinh học kháng khuẩn và nấm nên được sử dụng để chữa các bệnh nhiễm
trùng, bỏng, lở miệng, vết nứt, vết trầy teo lợi, hoại thư, bệnh lậu, nấm da chân…
Tinh dầu Tràm Úc không gây kích ứng da ngay ở liều lượng cao. Tinh dầu Tràm Úc
là loại tinh dầu rất quý [13], [14].
13

1.3.6. Tràm lá dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae)
Tên khác: Khuynh diệp, chè đồng, chè cay.
Tràm mọc nhiều ở vùng đồi núi, và đầm lầy của nhiều nước Đông Nam Á:
Inđônêsia, Việt Nam, Philipin, Myanmar, Malaysia, Campuchia. Ở Việt Nam, Tràm
mọc ở cả hai miền Bắc và Nam nhưng tập trung nhiều ở các tỉnh phía Nam: Quảng
Bình, Long An, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang… Lá Tràm có chứa tinh dầu.
Hàm lượng tinh dầu thay đổi theo từng vùng và theo mùa ở các tỉnh miền Trung.
DĐVN IV quy định hàm lượng tinh dầu Tràm không dưới 1% (tính trên nguyên liệu
khô tuyệt đối). Thành phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu Tràm là 1,8-cineol (20-
60%); và các hợp chất khác có hàm lượng đáng kể như: sesquiterpen, alcol globulol,
spathuleol, ngoài ra còn có một số thành phần khác với hàm lượng nhỏ như:
limonen; β-caryophyllen… Lá Tràm có tác dụng kháng khuẩn, giải cảm và giảm
đau nên được dùng để điều trị các vết thương, vết bỏng, cảm lạnh, cúm và ăn khó
tiêu. Lá Tràm đôi khi còn được sử dụng làm chè uống thay nước giúp tiêu hoá, chữa
ho hoặc xông giải cảm. Tinh dầu Tràm và cineol có tác dụng sát khuẩn đường hô

hấp, kích thích trung tâm hô hấp, chữa viêm nhiễm đường hô hấp. Tinh dầu Tràm
còn có tác dụng kháng khuẩn, làm lành vết thương, chữa bỏng, làm chóng lành da
[3], [7], [21].











14

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT
Tên
Việt
Nam
Tên khoa học
Bộ phận
dùng
Nơi thu mẫu
Thời gian thu

mẫu
1
Hoắc
hương
Pogostemon
cablin
(Blanco)
Benth.,
Lamiaceae
Lá tươi
Lá khô
Lá ủ
Nghĩa Trai - Văn
Lâm - Hưng Yên
18/02/2014
2
Húng
chanh
Plectranthus
amboinicus
(Lour.)
Spreng,
Lamiaceae
Lá tươi
Hà Nội
24/02/2014
3
Hương
nhu
trắng

Ocimum
gratissimum
L., Lamiaceae
Lá tươi
Trung tâm trồng và
chế biến cây thuốc
Hà Nội, Viện Dược
liệu
20/08/2013
4
Hương
nhu tía
Ocimum
tenuiflorum
L., Lamiaceae
Lá tươi
Trung tâm trồng và
chế biến cây thuốc
Hà Nội, Viện Dược
liệu
20/08/2013
5
Tràm
Úc
Melaleuca
alternifolia
(Maiden
Betche)
Cheel,
Myrtaceae

Lá tươi
Trung tâm trồng và
chế biến cây thuốc
Hà Nội, Viện Dược
liệu
26/08/2013
6
Tràm lá
dài
Melaleuca
cajuputi
Powell,
Myrtaceae
Lá tươi
Trung tâm trồng và
chế biến cây thuốc
Hà Nội, Viện Dược
liệu
26/08/2013
15

Các mẫu dược liệu sau khi thu hái được giám định tên khoa học tại Bộ môn
Thực vật, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản cây
thuốc (HNIP) - Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục I và phụ lục II).
2.1.2. Hoá chất:
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
- Các dung môi: ether dầu hoả, n-hexan, toluen, ethyl acetat, chloroform.
- Thuốc thử: Vanillin-acid sulfuric gồm 2 dung dịch
+ Dung dịch 1: Vanillin 1% pha trong ethanol
+ Dung dịch 2: Acid sulfuric 10% pha trong ethanol

Trộn dung dịch 1 với dung dịch 2 theo tỉ lệ 1:1 (tt/tt) ngay trước khi sử dụng.
Sau khi phun, bản mỏng được sấy ở 110°C trong 5 phút để hiện màu.
2.1.3. Thiết bị
- Máy xác định độ ẩm SATORIUS.
- Cân kĩ thuật Precisa (Switzerland).
- Tủ sấy SHELLAB (Đức).
- Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến.
- Sắc ký lớp mỏng: sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck).
- Sắc kí cột: chất nhồi cột là silicagel pha thường, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm
(Merck).
- Hệ thống SKLM Camag Linomat 5.
- Hệ thống SKK Agilent 7890A kết hợp khối phổ Agilent 5975C.
- Pipet, ống đong, ống nghiệm thuỷ tinh…
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu.
- Phân lập các thành phần chính trong các mẫu tinh dầu để làm chất đối chiếu,
định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM.
- Định tính các mẫu tinh dầu nghiên cứu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp
khối phổ.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
16

2.3.1. Chiết xuất và xác định hàm lƣợng tinh dầu bằng phƣơng pháp cất kéo
hơi nƣớc [2]
Tinh dầu từ các mẫu dược liệu nghiên
cứu được chiết xuất và định lượng bằng
phương pháp cất kéo hơi nước sử dụng bộ
dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến (Hình
2.1)
Cách tiến hành: Cân chính xác tới

0,01g một lượng dược liệu (đã được chia
nhỏ qua rây số 2000) cho vào bình cất.
Thêm 300 đến 500ml nước cất. Lắp dụng
cụ. Đun bình cho đến sôi, sau đó nếu
không có chỉ dẫn gì khác thì điều chỉnh tốc
độ cất sao cho cất được 2 – 3ml dịch cất
trong 1 phút. Cất cho đến khi thể tích tinh
dầu thu được không tăng thêm nữa. Ngừng
cất, sau ít nhất 10 phút đọc thể tinh dầu cất
được trong ống hứng.
Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu
được tính theo công thức:

Trong đó: X: Hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g)
a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml)
b: Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g)
Sau khi thu được tinh dầu, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó bảo quản
tinh dầu trong lọ thuỷ tinh sẫm màu.
2.3.2. Phân lập chất đối chiếu bằng phƣơng pháp sắc kí cột
Bộ phận hứng tinh dầu
nhẹ hơn nước
Bộ phận hứng tinh dầu
nặng hơn nước
Hình 2.1. Bộ dụng cụ
định lượng tinh dầu cải tiến