Nghiên cứu kỹ thuật điều chế và xây dựng một số tiêu chuẩn của cao đặc long đởm

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ THOAN

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ÐIỀU CHẾ VÀ
XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN CỦA
CAO ÐẶC LONG ÐỞM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI - 2013



BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THOAN

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ÐIỀU CHẾ VÀ
XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN CỦA
CAO ÐẶC LONG ÐỞM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. KS.DS. Nguyễn Thị Việt Hương
2. Ths. Ma Thị Hồng Nga

Nơi thực hiện: BM Công Nghiệp Dược - ÐH Dược HN





HÀ NỘI - 2013



LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới cô giáo KS.DS. Nguyễn Thị Việt Hương, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình
và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Th.S Ma Thị Hồng Nga, Th.S Nguyễn Thị Hạnh Thủy,
DS. Trần Ngọc Bảo, những người đã giúp đỡ và chỉ bảo em rất nhiều trong thời gian làm
khóa luận. Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ
thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành
khóa luận đúng thời hạn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội, những
người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những năm tháng học tập tại trường.
Cuối cùng với lòng biết ơn vô hạn, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân,
bạn bè và đặc biệt là người mẹ của em đã luôn luôn động viên và khích lệ em trong suốt thời
gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, tháng 5 năm 2013.
Sinh viên
Nguyễn Thị Thoan.










MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Đặt vấn đề 1
Chương 2. Tổng quan 2
1.1. Tổng quan về cây long đởm 2
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật 3
1.1.3. Bộ phận dùng 4
1.1.4. Thành phần hóa học 4
1.1.5. Công dụng - tác dụng 6
1.1.5.1. Công năng - chủ trị theo YHCT 6
1.1.5.1. Công dụng – tác dụng theo y học hiện đại 7

1.2. Cao thuốc 8
1.2.1. Định nghĩa 8
1.2.2. Một số đặc điểm của cao thuốc 8
1.2.3. Kỹ thuật điều chế cao thuốc 8
1.3. Độ ổn định của thuốc 9
1.3.1. Định nghĩa 9
1.3.2. Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định 10
1.3.3. Các kiểu thử nghiệm đánh giá độ ổn định 10
1.3.3.1. Thử nghiệm khắc nghiệt 10
1.3.3.2. Thử nghiệm dài hạn (trong điều kiện thực) 10
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 12
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 12
2.1.1. Nguyên liệu 12
2.1.2. Hóa chất, dung môi 12


2.1.3. Thiết bị, dụng cụ 12
2.2. Nội dung nghiên cứu 13
2.2.1. Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm 13
2.2.1.1. Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất dược liệu long đởm 13
2.2.1.2. Nghiên cứu kỹ thuật cô dịch chiết thành cao đặc 14
2.2.2. Xây dựng một số tiêu chuẩn của cao 14
2.2.3. Đánh giá độ ổn định của cao 14
2.3. Phương pháp thực nghiệm 14
2.3.1. Phương pháp điều chế cao đặc 14
2.3.1.1. Qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm 14
2.3.1.2. Định tính bằng phương pháp SKLM 16
2.3.1.3. Phương pháp định lượng 16
2.3.1.4. Phương pháp chiết xuất 18
2.3.1.5. Phương pháp cô dịch chiết 19

2.3.2. Xây dựng một số tiêu chuẩn của cao. 19
2.3.3. Phương pháp đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm 20
Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận 21
3.1. Kiểm tra chất lượng của dược liệu long đởm 21
3.1.1. Mô tả 21
3.1.2. Soi bột 21
3.1.3. Định tính bằng SKLM 21
3.1.4. Định lượng bằng HPLC 22
3.2. Điều chế cao đặc long đởm 23
3.2.1. Giai đoạn chiết xuất dược liệu long đởm 23
3.2.1.1. Lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi 23
3.2.1.2. Xác định thời gian chiết 26
3.2.2. Giai đoạn cô dịch chiết thành cao đặc 28
3.2.2.1. PP cô chân không. 28
3.2.2.2. PP cô thường. 28


3.3. Xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm 31
3.3.1. Tiêu chuẩn vật lý 31
3.3.2. Tiêu chuẩn hóa học 33
3.4. Đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN Dược điển Việt Nam
DĐTQ Dược điển Trung Quốc
Tỷ lệ DL/DM Tỷ lệ dược liệu và dung môi
CCl
4
Carbon tetraclorid
Dd Dung dịch
DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

kl/tt khối lượng/thể tích
sGOT Glutamic Oxaloacetic Transaminase
sGPT Glutamic Pyruvic Transaminase
SKLM Sắc kí lớp mỏng
Pp Phương pháp
TNHH Trách nhiệm hữu hạn
TQ Trung Quốc
TT Thuốc thử
Rf Hệ số lưu giữ
YHCT Y học cổ truyền










DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả SKLM gentiopicrin long đởm 22
Bảng 3.2. Khối lượng cao đặc ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 24
Bảng 3.3. Hàm ẩm cao đặc ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 24
Bảng 3.4. Hiệu suất qui trình ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 24
Bảng 3.5. Hàm lượng gentiopicrin ứng với các tỷ lệ dược liệu và dung môi 25
Bảng 3.6. Hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất ứng với các tỷ lệ DL/DM 25
Bảng 3.7. Kết quả định lượng hoạt chất gentiopicrin qua thời gian chiết 27
Bảng 3.8. Thời gian cô ứng với 2 phương pháp 29

Bảng 3.9. Khối lượng cao đặc ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.10. Hàm ẩm của cao đặc ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.11. Hiệu suất qui trình ứng với 2 phương pháp 29
Bảng 3.12. Hàm lượng gentiopicrin ứng với 2 phương pháp 30
Bảng 3.13. Hiệu suất qui trình, hàm lượng hoạt chất và thời gian cô của 2 pp 30
Bảng 3.14. kết quả thử tính chất cảm quan 31
Bảng 3.15. Kết quả hàm ẩm cao đặc long đởm 32
Bảng 3.16. Kết quả đo pH của dung dịch cao đặc long đởm 1% (kl/tt) 33
Bảng 3.17. Kết quả thử độ tan của cao trong nước 33
Bảng 3.18. Kết quả SKLM cao đặc long đởm 34
Bảng 3.19: Hàm lượng gentiopicrin trong cao đặc long đởm 35
Bảng 3.20. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của hàm lượng gentiopicrin 35
Bảng 3.21. Chỉ tiêu theo dõi độ ổn định của cao đặc long đởm 36
Bảng 3.22. Kết quả theo dõi độ ổn định của mẻ 1 ở điều kiện thường 37
Bảng 3.23. Kết quả theo dõi độ ổn định của mẻ 2 ở điều kiện thường 37
Bảng 3.24. Kết quả theo dõi độ ổn định của mẻ 3 ở điều kiện thường 3





DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1. Hoa và lá của cây long đởm (Gentiana scabra Bunge.) 3
Hình 1.2: Rễ và thân rễ Long đởm (Gentiana scabra Bunge.) 4
Hình 1.3. Công thức một số hoạt chất từ long đởm 5
Hình 2.1. Rễ long đởm thu mua từ công ty TNHH Đông Dược Phúc Hưng 12
Hình 2.2. Sơ đồ qui trình điều chế cao đặc long đởm 15

Hình 3.1. Đặc điểm vi học của bột long đởm 21
Hình 3.2. Sắc ký đồ dược liệu 22
Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của dược liệu 22
Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC của chuẩn gentiopicrin 23
Hình 3.5.
Đồ thị hiệu suất qui trình và hàm lượng gentiopicrin qua các tỷ lệ DL/D
M 26
Hình 3.6. Sắc ký đồ cao long đởm 33
Hình 3.7. Sắc ký đồ HPLC của cao đặc long đởm 34









1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của Y học hiện đại, Y học cổ truyền cũng ngày càng
đóng vai trò quan trọng trong việc phòng và chữa bệnh. Các thuốc có nguồn gốc
thiên nhiên của Y học cổ truyền có nhiều ưu điểm, đó là nguồn nguyên liệu có thể
tự trồng trọt, tự khai thác, ít tác dụng phụ, tương đối an toàn khi sử dụng, có thể
dùng lâu dài.
Long đởm là một trong những dược liệu được sử dụng trong y học cổ truyền
để điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, chán ăn và các bệnh viêm nhiễm khác
[24],[27]. Long đởm đã được sử dụng rộng rãi, có thể kết hợp cùng nhiều vị thuốc

khác trong các bài thuốc đông y và có tác dụng phòng và chữa nhiều loại bệnh, Để
góp phần từng bước hiện đại hóa thuốc cổ truyền nhằm tạo ra sản phẩm trung gian
và tiêu chuẩn hóa được nguyên liệu đầu vào để bào chế các dạng bào chế thuốc hiện
đại khác, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật điều chế và
xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm” với các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm.
2. Xây dựng một số tiêu chuẩn cho cao đặc long đởm.
3. Đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm.







