Xây dựng phương pháp chiết xuất piperin từ hồ tiêu

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







V CHIN THNG


XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIT
XUẤT PIPERIN TỪ HỒ TIÊU



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013


BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






V CHIN THNG



XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIT
XUẤT PIPERIN TỪ HỒ TIÊU


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện:
Bộ môn công nghiệp Dược

HÀ NỘI – 2013





MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về piperin 2
1.1.1. Cấu tạo hóa học, tính chất piperin 2
1.1.2. Tác dụng sinh học của piperin 3
1.1.3. Sản phẩm piperin trên thị trường………………………………… 5
1.2. Tổng quan về hồ tiêu 5
1.2.1. Đăc điểm thực vật 5
1.2.2. Phân bố, trồng hái và chế biến 6
1.2.3. Bộ phận dùng…………………………………………………… 8
1.2.4. Thành phần hóc học 8
1.2.5. Các sản phẩm hồ tiêu trên thị trường…………………………… 9
1.2.4.Tác dụng, công dụng 11
1.3. Một số nghiên cứu chiết xuất pipein từ hồ tiêu 11
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….15
2.1. Nguyên liệu và thiết bị 15
2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 15
2.1.2. Máy móc, thiết bị 15

2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Lựa chọn dung môi 16
2.2.2. Khảo sát tinh chế bằng phương pháp sử dụng dung dịch NaOH/ethanol
96% 16


2.3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1 Phương pháp chiết xuất 16
2.3.2. Phương pháp định lượng piperin 17
2.3.3. Các phương pháp tinh chế 19
2.3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 19
CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. Xác định hàm lượng piperin trong dược liệu……………………… 20
3.2. Lựu chọn dung môi chiết 21
3.3. Tinh chế piperin 23
3.3.1. Phân lập piperin…………………………………………………… 23
3.3.1.1. Xác định nồng độ dung dịch NaOH/ethanol 96% 24
3.3.1.2 Xác định thể tích dung dịch NaOH10%/ ethanol 96% 25
3.3.2. Tinh chế piperin thô thu sản phẩm ………………………………… 26
3.4. Chiết xuất piperin quy mô 700g/mẻ………………………………… 28

KT LUẬN VÀ KIN NGHỊ 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp chiết xuât
piperin từ hồ tiêu ”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết
mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía nhà trường,
thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Văn Hân
người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Tổ
chiết xuất – Bộ môn công nghiệp Dược – trường Đại học Dược Hà Nội, đã hỗ
trợ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc
biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại
trường.
Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về
mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động
lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Vũ Chiến Thắng

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIT TT

DD dung dịch
DL dược liệu
IPA isopropanol
PP phương pháp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Bảng so sánh hiệu quả chiết của dung môi aceton và ethanol
96% 22
Bảng 3.2: Hiệu quả phân lập piperin của các dung dịch natrihydroxyd có nồng
độ khác nhau……………………………………………………………… . 24
Bảng 3.3: Hiệu quả phân lập piperin của các dung dịch natrihydroxyd 10%/
ethanol 96% với các thể tích khác nhau…………………………………… 25
Bảng 3.4: Hiệu suất và độ tinh khiết của piperin kết tinh từ các dung môi khác
nhau………………………………………………………………… 27
Bảng 3.5: Hiệu suất và độ tinh khiết của piperin của 3 mẻ chiết………… 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1: Đặc điểm thực vật của piper nigrum.L…………………………… 6
Hình 1.2: Hình ảnh hồ tiêu đen và hồ tiêu sọ……………………………… 7
Hình 3.1
: Sắc ký đồ của mẫu dược liệu……………………………………. 20
Hình 3.2 : Sắc ký đồ của piperin chuẩn…………………………………… 20
Hình 3.3 : Hình ảnh sắc ký lớp mỏng của các dung dịch chiết…………… 22
Hình 3.4: Hình ảnh sản phẩm piperin tinh khiết bằng cách tinh chế piperin thô
từ 3 dung môi khác nhau…………………………………………………… 28
Hình 3.3 : Sơ đồ quy trình chiết suất piperin từ hồ tiêu…………………… 29












1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Piperin là một alcaloid có nhân piperidin. Piperin có trong các cây thuộc
họ hồ tiêu. Hàm lượng piperin có ở một số cây như: khoảng 6% đến 9%
trong Piper nigrum.L (hồ tiêu), 4% trong Piper longum.L (tiêu lá tím) và 4,5
% trong piper retrofractum Vahl.

