Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt vải (semen litchi)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







HỒ THANH NGA



NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
HẠT VẢI
(SEMEN LITCHI)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



HỒ THANH NGA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
HẠT VẢI
(SEMEN LITCHI)



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển
2. DS. Phạm Thị Anh
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền





Hà Nội - 2013
LỜI CẢM ƠN
Vi tt c tm lòng, em xin gi li cc ti PGS. TS. Nguyễn Mạnh
Tuyển. Thng dn, ch bo, h tr v mi mt trong quá trình thc
hin khóa lun.
Em xin chân thành cDS. Phạm Thị Anh ng dn
t nhng kinh nghi khóa luc hoàn thi
Em xin chân thành cthầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược

học cổ truyền, trường đại học Dược Hà Nội u ki trong sut thi
gian thc hin khóa lun.
Xin c    i các anh chị khoa Hóa phân tích, Dược lý- Viện
Dược Liệu  em rt nhiu trong thi gian qua.






ch


Hà N
Sinh viên

H Thanh Nga


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2
1.1. THỰC VẬT HỌC 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae) 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn 3
1.1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn 3
1.1.2. Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn 3
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 4
1.2.1. Thành phần hóa học 4

1.2.2. Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền 4
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY 5
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5
1.3.1.1. Thành phần hóa học 5
1.3.1.2. Tác dụng sinh học 6
1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7
1.4.1.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết 7
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 9
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 9
2.1.2. Trang thiết bị 9
2.1.3. Hóa chất, dung môi 10
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi học 10
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 10
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 11
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.3.1.Chuẩn bị mẫu 11
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học 11
2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học 11
2.3.3.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải 11
2.3.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt vải 12
2.3.4. Nghiên cứu tác dụng sinh học 14
2.3.4.1. Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH 14
2.3.4.2. Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid 15
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 17
3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC 17
3.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 18
3.2.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải 18
3.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 25

3.2.2.1. Xác định độ ẩm 25
3.2.2.2. Chiết xuất 25
3.2.2.3. Định lƣợng các phân đoạn bằng phƣơng pháp cân 26
3.2.2.4. Định tính các phân đoạn 27
3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC 32
3.3.1. Chuẩn bị cao ethanol toàn phần 32
3.3.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH 32
3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 32
3.3.2.2. Chuẩn bị dung dịch DPPH 32
3.3.2.3. Tiến hành 32
3.3.3. Thử nghiệm dọn gốc superoxid 34
3.3.3.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 34
3.3.3.3. Tiến hành 34
3.4. BÀN LUẬN 36
3.4.1. Đặc điểm vi học 36
3.4.2. Thành phần hóa học 36
3.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT


BuOH n- butanol
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
EtOAC etyl acetat
EtOH ethanol
IC
50
The half maximal inhibitory concentration
NADH Nicotinamide adenine dinucleotide
NBT Nitroblue tetrazolium
PMS Phenazine methosufate

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả định tính hạt Vải bằng phản ứng hóa học 24
Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm hạt Vải 25
Bảng 3.3. Kết quả định lƣợng các phân đoạn 27
Bảng 3.4. Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học 28
Bảng 3.5. Bảng giá trị R
f
của các vết ở phân đoạn n-hexan 30
Bảng 3.6. Bảng giá trị R
f
tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn ethyl acetat 31
Bảng 3.7. Bảng giá trị R
f
tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn n-butanol 32
Bảng 3.8. Hỗn hợp phản ứng 33
Bảng 3.9. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải, quercetin 33
Bảng 3.10. Hỗn hợp phản ứng 35
Bảng 3.11. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do superoxid
của dịch chiết hạt Vải và superoxid dismutase 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới 4
Hình 2.1. Hình ảnh hạt Vải 9
Hình 3.1. Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt Vải dƣới kính hiển vi 17
Hình 3.2. Tinh thể hình kim 21
Hình 3.3.Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết hạt Vải 26
Hình 3.4. Sắc ký đồ của phân đoạn n-hexan 29
Hình 3.5. Sắc ký đồ của phân đoạn ethyl acetat 30
Hình 3.6. Sắc ký đồ của phân đoạn n-butanol 31
Hình 3.7. Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải và quercetin 34
Hình 3.8: Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt vải (A) và
superoxid dismutase (B) 36