2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây long đởm
Long đởm thuộc họ Long đởm (Gentianaceae) bao gồm nhiều loài
[2],[5],[11],[18],[22].
- Cây Long đởm (Gentiana scabra Bunge.)
- Cây Điều diệp long đởm (Gentiana manshurica Kitag.)
- Cây Tam hoa long đởm (Gentiana triflora Pall.)
- Cây Kiên long đởm (Gentiana rigescens Franch.)
Trong dân gian cũng dùng cả cây Thanh ngâm (Curanga amara, họ hoa
mõm chó) làm “nam long đởm thảo”, rễ trắng ngà, không có tua, giống long đởm ở
chất đắng [20] nhưng trong tây y lại dùng một loại khác là Gentiana lutea L. có hoa
màu vàng, rễ to hơn, thái thành từng miếng mỏng, có người dịch nhầm là khổ sâm

vì là vị thuốc bổ mà lại đắng [14]. Long đởm còn có tên gọi khác như: Lăng Du
(Bản Kinh), Thảo Long Đởm, Sơn Lương Đởm (Tục Danh), Đởm Thảo, Khổ Đởm,
Quan Âm Thảo, Tà Chi Đại Phu, Tà Chi Đại Sĩ (Hòa Hán Dược Thảo), Trì Long
Đởm (Nhật Bản) [28], Chinese gentian (Anh), Gentiane (Pháp) [11],[20].
Long là rồng, đởm là mật, vì vị thuốc này trông giống râu rồng, có vị đắng
như mật [14].
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Chi Gentiana L. gồm một số loài phân bố rải rác ở vùng ôn đới ấm và cận
nhiệt đới, chủ yếu thuộc Bắc bán cầu. Ở Việt Nam chi này có khoảng 4-5 loài
(Phạm Hoàng Hộ, 1981; Nguyễn Tiến Bân, 1997) [2].
Long đởm thảo có nguồn gốc từ vùng Xiberi (Liên Bang Nga) và phân bố
đến tận các tỉnh Hắc Long Giang, Phúc Kiến, Quảng Đông của Trung Quốc. Ở Việt
Nam có 2 loài khác (cũng có tên gọi là “long đởm”) đều được dùng làm thuốc là
Gentiana loureirii (D.Don) Griseb. phân bố ở cao nguyên Lang Biang - Đà Lạt, tỉnh
Lâm Đồng và Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. có ở Tây Nguyên (Võ Văn
Chi, 1997). Năm 1980, Viện Dược liệu đã thu tập được mẫu của loài G. loureirii ở
3

chân núi Lang Biang thuộc Xã Lát, huyện Đơn Dương, tỉnh Lâm Đồng [2]. Tuy
nhiên, hiện nay ta cũng phải nhập từ Trung Quốc [14].
Các loài long đởm nói chung đều là những cây nhỏ, thường mọc lẫn trong
các tràng cỏ thấp. Cây ưa ẩm, ưa khí hậu mát của vùng á nhiệt đới núi cao, hay
vùng ôn đới ẩm, sinh trưởng nhanh trong vụ xuân hè.
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Long đởm là loại cây thảo, sống lâu năm, cao 40-60 cm. Thân rễ ngắn, rễ
nhiều, mọc tua tủa thành chùm, dài đến 20 cm, vỏ ngoài màu vàng nhạt. Thân mọc
đứng, nhiều đốt. Lá mọc đối, không cuống, lá ở gốc thường nhỏ, những lá phía trên
lớn hơn dài từ 3-8 cm, rộng 1-3 cm, gốc tròn, đầu thuôn nhọn, hai mặt nhẵn, gân
hình cung. Hoa tụ tập ở kẽ lá, hình chuông, màu lam, đài và tràng hình trụ, có 4-5
thùy, nhị 4-5 đính ở giữa hoặc ở gốc tràng, không thò ra ngoài tràng, bầu 1 ô. Quả

nang, hạt nhiều [2],[14],[18]. Mùa hoa tháng 9-10, mùa quả tháng 10 [14],[18].



Hình 1.1. Hoa và lá của cây long đởm (Gentiana scabra Bunge.)
4

1.1.3. Bộ phận dùng
Vị thuốc từ cây long đởm là thân rễ và rễ (Radix et Rhizoma Gentianae)
[2],[3],[4],[5],[14],[20]. Thu hái vào mùa xuân và mùa thu, mùa thu là tốt nhất
[5],[14], đào lấy thân rễ và rễ, rửa sạch và phơi âm can, cắt đoạn 2-3 cm phơi hoặc
sấy khô. Bảo quản nơi khô thoáng [5]. Theo Mascre’: rễ long đởm tươi chứa 2,48%
gentiopicrin, sấy bằng tủ sấy tỉ lệ này còn 2,10%, rễ sấy trên gác bếp còn 1,61%,
trong khi đó rễ đã để lên men thì chỉ còn lại vết gentiopicrin. Do đó, khi thu hái rễ
long đởm phải rửa và sấy khô sớm (dưới 3 ngày) [18].




Hình 1.2. Rễ và thân rễ long đởm (Gentiana scabra Bunge.)