Piperin ngày càng được dùng nhiều trong ngành dược. Piperin làm tăng
khả năng hấp thu của nhiều chất do đó thường được kết hợp để làm tăng sinh
khả dụng của các thuốc. Piperin còn có tác dụng chống oxy hóa, ức chế tế bào
ung thư.
Trong những năm gần đây nhu cầu sử dụng piperin ngày càng tăng
nhưng nguồn nguyên liệu trong nước chưa đáp ứng được. Việt Nam là nước
có nguồn nguyên liệu lớn nhất thế giới, luôn đứng đầu về sản xuất và xuất
khẩu hồ tiêu trên thế giới. Hạt tiêu Việt Nam được xuất khẩu đến gần 80 nước
và vùng lãnh thổ, chiếm 50% sản lượng xuất khẩu toàn cầu hạt tiêu. Do đó
Việt Nam hoàn toàn có thể chủ động trong nguồn nguyên liệu sản xuất
piperin. Hiện nay trong nước đã có các nghiên cứu về chiết xuất piperin
nhưng vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào được công bố. Trước yêu
cầu cấp bách đó, nhằm góp phần nghiên cứu quy trình chiết xuất piperin từ hồ
tiêu, chúng tôi tiến hành đề tài : “Xây dựng phương pháp chiết xuất piperin
từ hồ tiêu” với những mục tiêu sau :
1. Lựa chọn được dung môi chiết thích hợp.
2. Xây dựng được phương pháp đơn giản, hiệu quả để tinh chế
piperin.





2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về piperin
1.1.1 Công thức hóa học, tính chất của piperin
Công thức cấu tạo:
O
O
N
O

Tên khoa học:
(2E, 4E)-5-(1,3-benzodioxol-5yl)-1-piperidin-1-yl penta-2,4-dien-1-one
Tên khác: 1-piperoylpiperidin
Công thức phân tử: C
17
H
19
NO
3

Khối lượng phân tử: 285.34 g/mol.
Tính chất:
Lý tính:
• Thể chất: Piperin là một chất kết tinh hình kim, màu vàng nhạt.
• Mùi vị: không mùi, vị rất cay (pha loãng 1/200 000 vị còn cay).
• Độ tan: hầu như không tan trong nước (40mg/l ở 18
o
C), tan trong ethanol
tuyệt đối (1 gam piperin tan trong 15ml alcohol), tan tốt trong methanol, 1
gam piperin tan trong 1,7ml chloroform, 36 ml ether, tan trong benzen và acid
acetic băng.

• Nhiệt độ nóng chảy: 130 °C.
• Dung dịch piperin trong ethanol 96
o
có cực đại hấp thụ 342-345 nm [5].
Hóa tính :
• Piperin có tính base yếu, pK
a
= 12,22 ở 18
o
C.


3
1.1.2 Tác dụng sinh học của piperin.
Piperin đã được nghiên cứu từ rất sớm và tìm ra được nhiều tác dụng:
Piperin kích thích hoạt động của trypsin và chymotrypsin, làm tăng tiết
acid mật, tăng hoạt động của lipase tụy, piperin có tác dụng kích thích tiêu
hóa.
Piperin ức chế khối lượng dịch vị, độ acid dạ dày và pepsin. Do đó,
piperin có tác dụng bảo vệ, chống viêm loét dạ dày [18].
Piperin có tác dụng chống co thắt do chặn kênh canxi [19].
Piperin còn là một chất điều trị một số bệnh ung thư. Do piperin ức chế
các cytokin chuyên được sản xuất khối u và ức chế các tín hiệu hoặc thông tin
liên lạc giữa các tế bào ung thư, làm chậm sự tăng trưởng của khối u trong
ung thư [14].
Piperin tác dụng chống oxy hóa do làm giảm mức độ peoroxy hóa lipid
và sự hình thành gốc tự do với sự gia tăng đồng thời các hoạt động của các
chất chống oxy hóa ezym (superoxyd dismutase, catalase và glutathion
peroxidase) và chất chống oxy hóa không enzym (vitamin E và vitamin C)
[18].