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô
cùng phong phú và đa dạng. Bên cạnh đó Việt Nam còn được thừa hưởng một nền
y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Vì vậy, nguồn dược liệu dồi dào cùng với
vốn kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc chính là một nguồn nguyên liệu vô cùng
quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về
hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại.
Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các
nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học [23].
Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra
các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm
khớp dạng thấp, lão hóa [25], [32], [43]. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên
cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được
gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione

peroxidase, catalase…), acid ascorbic, α-tocopherol, glutathione, carotenoid, flavonid,…
Theo hướng nghiên cứu đó, hiện nay đã có nhiều công bố về tác dụng
chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết [39], [41] của dược liệu hạt
Vải (Semen Litchi). Trong y học cổ truyền Việt Nam, hạt Vải đã được sử dụng để
điều trị nhiều chứng bệnh như: chữa đau dạ dày, chữa răng sưng đau có sâu…Tuy
nhiên, các đề tài nghiên cứu về dược liệu hạt Vải ở Việt Nam còn hạn chế. Để góp
phần tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc của Việt Nam, chúng tôi
thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt
Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học hạt Vải (Semen Litchi)
2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết toàn phần hạt Vải trên
in vitro.

2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Vị trí phân loại
Cây Vải thuộc chi Litchi Sonn., một chi thuộc họ Bồ hòn (Sapindaceae). Vị trí
phân loại của chi Litchi Sonn được tóm tắt theo sơ đồ sau [1], [2], [8].
Ngành ngọc lan (Magnoliophyta).
Lớp ngọc lan (Magnoliopsida).
Phân lớp hoa hồng (Rosidae).
Liên bộ cam (Rutanae).
Bộ bồ hòn (Sapindales).
Họ bồ hòn (Sapindaceae).
Chi Litchi Sonn.
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae)
Cây gỗ hoặc cây bụi. Lá thường kép lông chim, mọc so le hoặc lá kép hình
chân vịt, hiếm khi là lá đơn. Phần lớn không có lá kèm. Lá chét mọc so le hoặc mọc

đối [1], [2], [20]. Mép lá có răng cưa hoặc nếp cuộn. Hoa nhỏ, tập hợp thành cụm
hoa hình chùy, mọc ở kẽ lá bắc. Hoa đơn tính, hiếm khi lưỡng tính, đối xứng hai
bên hoặc đối xứng tỏa tròn. Đài hoa 4, 5 hoặc 6, kích thước đồng đều hoặc không
đồng đều, dính liền hoặc tách rời. Tràng 4, 5 hoặc 6, tách rời hoặc dính liền nhau,
mặt trong cánh hoa thường có những vẩy hoặc chùm lông, dính với đĩa mật, đôi khi
hoa không có cánh. Đĩa mật hình vòng khuyên, ở bên ngoài vòng nhị. Nhị hoa 5-10
thường là 8, dính vào đế hoa, nhị thò ra ngoài, tách rời hoặc dính liền, bao phấn
đính liền nứt dọc. Bộ nhụy 1, 3 hoặc 4 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1, 2 hoặc một số
noãn, kiểu đính noãn trung trụ; bầu có 1-4 ô, chỉ có một ô phát triển. Quả nang chia
ngăn hoặc quả mọng hoặc quả hạch. Hạt có 1, 2 hoặc nhiều hơn tách rời nhau, vỏ
ngoài hạt màu đen hoặc nâu, phôi cong uốn nếp, không có nội nhũ 2n = 20 - 36,
giàu tinh bột, lipid, có hoặc không có áo hạt [20].
Họ Bồ hòn (Sapindacae) có 135 chi, 1500 loài phân bố rộng rãi ở các vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt ở nhiệt đới Đông Nam Á [20]. Ở Việt Nam có
3