1.1.4. Thành phần hóa học
Các loài trong chi Gentiana thường chứa thành phần chính là gentiopicrosid
(gentiopicrin). Chất secoiridoid glucosid này lần đầu tiên được phân lập từ loài
G.lutea [2].
Hàm lượng gentiopicrosid trong rễ và thân rễ là 0,35%. Ngoài ra, còn có
gentioflavin, gentisin, scabrosid, triflorosid, swertiamarin, swerosid, amarogentin,
amaroswerin [2].
Hàm lượng gentiopicrosid phụ thuộc vào tuổi cây và thời gian thu hái. Với
loài G. scabra, hàm lượng gentiopicrosid cao nhất vào lúc cây 3 tuổi (7,8%), phần

trên mặt đất chứa khoảng 1% [2].
5

Rễ của loài G. scabra có gentiopicrosid, swerosid, 2
’
-(O,m-dihydroxybenzyl)
swerosid, daucosterol (β-sitosterol glucosid) [2]. Ngoài ra, có hai secoiridoid đã
được phân lập là 4”’–O –β –D-glucopyranosyltrifloroside, 4’’’–O –β–D–
glucopyranosyl scabraside [26].
Theo Đỗ Ngọc Thanh, loài long đởm ở Việt Nam có chất iridoid chính là
gentiopicrosid, chiếm 70% trong số iridoid toàn phần, alkaloid chính là gentianin,
chiếm 70% lượng alkaloid toàn phần. Rễ các loài G. triflora, G. rigescens, G.
manshurica, G. scabra chứa gentiopicrosid và chất đắng toàn phần 4,1% - 6,7%. Rễ
thứ G. triflora var. japonica và G. scabra var. buergeri chứa triflorosid và scabrasid
[2].
Theo tác giả Đỗ Tất Lợi, trong long đởm có một glycosid đắng chừng 2%
gọi là gentiopicrin C
16
H
20
O
9
, và một chất đường gọi là gentianoza C
18
H
32
O
16
chừng
4%. Thủy phân gentiopicin ta thu được gentiogenin C

10
H
10
O
4
và glucoza.
Gentianoza gồm hai phân tử glucoza và một phân tử fructoza [10],[14].


Gentiopicrosid Swertiamarin



Hình 1.3. Công thức một số hoạt chất từ long đởm


Swerosid Amarogentin
6

1.1.5. Công dụng - tác dụng
1.1.5.1. Công năng - chủ trị theo YHCT
- Tính vị, qui kinh: vị đắng, tính hàn, qui vào ba kinh can, đởm, bàng quang
[2],[3],[4],[5],[10],[14],[18],[20], có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu
thực, tiêu viêm, trị đơn độc, sưng mủ. Những người tì vị hư nhược, đi tả và không
thấp nhiệt, không thực hỏa thì không dùng được [2],[3],[4],[14],[20].
- Thanh thấp nhiệt ở hạ tiêu: Chữa các chứng viêm gan vàng da, sỏi mật,
viêm tinh hoàn, ngứa âm hộ, viêm bàng quang [3],[4].
- Thanh can hỏa: Chữa chứng đau đầu, mắt đỏ, miệng đắng, họng đau, sườn
đau, tai ù. Trẻ em sốt cao co giật, viêm màng tiếp hợp cấp [3].
- Bình can hạ áp: Dùng chữa tăng huyết áp thể can dương thịnh [3],[4].

- Thanh phế hỏa: Dùng trong các bệnh viêm nhiễm đường hô hấp trên như
viêm họng, viêm amidan, ngoài ra còn dùng trong viêm tai giữa, tai có mủ, bệnh
viêm tinh hoàn cấp tính, có thể phối hợp với chi tử [4].
- Giải độc trừ giun đũa: long đởm 40g, sắc uống vào mỗi buổi sáng, uống lúc
đói. Ngoài ra còn có thể dùng để trừ sỏi gan, sỏi mật [4].

Một số bài thuốc có Long đởm

- Long đởm tả can thang: thanh thấp nhiệt ở can đởm, tả can hỏa, lợi thấp.
Chữa các bệnh can hỏa như: đau mạng sườn, vàng da, mệt mỏi, ăn uống kém,
miệng đắng, mặt đỏ, ù tai, viêm màng tiếp hợp cấp, viêm tai giữa, viêm túi mật,
viêm gan siêu vi trùng, cao huyết áp thể thực nhiệt, tiểu ít màu vàng hay nâu [13].
Bài thuốc Long đởm tả can thang là bài thuốc cổ phương được ghi trong
nhiều tài liệu của YHCT [4],[9],[11],[12],[13],[14],[15],[17],[18],[21]. Tất cả các tài
liệu đều ghi gồm 10 vị thuốc, chỉ khác nhau về khối lượng của mỗi vị. Ở đây, chúng
tôi chỉ trích dẫn một bài thuốc được ghi trong tài liệu [4].