Piperin ức chế được các enzym tham gia vào chuyển hóa sinh học của
nhiều thuốc. Tham gia vào phản ứng giáng hóa thuốc hay còn gọi là phản ứng
pha I (như phản ứng oxy hóa thuốc qua sự xúc tác của cytochrom P450) [18].
Piperin tham gia vào phản ứng pha II (còn gọi là phản ứng liên hợp) kết
quả của tác động của piperin trên hai pha này là làm tăng tích lũy của các
thuốc, giúp đào thải chậm, làm tăng hiệu lực, có khi tăng độc tính. Do đó
piperin làm tăng sinh khả dụng của nhiều thuốc. Chính vì vậy piperin có
tương tác với nhiều thuốc như: thuốc chống lao isoniazid, pyrazinamid và
rifampicin, thuốc chống hen theophyllin . Hàm lượng isoniazid tăng gấp 5
lần so với dùng isoniazid đơn độc, tốc độ hấp thu cũng nhanh hơn. Hàm


4
lượng pyrazinamid chậm hơn rõ rệt khi dùng cùng piperin. Piperin làm giảm
đào thải rifampicin. Phối hợp piperin với thuốc chống hen theophylin thấy
nồng độ đỉnh của theophylin cao gấp 1,5 lần so với khi dùng đơn độc [9],
[18], [20].
Piperin có tác dụng tăng hấp thu và giảm đào thải curcumin trong máu
rõ rệt. Việc hết hợp với piperin với curcumin đã tăng được sinh khả dụng của
curcumin trên cơ thể người lên tới 20 lần so với không dùng piperin [16].
Sự kết hợp giữa piperin và curcumin không phải là một trường hợp
riêng biệt, piperin còn cải thiện việc hấp thu nhiều phân tử khác có mặt trong
thức ăn, đặc biệt như: chất β-caroten (tiền vitamin A), selenium, phân tử (-)-
Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) chống ung thư chính có mặt trong trà
xanh . Với beta-carotene, piperin phối hợp làm tăng hàm lượng beta-carotene
trong huyết thanh sau 14 ngày dùng phối hợp. Piperin làm tăng hàm lượng
selen, vitamin C , vitamin B6 sau 2 và 6 ngày phối hợp [8], [18].
Piperine có tác dụng chống viêm và chống thấp khớp thông qua việc ức
chế sản phẩm của hai tiền cytokinine viêm quan trọng là IL6 (interleukine - 6)
và PGE2 (prostaglandin - E2) trong sự tăng sinh nguyên bào sợi. Việc ức chế

sản phẩm PGE2 là rất quan trọng do PGE2 đóng vai trò trung tâm trong quá
trình gây viêm [13].
Piperin gây độc ở liều cao, piperin tiêm bắp thỏ và chuột bạch hoặc cho
hít với liều cao thì sau một thời gian kích thích ngắn, có hiện tượng thở nhanh
lên, chân sau tê liệt rồi mê hoàn toàn, co quắp, chết do ngừng thở. Giải phẫu
thi thể, phủ tạng đều có hiện tượng xuất huyết [19].
1.1.3. Sản phẩm piperin trên thị trường.
Hiện nay piperin có mặt trong thành phần của rất nhiều sản phẩm trên
thị trường. Piperin trong các loại thực phẩm chức năng : kết hợp với curcumin
giúp hỗ trợ và điều trị những bệnh như ung thu, viêm loét dạ dày, viêm gan,


5
lõa hóa (Biocurmin, Bioperin ); kết hơp với cao khô tật lê giúp bổ thận tráng
dương tăng cường sinh lý cho nam giới, hạn chế lão hóa.
1.2 Tổng quan về hồ tiêu.
1.2.1 Đặc điểm thực vật.
Hồ tiêu có tên khoa học: Piper nigrum.L Họ: Piperaceae
Tên khác: hạt tiêu, cổ nguyệt, hắc cổ nguyệt, bạch cổ nguyệt.
Hồ tiêu là một loại cây leo, thân dài, nhẵn bám vào các cây tựa bằng
những rễ.
Thân mang lá mọc cách. Lá
giống lá trầu không nhưng dài và
thuôn hơn. Có hai loại nhánh: một
loại nhánh mang quả, một loại nhánh
mang dinh dưỡng cả hai loại nhánh
đều xuất phát từ kẽ lá.
Cụm hoa hình đuôi sóc, mọc đối lá,
khi chín rụng cả chùm.
Quả hình cầu nhỏ, có chừng 20-

30 quả trên một chùm, lúc đầu màu
xanh lục, sau có màu đỏ, khi chín có
màu vàng [3].