70 loài, thuộc 25 chi: Allophylus, Amesiodendron, Aryteta, Blighia, Cardiospermum,
Delavaya, Dimocarpus, Dodonaea, Glennila, Guioa, Hurpullia, Koelreuteria,
Lepisanthes, Litchi, Mischocarpus, Nephelium, Paranephelium, Pavieasia, Pometia,
Sapindus, Scheleichera, Sinoradlkofera, Sisyrolepis, Xerospermum, Zollingerio [1].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn.
Cây gỗ. Lá kép lông chim mọc so le. Cụm hoa hình chùy. Hoa đơn tính cùng
gốc, mọc ở kẽ lá bắc, đối xứng tỏa tròn. Đài 4-5 thùy, mở nắp, không có cánh hoa.
Nhị 6-8 có lông, chỉ nhị thò ra ngoài. Bộ nhụy có 2- 3 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1
noãn, bầu nhụy hình tim ngược. Quả đơn có áo hạt hình trứng hoặc gần hình cầu, vỏ
quả mỏng, có vết rạn, đôi khi gần như trơn. Hạt hình trứng, vỏ hạt màu nâu, phôi
thẳng 2n = 28 hoặc 30 [20]. Chi Litchi Sonn chỉ có một loài trên thế giới là Litchi
chinensis Sonn [20], [12], với 3 loài phụ [8]:
- ssp. chinensis : Được trồng nhiều ở Việt Nam và Nam Trung Quốc.
- ssp. philippinensis: Mọc hoang dại ở Philippin.

- ssp. javensis: Chỉ mới thấy trồng ở phía tây đảo Java (Indonesia) và Nam
Đông Dương (Campuchia và Nam Việt Nam) [12].
1.1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn.
Cây nhỡ hoặc cây to, cao khoảng 8-15 m, vỏ màu xám đen. Cành tròn, vỏ màu
nâu sẫm, tán lá rộng. Lá kép lông chim, mọc so le, cuống lá dài 10-15 cm. Lá chét
dày 2, 3, hoặc 4 cặp, cuống lá chét dài 7-8 mm, phiến lá hình mũi mác hoặc hình
trứng mác, gốc tròn, đầu nhọn [20]. Hoa xếp thành hình chùy ở ngọn cành, 5 lá đài
đính nhau, có lông [12], [14], [20]. Hoa không có tràng. Nhị 6-7 đôi khi là 8, dài
4mm [20]. Bộ nhụy có 2 lá noãn, mỗi lá chứa 1 noãn, bầu 2 ô [8], nhụy có lông
[20]. Quả màu đỏ nâu, hình cầu hoặc gần hình cầu. Hạt màu nâu, hình cầu [20].
Mùa hoa: tháng 3-4, mùa quả: tháng 5-6 [20].
1.1.2. Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn.
Bản địa: Trung Quốc, Malaysia, Việt Nam.
4

Di thực: Úc, Brazil, Honduras, Hong Kong, Ấn Độ, Israel, Madagascar,
Mauritius, Mexico, Myanmar, New Zealand, Reunion, Bắc Châu Phi, Đài Loan,
Tỉnh thuộc Trung Quốc, Thái Lan, Zanzibar [34].

Hình 1.1. Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC
1.2.1. Thành phần hóa học
Hạt Vải (lệ chi hạch) chứa tanin, chất béo, saponosid, α- metylen
cyclopropyglycin [8], [12], [14].
1.2.2. Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, hạt Vải có vị ngọt chát, tính ôn, quy kinh can thận, có
tác dụng ôn trung lý khí, chỉ thống [8], [12], [14]. Công dụng chữa đau dạ dày, thoát
vị bẹn, đau kinh, tinh hoàn sưng đau. Liều dùng 3-6g/ ngày, thường dùng phối hợp
với trần bì, mộc hương [14].
Một số bài thuốc có hạt Vải:

Bài 1: Bài thuốc chữa tinh hoàn sưng đau [12], [14].
Hạt vải 49 hạt
Trần bì 36g
Lưu hoàng 16g
Tất cả 3 vị tán nhỏ, dùng nước cơm làm thành viên bằng hạt đậu xanh.
5

Cách dùng: dùng rượu chiêu thuốc, lúc nào đau uống 9 viên.
Bài 2: Bài thuốc chữa đau bụng kinh hoặc sau khi đẻ [8].
Hạt vải đốt tồn tính 20g
Hương phụ 40g
Tán nhỏ, trộn đều.
Cách dùng: Uống với nước muối nhạt hoặc nước cơm, ngày dùng 2- 3 lần, mỗi
lần 8g.
Bài 3: Bài thuốc chữa đau dạ dày [14].
Hạt vải 3g
Mộc hương 2g
Nghiền thành bột.
Cách dùng: Uống với nước, ngày 3 thang.
Bài 4: Bài thuốc chữa răng sưng đau có sâu [8].
Hạt vải sấy khô, tán bột, xát vào răng bị đau nhiều lần trong ngày.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.3.1.1. Thành phần hóa học
Từ dịch chiết ethanol 95%, đã phân lập 7 flavonoid glycoside: Litchioside D,
pinocembrin 7-O-neohesperidoside, pinocembrin 7-O-rutinoside , taxifolin 40-O-β-D-
glucopyranoside , kaempferol 7-O-neohesperidoside, tamarixetin 3-O-rutinoside,
phlorizin [42] và 4 chất sesquiterpene glucosides: Litchiosides A, litchiosides B,
pumilaside A, funingensin A [41]. Một nghiên cứu khác phân lập được một số
anthocyanidin: 2α,3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, 3α-

epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-epicatechin); 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-tetra-
hydroxyflavan-(4α-8-epicatechin) và một số acid hữu cơ: 2,5-dihydroxy-hexanoic
acid; coumaric acid, protocatechui acid [30].
6


Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt vải, đã phân lập 5 hợp chất phenolic: gallic
acid, procyanidin B2, α-gallocatechin , α-epicatechin, α-epicatechin-3-gallate [27].

1.3.1.2. Tác dụng sinh học
Tác dụng chống oxy hóa
Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được một số
anthocyanidin, sau đó thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm dọn
gốc tự do DPPH, TEAC. Kết quả cho thấy 3 chất: 2α,3α-epoxy-5,7,30,40-
tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, 3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-
epicatechin); 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-tetra-hydroxyflavan-(4α-8-epicatechin) có tác
dụng chống oxy hóa ở mức độ trung bình [30].
7

Một nghiên cứu khác thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm
dọn gốc tự do DPPH, ức chế lipid peroxydation, đối với các dịch chiết hạt Vải:
ethanol 90%, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước. Kết quả cho thấy dịch
chiết ethanol 50% có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [27].
Tác dụng chống ung thư
Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được: Litchioside D (1),
taxifolin-4-O-β-glucopyranoside (2), kaemferol 7-neohesperidoside (3), pulmilaside
A (4). Sau đó thử tác dụng gây độc trên in vitro đối với các dòng tế bào A549, LAC,
Hep-G2, HeLa bằng thử nghiệm đo màu MTT ở bước sóng 570nm, chất đối chiếu
admycin. Kết quả cho thấy chất (1), (2), (3), (4) đều có tác dụng ức chế các dòng tế
bào thử nghiệm [41], [42].

Tác dụng hạ đường huyết
Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt Vải, chiết phân đoạn với chloroform, n-
butanol; phần n-butanol chia thành 2 phần: phần tan trong nước (WS), phần không
tan trong nước (WI). Sau đó thử nghiệm tác dụng ức chế α-glucosidase trên in vitro
đối với dịch chiết ethanol 50%, các phân đoạn, phần WS, WI. Kết quả cho thấy:
dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh, phân đoạn n-butanol có tác dụng mạnh
nhất so với các phân đoạn, WI tác dụng mạnh hơn WS [39].
Từ dịch chiết ethanol 70% của hạt Vải, đã phân lập được α-
(methylenecyclopropyl) glycine, sau đó thử tác dụng trên chuột thấy có tác dụng hạ
đường huyết, giảm nồng độ glycogen ở gan [19].
Tác dụng ức chế tyrosinase
Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch chiết từ
hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước. Kết quả cho thấy
dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [27].
1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
1.4.1.1. Tác dụng hạ đường huyết
Từ cao chiết ethanol 50% của hạt Vải, thử tác dụng hạ đường huyết trên mô
hình gây tăng đường huyết bằng alloxan ở chuột nhắt trắng với liều uống 1,5g và 3g
8

cao/ kg thể trọng/ ngày (tương đương với 10g và 20g dược liệu khô), trong 8 ngày
liên tục, tác dụng hạ đường huyết ở liều 1,5g cao/ kg thể trọng/ ngày có tác dụng
mạnh hơn [10].

9

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Hạt của cây Vải Thiều (Hình 2.1) được thu hái ở Thanh Hà - Hải Dương vào
tháng 5 - 6 năm 2012. Mẫu cây được TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật,
Trường Đại học Dược Hà Nội, giám định tên khoa học là: Litchi chinensis Sonn.,
Họ Bồ hòn (Sapindaceae). Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực
vật, Trường Đại học Dược Hà Nội. Mã tiêu bản: HNIP/17853/13 (Phụ lục 1).
Dược liệu sau khi làm sạch, được phơi khô, bảo quản trong túi nilon kín để

nơi khô ráo.