7

Long đởm thả
o
8g

Đương qui

6g

Chi tử

8g

Sài hồ 8g

Trạch tả

8g

Sinh đị
a
8g

Hoàng cầ
m
8g

Cam thả
o
4g

Mộ
c thông
8g

Xa tiề
n
4g


- Chữa ăn không tiêu, đầy bụng [2],[14]

Long đởm thảo 2g, đại hoàng 1g, hoàng bá 1g, nước 200ml, sắc lấy 100ml.
Chia làm 3 lần, uống trong ngày, 15 phút trước khi ăn để làm thuốc giúp sự tiêu
hóa, ăn uống không tiêu.
- Chữa đau dạ dày [2],[14]
Long đởm thảo 0,5g, hoàng bá 0,5g, can khương 0,3g, quế chi 0,3g, hồi
hương 0,3g, kê nội kim 0,5g, sơn tra 1g (sao cháy). Tất cả trộn đều tán thành bột,
chia làm 3 lần uống trong ngày (Hòa hán dược dụng nghiệm phương).
- Chữa sốt ho, khó thở [2],[14]
Long đởm thảo 2 – 3 g, hãm thêm bột hồ tiêu vào, uống.
1.1.5.1. Công dụng – tác dụng theo y học hiện đại
Theo Ebeling, long đởm thảo có tác dụng phòng sự lên men, uống ít (nửa giờ
trước bữa ăn) có tác dụng kích thích sự bài tiết dịch tiêu hóa, làm khỏe dạ dày.
Ngược lại, uống sau khi ăn cơm hay uống quá nhiều lại làm cho tiêu hóa kém sút,
nhức đầu, hoa mắt, mặt đỏ [2],[14].
Theo một nghiên cứu về tác dụng chất đắng của long đởm thảo trên dạ dày
nhỏ của chó cho thấy sự bài tiết dịch vị tăng tiến và lượng acid tự do cũng tăng hơn
ở chó được uống long đởm thảo [14].
Tác dụng đối với vị trường: với lượng nhỏ (liều 0,1g), long đởm thảo có thể
xúc tiến sự phân tiết dịch vị làm tăng lượng acid trong dịch vị, kích thích tiêu hóa.
Tuy nhiên, dùng liều lớn hơn sẽ kích thích niêm mạc dạ dày, dẫn đến nôn [3],[4].
Tác dụng kháng khuẩn: Do thuốc có tác dụng hạ thấp men chuyển hóa amin,
trên thực tế có thể dùng thuốc dự phòng bệnh viêm não truyền nhiễm [3],[4]. Nước
8

sắc long đởm có tác dụng ức chế trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn lị, tụ cầu vàng
[1],[3],[4].
Theo nghiên cứu, long đởm có tác dụng ức chế và thu gom các gốc tự do như
peroxid, DPPH, và superoxide. Long đởm có tác dụng bảo vệ tế bào gan trong mô
hình gây viêm gan cấp bằng CCl
4

ở chuột thực nghiệm, làm giảm sự oxi hóa tế bào,
tạo điều kiện cho sự tái tạo một cách nhanh chóng tế bào nhu mô, đồng thời làm
giảm nồng độ sGOT, sGPT là những enzyme có trong gan, mà sự tăng lên của
chúng được đặc trưng cho sự tổn thương gan [26].
1.2. Cao thuốc
1.2.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất qui định
các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích
hợp [5],[6],[7].
Cao đặc là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao
không quá 20% [5].
1.2.2. Một số đặc điểm của cao thuốc
- Đã được loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất nhầy, gôm,
chất béo, nhựa, ) [6].
- Trong quá trình điều chế có thể hình thành một số chất là sản phẩm của quá
trình oxy hóa, thủy phân, tác dụng của enzym. Tỷ lệ hoạt chất trong cao thuốc (đặc,
khô) thường cao hơn tỉ lệ hoạt chất trong dược liệu [6].
- Cao thuốc ít khi được sử dụng trực tiếp, thường được dùng để bào chế các
dạng thuốc khác như siro, potio, viên tròn, thuốc mỡ, thuốc đạn, thuốc trứng, viên
nén, thuốc bột [6].
1.2.3. Kỹ thuật điều chế cao thuốc
Quá trình điều chế cao đặc thường bao gồm những giai đoạn sau [6],[7]:
a. Điều chế dịch chiết
- Chọn nguyên liệu:
+ Dược liệu được sấy khô và chia mịn tới độ mịn thích hợp.
9

+ Dung môi để điều chế cao thuốc tùy theo dược liệu có thể là nước, ethanol,
ethanol loãng, ethanol – glycerin – nước, hoặc dùng dung môi ethanol trước, sau đó
dùng nước cho dịch chiết sau rồi gộp các dịch chiết lại.