Hình 1.1: Đặc điểm thực vật của
Piper nigrum.L

1.2.2 Phân bố , trồng hái và chế biến.
Phân bố : hồ tiêu được trồng ở các nước vùng nhiệt đới. Các nước cung
cấp nhiều hồ tiêu bao gồm: Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Philipin, Cambodia,
Brazil, Việt Nam.
Ở Việt Nam hồ tiêu được phân bố thành các vùng sản xuất chính ở Bắc
Trung Bộ, Duyên hải Trung Bộ, Tây Nguyên, vùng Đông Nam Bộ và Đồng


6
bằng Sông Cửu Long, trong đó Tây Nguyên và Đông Nam Bộ là 2 vùng sản
xuất chính. Sản xuất hồ tiêu thường hình thành những vùng nổi tiếng như :
Tân Lâm ( Quảng Trị ), Lộc Ninh (Bình Phước), Bà Rịa ( Bà Rịa-Vũng Tàu),
Phú Quốc (Kiên Giang), Dak R`Lấp (Dak Nông), Chư Sẻ (Gia Lai).
Trồng hái và chế biến: Hồ tiêu trồng bằng cách giâm cành hoặc bằng hạt.
Người ta thường thu hái quả từ năm thứ 4, hiệu suất cao nhất vào năm thứ 7, 8.
Tùy theo người ta muốn có hồ tiêu đen hay hồ tiêu sọ (hồ tiêu trắng)
mà cách thu hái chế biến có khác nhau.
Để có hồ tiêu đen, người ta hái vào lúc thấy có một vài quả đỏ hay vàng
trên chùm quả, nghĩa là đa số quả còn xanh. Những quả non chưa có sọ khi
phơi khô sẽ giòn dễ vỡ vụn ra. Còn những qua khác khi phơi khô vỏ sẽ nhăn
nheo lại, màu ngả đen do đó có tên là hồ tiêu đen.
Sản lượng: Năng suất và sản lượng hồ tiêu của Việt Nam tăng nhanh kể

từ năm 1975. Năm 1975, Việt Nam chỉ mới 500ha tiêu đạt sản lượng là 460
tấn, gần như chưa được biết đến trên thị trường xuất khẩu hồ tiêu. Năm 1996
Việt Nam đã sản xuất được khoảng 7.000 tấn. Năm 2001 đã sản xuất và xuất
khẩu đạt 60.000 tấn. Năm 2002 sản lượng và xuất khẩu đạt 70.000 tấn và đã
đứng thứ hai sau Ấn Độ ( Ấn Độ sản xuất khoảng 80.000 tấn vào năm nay ).
Bắt đầu từ năm 2003 thì Việt Nam vượt qua Ấn Độ và trở thành nước số một
về sản xuất và xuất khẩu hồ tiêu [6].

Hình 1.2: Hình ảnh hồ tiêu đen và hồ tiêu sọ


7
Để có hồ tiêu sọ phải hái vào lúc quả đã thật chín, sau đó loại vỏ ngoài
bằng cách chà xát hoặc đem ngâm dưới vòi nước chảy 3-4 ngày, xát để loại
hết vỏ đen rồi phơi khô. Loại này có màu trắng ngà, ít nhăn nheo hơn, ít thơm
hơn (vì lớp vỏ ngoài có chứa tinh dầu đã bị loại đi) nhưng cay hơn.
1.2.3 Bộ phận dùng.
Quả xanh còn vỏ ngoài : hồ tiêu đen, là 1 quả mọng, khô, hình cầu,
đường kính 4-5 cm, màu đen nhạt hay màu thẫm, nhăn nheo.
Quả chín loại vỏ: hồ tiêu trắng, trông ít nhăn nheo hơn, màu trắng ngà,
cắt dọc chỉ thấy vỏ trong và hạt.
1.2.4 Thành phần hóa học.
Trong hồ tiêu có:
Tinh dầu: 1,2 - 3,5% trong hồ tiêu đen và 1,2 – 2,5% trong hồ tiêu
trắng, tinh dầu màu vàng nhạt hay màu lục nhạt, thành phần chính của tinh
dầu là α và β - pinen sabinen, caren limonen.
Alcaloid: 2 – 5 %, trong đó chủ yếu là piperin (chiếm 90 – 95%) có vị
cay (pha loãng 1/200 000 còn vị cay). Piperin khi thủy phân sẽ cho piperidin
và acid piperic. Chavicin là đồng phân (dạng cis-cis) của piperin cũng có vị
cay, khi thủy phân sẽ cho piperidin và acid chavicic. Còn có một lượng nhỏ