Hình 2.1. Hình ảnh hạt Vải
2.1.2. Trang thiết bị
- Bếp cách thủy Memmert.
- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius.
- Tủ sấy Memmert, Shellab.
- Máy cô quay chân không Buchi R – 200.
- Hệ thống chấm mẫu Linomat 5, đèn soi tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365
nm (CAMAG).
- Máy siêu âm Wise clean (Hàn Quốc).
10

- Máy li tâm PLC-012E.
- Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức).
- Kính hiển vi.
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số 10.0 mega pixels (Panasonic).
- Thuyền tán.
- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm.
2.1.3. Hóa chất, dung môi
 Hóa chất sử dụng cho chiết xuất, nghiên cứu hóa học
- Chloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, n-butanol, methanol, aceton,
toluen, acid formic, acid acetic, acid sulfuric,…được mua tại các công ty hóa chất
đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Cồn 96% thực phẩm (Việt Nam).
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F
254
của hãng Merck.
- Các hóa chất, thuốc thử dùng cho định tính sơ bộ thành phần hóa học được
pha chế theo Dược Điển Việt Nam IV (các chuyên luận thuốc thử).

 Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) của hãng Sigma (Mỹ).
- Quercetin của hãng Sigma (Mỹ).
- Superoxid dismutase của hãng Sigma (Mỹ).
- Phenazine methosufate (PMS).
- Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH).
- Nitroblue tetrazolium (NBT).
- Các hóa chất thông thường khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi học
Nghiên cứu đặc điểm bột hạt Vải.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
Định tính xác định các nhóm hợp chất trong hạt Vải.
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải.
11

2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của dịch chiết toàn phần hạt Vải
với 2 thử nghiệm:
- Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH.
- Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.Chuẩn bị mẫu
 Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu đặc điểm vi học
Hạt Vải sấy ở 60
0
C, để nguội, tán nhỏ bằng thuyền tán, rây qua rây số 125,
phần trên rây được tán nhỏ và rây tiếp, lặp lại vài lần cho đến khi toàn bộ dược liệu
thành bột mịn [4]. Bột mịn được cho vào lọ, dán nhãn dùng để soi bột.
 Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh

học.
Hạt Vải sấy ở 60
0
C, để nguội, xay thành bột thô (1400/355), cho vào túi nilon
bảo quản nơi khô ráo.
2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học
Mỗi dược liệu có những mô học đặc trưng, được thể hiện một phần ở đặc
điểm bột dược liệu. Nghiên cứu vi học bằng cảm quan và kính hiển vi nhằm tìm ra
một số đặc điểm đặc trưng nhằm định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu.
- Quan sát cảm quan: Nhận định màu sắc, mùi, vị,
- Quan sát bằng kính hiển vi:
+ Quan sát mô tả đặc điểm điển hình (vỏ hạt, phôi, nội nhũ,…).
+ Chọn chất lỏng lên tiêu bản nhằm làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng
hơn, rõ hơn [4], [13].
2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.3.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải
a. Nguyên tắc
12

Chiết xuất: Sử dụng các quy trình chiết chuyên biệt dựa vào độ tan của các
chất trong dung môi khác nhau để loại bỏ các yếu tố cản trở phản ứng, che lấp màu
phản ứng, giúp nhận định kết quả [4], [9].
Phản ứng định tính:
- Chọn phản ứng đặc trưng thường là phản ứng màu, phản ứng kết tủa.
- Chọn thuốc thử trong định tính nhóm hợp chất phải đặc hiệu, nhạy, dễ phát
hiện [4], [9].
b. Tiến hành
Định tính xác định một số nhóm hợp chất phổ biến: Alcaloid, glycosid tim,
flavonoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử,
polysaccharid, chất béo, sterol, caroten [3], [5], [6].