- Chọn phương pháp chiết xuất:
Tùy theo bản chất của dược liệu và dung môi mà người ta chọn phương pháp
chiết xuất thích hợp.
b. Loại tạp chất
Tùy vào loại tạp chất là tan trong nước hay tan trong ethanol mà có những
phương pháp xử lý khác nhau.
c. Cô đặc
Mục đích là để điều chế cao lỏng và cao đặc. Khi cô không được gây phân
hủy hoạt chất có trong dịch chiết, do vậy cần chú ý đến các điều kiện sau: cô ở nhiệt
độ thấp, thời gian cô ngắn, cô dịch chiết loãng trước, dịch chiết đậm đặc sau.
Các phương pháp cô đặc như sau:
- Cô đặc ở áp suất thường: Người ta thường cô cách thủy, dụng cụ cô cần có bề mặt
bốc hơi lớn và nông. Trong quá trình cô cần tiến hành khuấy trộn đều để tránh tạo
váng trên bề mặt cản trở sự bốc hơi dung môi và tránh cháy ở đáy dụng cụ. Có thể
dùng quạt hoặc phương tiện thông gió để lưu thông lớp không khí bão hòa dung
môi trên bề mặt dịch chiết.
- Cô đặc ở áp suất giảm: Người ta dùng các thiết bị cô có bộ phận tạo chân không.
Cần chú ý một số trường hợp dịch chiết sẽ sủi bọt mạnh khi áp suất nồi cô giảm. Để
ngăn cản quá trình tạo bọt có thể thêm vào dịch chiết một lượng nhỏ chất chống tạo
bọt như bơ ca cao, parafin.
1.3. Độ ổn định của thuốc
1.3.1. Định nghĩa [8]
Độ ổn định của thuốc là khả năng nguyên liệu hoặc chế phẩm được bảo quản
trong điều kiện xác định có thể giữ được những đặc tính vốn có về hóa lý, vi sinh,
sinh dược học…trong những giới hạn nhất định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc.

10

1.3.2. Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định [8]
Có 5 tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định của thuốc

- Độ ổn định hóa học: các tính chất hóa học (thành phần định tính và định lượng)
của (các) hoạt chất có mặt trong chế phẩm nằm trong một giới hạn cho phép theo
tiêu chuẩn chất lượng.
- Độ ổn định vật lý: các đặc điểm vật lý của nguyên liệu làm thuốc như màu sắc,
trạng thái tinh thể, độ tan…không thay đổi.
- Độ ổn định vi sinh: độ vô trùng hoặc giới hạn nhiễm khuẩn của chế phẩm phải đáp
ứng yêu cầu của tiêu chuẩn.
- Độ ổn định điều trị: tác dụng điều trị của chế phẩm không thay đổi.
- Độ ổn định độc tính: độc tính không được tăng lên trong suốt quá trình bảo quản
và lưu hành trên thị trường.
1.3.3. Các kiểu thử nghiệm đánh giá độ ổn định
1.3.3.1. Thử nghiệm khắc nghiệt
Thử nghiệm khắc nghiệt được coi là đồng nghĩa với lão hóa cấp tốc. Một số
yếu tố tác động đến độ ổn định của thuốc áp dụng trong lão hóa cấp tốc, thử nghiệm
khắc nghiệt có thể không xảy ra trong thực tế nhưng có ý nghĩa cho biết các đặc tính
ổn định của thuốc.
1.3.3.2. Thử nghiệm dài hạn (trong điều kiện thực)
Thử nghiệm dài hạn là thử nghiệm bảo quản thuốc trong điều kiện thực, toàn
bộ các chỉ tiêu chất lượng theo tiêu chuẩn đều được đánh giá kéo dài theo thời gian
đến khi thuốc không còn đáp ứng chất lượng đề ra. Thử nghiệm dài hạn có ý nghĩa
xác định chính xác tuổi thọ, thời gian sử dụng của thuốc.
Để có thể tiến hành thử nghiệm dài hạn phù hợp với điều kiện khí hậu thực,
thuận lợi cho việc lập kế hoạch nghiên cứu độ ổn định, chọn điều kiện bảo quản, đồ
bao gói, người ta chia khí hậu của các nước làm 4 vùng:
+ Vùng khí hậu I: vùng ôn đới nhiệt độ 21ºC, độ ẩm 45%.
+ Vùng khí hậu II: vùng cận nhiệt đới, lục địa, nhiệt độ 25ºC, độ ẩm 60%.
+ Vùng khí hậu III: vùng sa mạc (nóng và khô), nhiệt độ 30ºC, độ ẩm 35%.
11

+ Vùng khí hậu IV: vùng nhiệt đới (nóng và ẩm), nhiệt độ 30ºC, độ ẩm 70%.

Nếu chế phẩm được lưu hành ở vùng I nên nghiên cứu độ ổn định trong điều
kiện bảo quản ở vùng II.
Nếu chế phẩm được lưu hành ở vùng III hoặc vùng IV nên nghiên cứu độ ổn
định trong điều kiện bảo quản ở vùng IV [8].























12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Dược liệu long đởm (Gentiana scabra Bunge.) thu mua của công ty TNHH
Đông Dược Phúc Hưng. Độ ẩm 8,5%. Hàm lượng hoạt chất chính gentiopicrin là
1,86 %.