các chất piperettin, piperylin và piperolein A, piperolein B ít cay hơn [3].
O
O
N
O

N
O
O
O

Piperin Piperolein


8

N
O
O
O

O
O
N
O

Piperylin Piperolein B


O

O
O
O
O
H
H
OH

N
(CH=CH)
3
O
O
O

(-) Cubelin Piperettin
O
O
CO
OH

Acid piperic
Ngoài ra trong hồ tiêu còn có cubelin không có vị cay, chất béo và tinh bột

1.2.5 Các sản phẩm hồ tiêu trên thị trường:
Sản phẩm hồ tiêu thông dụng trên thị trường thế giới là tiêu đen và tiêu
trắng. Ngày nay nhiều loại sản phẩm có giá trị đã được phát triển thêm từ hồ
tiêu. Có sản phẩm dùng nguyên liệu hồ tiêu lép, là loại tiêu có phẩm chất kém
được dùng để sản xuất ra dầu tiêu. Có rất nhiều loại sản phẩm từ hồ tiêu trên
thị trường thế giới:

9
Tinh dầu tiêu: là tinh dầu bay hơi, được chiết xuất từ quả tiêu bằng
phương pháp chưng cất hơi nước. Đó là một hỗn hợp lỏng tự nhiên, trong
suốt, có màu xanh vàng đến hơi xanh lá cây.
Oleoresin tiêu: còn gọi là dầu nhựa tiêu, là hỗn hợp tinh dầu, nhựa, và
piperine. Dầu nhựa tiêu có đầy đủ các đặc trưng về hương vị thơm cay của
tiêu.
Tiêu bột: hạt khô được nghiền ở các kích cỡ khác nhau tùy theo yêu cầu
của người tiêu thụ.
Tiêu xanh ngâm nước muối : tiêu xanh ngâm nước muối được chế biến
từ quả tiêu chưa chín. Sau khi hái, tách cẩn thận quả tiêu, tránh làm vỡ dập
hạt. Các hạt tiêu được ngâm trong dung dịch giấm và muối được giữ ở màu
xanh tự nhiên và thể chất giòn, xốp của hạt tiêu xanh.
Tiêu xanh khử nước: Xử lý hạt tiêu xanh bằng nhiệt độ cao để làm vô
hiệu sự hoạt động của các enzym làm hạt tiêu hóa nâu đen nhờ vậy giữ được
lại màu xanh tự nhiên như khi thu hái. Sau khi ngâm vào nước, hạt tiêu sẽ
phục hồi lại hình dạng và màu sắc giống hạt tiêu xanh khi thu hái.
Tiêu xanh cải tiến: để khắc phục nhược điểm về thể chất và hương vị của
tiêu xanh khử nước, hạt tiêu xanh được rửa sạch trong nước, bước tiếp theo là
đem ngâm trong nước muối 2-3 tháng, xả nước và đóng gói thu được sản
phẩm.
Tiêu xanh đông khô : chế biến bằng cách làm khô hạt tiêu xanh đến độ
ẩm 4% ở nhiệt độ 30-40
0
C trong điều kiện chân không.Vì quá trình chế đòi
hỏi máy móc phức tạp nên sản phẩm tiêu xanh đông khô có giá trị rất đắt.
Tiêu đỏ : khi tiêu chín hoàn toàn, màu của quả tiêu chuyển từ màu xanh
sang màu đỏ. Để chế biến tiêu đỏ, thu hái tiêu khi có nhiều quả tiêu trên chùm

quả đã chín đỏ. Các quả này được tách cẩn thận ra khỏi chùm quả. Các quả
còn lại ủ lại 2-3 ngày cho tới khi chuyển sang màu đỏ thì chế biến thành tiêu


10
đỏ. Các quả tiêu đỏ sau khi được tách ra phải chế biến ngay trong ngày. Quả
tiêu được ngâm với dung dịch nước muối hay muối và giấm, cùng với chất
bảo quản. Sau đó có thể khử nước theo quy trình khử nước của tiêu xanh.
Ngoài ra còn có các sản phẩm khác được chế biến từ tiêu như trà tiêu,
kẹo tiêu, dầu thơm tiêu, tiêu dùng cho hương liệu mỹ phẩm…[6].
1.2.6. Tác dụng, công dụng.
Hồ tiêu với liều nhỏ tăng tiết dịch vị , dịch tụy, kích thích tiêu hóa làm
ăn ngon. Nhưng liều cao sẽ kích thích niêm mạc dạ dày, gây sung huyết và
gây viêm cục bộ, gây sốt, gây viêm tiết niệu, tiểu tiện ra máu.

Ngoài công dụng làm gia vị, hồ tiêu được dùng làm thuốc kích thích
tiêu hóa, giảm đau (chữa đau răng), chữa đau bụng, tiêu chảy, cảm
lạnh….Ngày dùng 1 -3 g dưới dạng bột hay viên, thường phối hợp với một số
vị thuốc khác.
Hồ tiêu còn có tác dụng sát khuẩn, diệt ký sinh trùng, do đó người ta còn
dùng hồ tiêu để bảo vệ quần áo [3].

1.3 Một số nghiên cứu chiết xuất piperin từ hồ tiêu.
Raphael Ikan (1991) chiết xuất piperin từ hồ tiêu bằng ethanol 96%.
Dịch chiết cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn. Hòa cắn vào dung
dịch 10% kali hydroxyd 10% trong ethanol 96%, lọc trong rồi thêm nước để
kết tủa piperin. Piperin được tinh chế bằng cách tẩy màu và kết tinh lại trong
ethanol [11].
William W. Epstein (1993) chiết xuất piperin bằng dicloromethan và
tinh chế bằng kết tinh trong ether: bột hồ tiêu được đun hồi lưu 20 phút trong

dung môi dicloromethan. Dịch chiết được lọc và cô đặc, thu được cắn dạng
đặc sánh màu nâu. Hòa cắn vào diethyl ether nóng rồi để lạnh thu được
piperin kết tinh. Tinh chế lại piperin bằng cách kết tinh trong hỗn hợp dung
môi aceton – n-hexan (3:2) [10]. Cũng với phương pháp này, Trần Thị Quỳnh


11
Nga (2010) tiến hành chiết xuất piperin ở Việt Nam, đạt được hiệu suất 2,18%
[6].
Piperin còn được chiết từ hồ tiêu bằng dung dịch các chất trợ tan
(hydrotropic), như dung dịch natri alkyl benzen sulfonat và natri butyl
monoglycol sulfat. Bột hồ tiêu được chiết với dung dịch các chất trợ tan với
nồng độ 3 mol/L ở nhiệt độ phòng. Kết tủa piperin từ dịch chiết bằng cách
pha loãng dịch chiết với nước đến nồng độ dưới MHC (minimum hydrotrop
concentration)
. Phương pháp cho hiệu suất khá cao, trên 80% và sản phẩm
piperin có hàm lượng trên 90% [10].
Niranjan Kanaki (2008) đề xuất phương pháp chiết xuất piperin bằng
acid acetic băng. Sau đó, dịch chiết được pha loãng với nước. Piperin được
chiết lại và kết tinh bằng cloroform rồi tinh chế bằng kết tinh trong hỗn hợp
cloroform và diethyl ether [10].
Lại Thị Nhung (2011) chiết xuất piperin bằng aceton. Dịch chiết được
cất thu hồi aceton đến cắn và phân lập piperin bằng 4 phương pháp:
Phương pháp 1: Hòa cắn chiết bằng dung dịch HCl 5%, lọc bỏ tạp không
tan, lắc dung dịch với dicloromethan để loại tạp. Sau đó kết tủa piperin bằng
dung dịch Na
2
CO
3
bão hòa. Tinh chế piperin bằng cách tẩy màu và kết tinh lại