Hình 2.1. Rễ long đởm thu mua từ công ty TNHH Đông Dược Phúc Hưng
2.1.2. Hóa chất, dung môi
- Nước cất

- dd H
3
PO
4
0,4%
-
Ethylacetat
- Gentiopicrin chuẩn mua từ TQ (Hàm
lượng 99,9%. Hạ
n dùng: 30/09/2016)
- Ethanol 50°
- dd NaOH 0,1N
- Methanol
- Nước cất 2 lần
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
- Máy HPLC Shimadzu SPD-M10 Avp với detector UV (Nhật Bản)
- Máy cất quay Büchi Rotavapor R-200 (Thụy Sỹ)

- Cân phân tích Sartorius TE 214S
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)
- Máy soi UV
- Tủ sấy MEMMERT (Đức)
13

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu kỹ thuật điều chế cao đặc long đởm
Đi từ dược liệu để điều chế ra cao đặc phải trải qua 2 giai đoạn chính là: giai
đoạn chiết xuất và giai đoạn cô dịch chiết thành cao đặc. Trong quá trình chiết và
quá trình cô, có những thông số ảnh hưởng đến hiệu suất qui trình cũng như hàm
lượng hoạt chất chính có trong cao đặc được điều chế ra. Nghiên cứu về kỹ thuật
chiết xuất và kỹ thuật cô dịch chiết thành cao nhằm góp phần tối ưu hóa qui trình
điều chế chung cho cao đặc long đởm.
2.2.1.1. Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất dược liệu long đởm
Ở đây chúng tôi áp dụng qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm với
dung môi dùng để chiết xuất là nước và tiến hành theo phương pháp ngâm nóng.
Dung môi nước có ưu điểm là rẻ tiền, dễ kiếm, thiết bị cần cho chiết xuất đơn giản,
đầu tư ít. Khi chiết ở nhiệt độ sôi làm tăng độ tan của gentiopicrin là hoạt chất chính
có trong dược liệu long đởm do đó làm tăng hàm lượng hoạt chất này có trong cao
đặc. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để lựa chọn 2 thông số cho qui trình chiết, bao
gồm các thông số: lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi, thời gian chiết.
a. Lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước (DL/DM)
Để lựa chọn tỷ lệ dược liệu và dung môi nước, chúng tôi thực hiện các thí
nghiệm với các tỷ lệ dược liệu và nước khác nhau trong cùng một điều kiện chiết và
điều kiện cô như nhau, dựa vào hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất chính
gentiopicrin có trong cao đặc từ đó lựa chọn được tỷ lệ thích hợp.
b. Lựa chọn thời gian chiết xuất
Để lựa chọn thời gian chiết, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm chiết dược
liệu long đởm theo các khoảng thời gian khác nhau với tỷ lệ dược liệu và dung môi

nước đã chọn và trong cùng một điều kiện chiết như nhau, dựa vào hàm lượng hoạt
chất chính gentiopicrin có trong 1ml dịch chiết và phân tích những chi phí về mặt
thời gian, tốn kém nhiệt lượng và ảnh hưởng của nhiệt đến hoạt chất từ đó lựa chọn
được thời gian chiết thích hợp.
14

2.2.1.2. Nghiên cứu kỹ thuật cô dịch chiết thành cao đặc
Để lựa chọn được phương pháp cô, chúng tôi chiết xuất dược liệu long đởm
theo tỷ lệ dược liệu và dung môi nước, thời gian chiết đã chọn, tiến hành cô dịch
chiết thu được bằng các phương pháp cô khác nhau, trong cùng một điều kiện như
nhau, dựa vào thời gian cô, hiệu suất qui trình và hàm lượng hoạt chất chính
gentiopicrin có trong cao đặc để từ đó lựa chọn được phương pháp cô thích hợp.
2.2.2. Xây dựng một số tiêu chuẩn của cao
Sau khi điều chế thu được cao đặc long đởm, chúng tôi tiến hành xây dựng
một số tiêu chuẩn vật lý, hóa học cho cao bao gồm: tính chất cảm quan (thể chất,
màu sắc, mùi vị), hàm ẩm của cao, pH của dd cao 1% (kl/tt), độ tan của cao trong
nước, định tính và định lượng hoạt chất gentiopicrin có trong cao, góp phần tiêu
chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào cho các dạng bào chế hiện đại khác đi từ cao đặc
long đởm.
2.2.3. Đánh giá độ ổn định của cao
Theo dõi và đánh giá độ ổn định của cao đặc long đởm về mặt vật lý và hóa
học ở điều kiện thử nghiệm dài hạn: nhiệt độ: 30 ± 2ºC và độ ẩm 75 ± 5% trong thời
gian 6 tháng.