trong ethanol 96%. Hiệu suất đạt 11,76%.
Phương pháp 2: Cắn chiết được hòa vào acid acetic băng. Lọc lấy dịch
trong. Thêm nước dần dần sẽ xuất hiện lớp nhựa ở dưới. Gạn bỏ lớp nhựa,
tiếp tục thêm nước để kết tủa piperin. Tinh chế piperin bằng cách tẩy màu và
kết tinh lại trong ethanol 96%. Hiệu suất 40,9%.
Phương pháp 3: Hòa cắn chiết vào dicloromethan, lọc. Vừa khuấy vừa
nhỏ từ từ n- hexan vào dịch lọc để kết tủa piperin thô. Tinh chế piperin bằng
cách tẩy màu và kết tinh lại trong ethanol 96%. Hiệu suất 30,6%.


12
Phương pháp 4: Hòa cắn chiết vào, vừa khuấy vừa thêm nước để kết
tủa piperin thô. Tinh chế piperin bằng cách tẩy màu và kết tinh lại trong
ethanol 96%. Hiệu suất 45,8% [7].
Piperin đã được nghiên cứu chiết xuất từ hồ tiêu bằng nhiều dung môi,
nhưng chưa có nghiên cứu nào so sánh hiệu quả chiết xuất của các dung môi
đó. Phương pháp phân lập piperin từ cắn chiết bằng dung dịch NaOH 10%/
ethanol 96% là phương pháp hiệu quả và dễ thực hiện, nhưng các thông số
của phương pháp chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Do vậy, chúng tôi
tiếp tục khảo sát phương pháp chiết xuất piperin để tìm ra các thông số chiết
xuất và tinh chế phù hợp.



13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1.Nguyên liệu
Hồ tiêu sọ thu mua ở thị trường Hà Nội

Hóa chất :
TT
Tên hóa chất
Tiêu chuẩn, nguồn gốc
1
Ethanol 96%
Việt Nam
2
Aceton
P, Trung Quốc
3
Isopropanol
P, Trung Quốc
4
Methanol
P, Trung Quốc
5
Methanol
HPLC, Merck
6
Nước cất
Việt Nam
7
Piperin chuẩn
98,0%, Viện kiểm nghiệm

2.1.2. Máy móc, dụng cụ
Máy móc
• Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức).
• Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ).

• Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ).
• Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S (Đức).
• Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức)
• Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), bao gồm: bộ
phân loại khí DGU – 14A, bơm cao áp LC – 10ADVP, buồng chứa cột
CTO – 10AVP, bộ điều khiển SCL – 10AVP, detector dãy diod quang
SPD – M10AVP và phần mềm Class vp 6.14
• Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ – Melt (Mỹ).


14
• Bếp cách thủy.
• Tủ sấy MEMMERT (Đức)
Dụng cụ:
• Bình cầu
• Đũa thủy tinh, phễu lọc Buchner.
• Cốc thủy tinh loại 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL
• Bình định mức 10mL, 25mL, 50mL, 100mL
• Pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL
• Ống đong 10mL, 300mL, 500mL
• Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius)
• Bản mỏng silicagen GF
254
70-230 mesh.
2.2 Nội dung nghiên cứu.
2.2.1 Lựa chọn dung môi chiết
Nhằm chọn lựa dung môi có khả năng hòa tan piperin, dễ kiếm, có thể
thu hồi và ít độc hại. Piperin tan được trong methanol, ethanol, aceton,
dicloromethan…. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát 2 dung môi sau :
aceton, ethanol 96% là những dung môi ít độc.

Các tiêu chí so sánh gồm hiệu suất chiết, tính chọn lọc.
2.2.2 Khảo sát tinh chế piperin bằng phương pháp sử dụng dung dịch
NaOH / ethanol 96%
Sau khi tìm được dung môi chiết thích hợp. Chúng tôi tiến hành khảo
sát phương pháp tinh chế để tìm ra điều kiện tốt nhất để tinh chế với các yếu
tố : đơn giản, tiết kiệm, hiệu suất cao.


15
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chiết xuất và tinh chế piperin
• Phương pháp chiết xuất : ngâm lạnh.
Các bước tiến hành như sau :
Dược liệu được chia nhỏ đến kích thước thích hợp. Cân và ngâm trương
nở dược liệu bằng dung môi thích hợp trong 2 giờ. Sau đó cho vào bình chiết,
thêm dung môi. Sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết và thêm
một lượng dung môi thích hợp tiếp tục chiết.
• Phương pháp piperin tinh chế:
Sử dụng dung môi để loại tạp và kết tinh piperin.
Loại tạp chất bằng than hoạt.
2.3.2. Phương pháp định lượng piperin
Piperin được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).
Lựa chọn điều kiện sắc ký :
Tham khảo các tài liệu [16] và qua thực nghiệm, điều kiện sắc ký được
xác định như sau :

Cột: Supelcosil C18 ( 150 × 4,6 mm )
Pha động: methanol : H
2

O (65:35).
Bước sóng phát hiện: 342 nm.
Tốc độ dòng: 0,8ml/phút.
Thể tích mẫu tiêm vào cột: 5µl.
Nhiệt độ buồng cột: 30°C.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn :
Cân chính xác 20 mg piperin chuẩn cho vào bình định mức 100 mL.
Thêm ethanol 96% vừa đủ, lắc cho hòa tan hoàn toàn. Thêm ethanol 96% đến


16
vạch cho đủ thể tích, ta được dung dịch chuẩn 200 μg/mL. Lọc qua màng
0,45μm rồi đem đo HPLC.
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử là dược liệu : Cân chính xác khoảng 350 mg bột dược liệu cho
vào bình định mức 100ml. Thêm khoảng 30 ml ethanol 96% đem siêu âm 30
phút, cho tiếp ethanol 96% tới vạch . Sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm rồi
đem đo HPLC.
Mẫu thử là piperin tinh khiết: Cân chính xác 20 mg piperin tinh khiết
cho vào bình định mức 100ml. Thêm khoảng 30 ml ethanol 96% đem siêu âm
30 phút, cho tiếp ethanol 96% tới vạch . Sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm rồi
đem đo HPLC.
Mẫu thử là piperin thô : Cân chính xác 30 mg tủa thô cho vào bình định
mức 100ml. Thêm khoảng 30 ml ethanol 96% đem siêu âm 30 phút, cho tiếp
ethanol 96% tới vạch . Sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm rồi đem đo HPLC.
Mẫu thử là cắn chiết : Cân chính xác 60 mg cắn chiết cho vào bình định
mức 100 ml. Thêm khoảng 30 ml ethanol 96% đem siêu âm 30 phút, cho tiếp
ethanol 96% tới vạch . Sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm rồi đem đo HPLC.
Định lượng :
Định lượng mỗi mẫu 3 lần theo điều kiện sắc ký đã xác định, lấy kết quả

trung bình.
Hàm lượng phần trăm piperin trong hồ tiêu được tính theo công thức:


Trong đó:
X%: hàm lượng piperin trong hồ tiêu.
m
C
: khối lượng piperin chuẩn (gam).
100%
.S.f.Vm
.S.f.a.Vm
X%
CCCT
TTTC
×=


17
m
T
: khối lượng hồ tiêu đem chiết (gam).
S
C
, S
T
: diện tích peak mẫu chuẩn và mẫu thử.
a: hàm lượng piperin chuẩn (%).
V
C

, V
T
: thể tích của dung dịch chuẩn và thử (ml).
f
C
, f
T
: hệ số pha loãng của dung dịch chuẩn và thử
• Hiệu suất chiết xuất :
Hiệu suất quá trình chiết xuất được tính theo công thức sau :

%100
/
/
×=
dlHLp
dcHLp
H

Trong đó :
H : Hiệu suất chiết xuất (%).
HLp/dc : hàm lượng piperin chiết được từ dược liệu .
HLp/dl : hàm lượng piperin có trong dược liệu.
• Hiệu suất cả quá trình:

Trong đó: H% : hiệu suất cả quá trình.
m
SP
: khối lượng sản phẩm.
m

T
: khối lượng piperin có trong dược liệu đem chiết.





( )
3 100%
m
m
%H
T
SP
×=