2.3. Phương pháp thực nghiệm

2.3.1. Phương pháp điều chế cao đặc
Để có thể lựa chọn được các thông số thích hợp cho giai đoạn chiết xuất
và giai đoạn cô dịch chiết, chúng tôi tiến hành nhiều thí nghiệm khác nhau. Các
thí nghiệm đều theo 1 qui trình chung.

2.3.1.1. Qui trình điều chế chung cho cao đặc long đởm
a. Sơ đồ qui trình điều chế chung
15


Hình 2.2. Sơ đồ qui trình điều chế cao đặc long đởm

b. Mô tả qui trình điều chế chung
Qui trình điều chế đi từ rễ long đởm đến cao đặc long đởm bao gồm 3
giai đoạn chính sau:
- Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu
Dược liệu thu mua của công ty TNHH Đông Dược Phúc Hưng được loại
tạp, rửa sạch, để ráo nước. Sấy dược liệu ở 60 – 70°C cho khô, cắt dược liệu
thành từng đoạn nhỏ có kích thươc từ 1 – 2 cm.
- Giai đoạn 2: Chiết xuất
Nguyên tắc chiết: bằng phương pháp ngâm nóng ở nhiệt độ sôi (100°C).
Tiến hành chiết: cho dược liệu vào bình cầu thủy tinh loại 2 lít. Khối
lượng dược liệu là 100g/mẻ. Số lần chiết là 3 lần/mẻ. Dung môi chiết là nước.
(Tùy theo thí nghiệm sẽ thay đổi tỷ lệ dược liệu và dung môi, thời gian chiết).
Chiết dược liệu trong nồi ôm có bảo ôn nhiệt. Sau khi chiết xong, rút dịch chiết
ra, lắp lưới và lót bông vào bình chiết, tiến hành lọc dịch chiết.
- Giai đoạn 3: Cô cao
Dịch chiết sau khi lọc loại bỏ một số tạp chất được đem đi cô (tùy theo
thí nghiệm sẽ thay đổi phương pháp cô) để thu được cao lỏng 1:1, sau đó cao
16

lỏng 1:1 được cho ra bát sứ rộng vành, tiến hành cô cách thủy trên nồi cách
thủy để thu được cao đặc long đởm.
2.3.1.2. Định tính bằng phương pháp SKLM [5]

Cách tiến hành như sau:
- Hoạt hóa bản mỏng Silicagel GF254 ở 110ºC trong 1 giờ.
- Hệ dung môi khai triển: Ethylacetat – Methanol – Nước (10 : 2 :1).
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: lấy 0,5g bột long đởm thử (đối với dược liệu) hoặc
0,2g cao đặc, thêm 10ml Methanol (TT), đun trên cách thủy trong khoảng 15 phút,
lọc, cô dịch lọc trên cách thủy đến còn khoảng 2ml thu được dung dịch thử. Tiến
hành song song với 0,5g long đởm chuẩn để có được dung dịch chuẩn.
- Triển khai sắc ký: chấm 2 vết dịch chiết long đởm chuẩn và thử trên cùng 1 bản
mỏng, triển khai sắc ký đến vạch giới hạn dung môi (cách mép trên 0,5cm), lấy bản
mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại với bước sóng
254nm. Tính giá trị Rf.
2.3.1.3. Phương pháp định lượng [22],[23]
Gentiopicrin được định lượng bằng phương pháp HPLC.
a. Lựa chọn điều kiện sắc ký:

- Cột: C18
- Pha động: methanol – nước tỉ lệ 25 – 75
- Bước sóng phát hiện: 270nm
- Tốc độ dòng: 1ml/ phút
- Thể tích tiêm mẫu: 10µl
- Nhiệt độ buồng cột: 30ºC

b. Chuẩn bị dung dịch thử:
- Với dược liệu: cân chính xác 0,5g dược liệu cho vào bình nón khô. Bổ sung chính
xác 25,0ml methanol vào bình nón trên, cân khối lượng bình. Sau đó chiết hồi lưu
cách thủy trong vòng 30 phút (kể từ khi dịch sôi), để nguội ở nhiệt độ phòng. Cân
lại khối lượng bình, bổ sung thêm methanol để có khối lượng ban đầu, lắc trộn đều,
lọc. Hút chính xác 5,0ml dịch chiết trên cho vào bình định mức 25,0ml đã có sẵn
5,0ml dung dịch acid photphoric 0,4%, lắc kĩ, bổ sung methanol vừa đủ 25,0ml, lắc
đều, lọc qua màng lọc 0,45µm, đem đi chạy HPLC.

- Với cao đặc. Dựa trên cách pha mẫu đối với dược liệu, dung dịch thử được pha
như sau: cân khoảng 0,2g cao đặc long đởm điều chế được cho vào bình định mức
25,0ml. Bổ sung methanol vừa đủ 25,0ml vào, đem đi siêu âm trong 30 phút cho tan