- Alcaloid: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat, Dragendorff, Mayer.
- Glycosid tim: Phản ứng Liberman - Burchardt, Keller - Kiliani, Baljet, Legal.
- Flavonoid: Phản ứng Cyanidin, với kiềm, FeCl
3
5%, thuốc thử diazo.
- Coumarin: Phản ứng đóng mở vòng lacton, phản ứng với thuốc thử diazo.
- Anthranoid: Phản ứng Borntrager, vi thăng hoa.
- Saponin: Hiện tượng tạo bọt, phản ứng Salkowski.
- Tanin: Phản ứng với dung dịch FeCl
3
5%, chì acetat 10%, gelatin 1%.
- Acid hữu cơ: Phản ứng với natri carbonat.
- Acid amin: Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 3%.
- Đường khử: Phản ứng với thuốc thử Felling.
- Polysaccharid: Phản ứng với dung dịch Lugol.
- Chất béo: Hiện tượng vết mờ trên giấy lọc.
- Sterol: Phản ứng Liberman - Bouchardt.
- Caroten: Phản ứng với acid sulfuric đặc.
2.3.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt vải
a. Nguyên tắc
Hạt Vải được chiết bằng dung môi hòa tan nhiều nhóm hợp chất nhất
(methanol, ethanol 90%, ethanol 80%) thu được cao tổng. Từ cao tổng, dựa vào độ
13

tan của các hợp chất trong dung môi có độ phân cực khác nhau: n-hexan, ethyl
acetat, n-butanol. Sau đó xác định các nhóm hợp chất bằng phản ứng đặc hiệu.
b. Tiến hành
 Xác định độ ẩm dược liệu
Xác định độ ẩm theo phương pháp mất khối lượng do làm khô (Dược điển Việt
Nam IV- phụ lục 9.6) [7].

 Chiết xuất
Bột hạt Vải chiết siêu âm với ethanol 90%. Gộp các dịch chiết lại, cất thu hồi
dung môi, thu được cao ethanol toàn phần. Hòa tan nóng cao ethanol toàn phần với
lượng nước tối thiểu, thu được dịch lỏng. Đem dịch lỏng lắc lần lượt với các dung
môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, với mỗi loại dung
môi lắc kỹ đến khi dung môi nhạt màu thu được các phân đoạn dịch chiết. Dịch
chiết cất thu hồi dung môi ở 60
0
C thu được các cắn tương ứng.
 Định lượng các cắn phân đoạn bằng phương pháp cân
Cắn các phân đoạn đem sấy ở nhiệt độ 60
0
C tới khối lượng không đổi. Xác
định hàm lượng cắn các phân đoạn bằng phương pháp cân.
Công thức tính:
P(%) =
a
M × (1 - h)
× 100 %.
Trong đó:
P là hàm lượng cắn (%).
a là khối lượng cắn (g).
M là khối lượng dược liệu (g).
h là hàm ẩm dược liệu.
 Định tính các phân đoạn
- Định tính các phân đoạn bằng phản ứng hóa học: Định tính các nhóm hợp
chất dựa vào phản ứng đặc trưng với thuốc thử đặc hiệu tiến hành như mục
2.3.3.1.
- Định tính các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
14

Mẫu thử được chấm lên pha tĩnh là bản mỏng có tráng chất hấp phụ, sau đó
pha động (dung môi khai triển) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các
cấu tử của mẫu thử với vận tốc khác nhau tạo thành sắc ký đồ với R
f
tương ứng
(Dược điển Việt Nam IV- phụ lục 5.4) [7].
Pha tĩnh: Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F
254
của hãng Merck được hoạt hóa
ở nhiệt độ 105
0
C- 110
0
C trong 1 giờ.
Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để tách tốt nhất. Pha dung môi
theo đúng tỷ lệ, lót giấy lọc bên trong thành bình, đổ hệ dung môi vào bình chạy sắc
ký sao cho bề mặt dung môi cách vết chấm 0,8 cm. Bão hòa dung môi trong bình
chạy sắc ký, đậy kín để yên trong 1 giờ.
Chấm sắc ký: Hoà tan cắn trong methanol, chấm với 1 lượng dịch phù hợp.
Vết cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm, cách bờ ít nhất 1cm.
Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng trong bình sắc ký, đậy kín, để yên. Khi vết
dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu
đường dung môi, để bay hơi dung môi trong tủ hốt.
Phát hiện vết: Quan sát UV 254 nm và 366nm, sau đo dùng thuốc thử hiện
màu.
2.3.4. Nghiên cứu tác dụng sinh học
2.3.4.1. Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH
Phương pháp được thực hiện theo Blois (1958) [36].
 Nguyên tắc của phương pháp

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản
ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dược liệu. Hoạt
tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng
cách đo quang ở bước sóng λ= 517nm [15].
 Cơ chế dọn gốc tự do DPPH
Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển gốc tự do
sang trạng thái ổn định. Như vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự
15

do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm
[36].

 Tiến hành:
Mẫu thí nghiệm gồm: Cao hạt Vải toàn phần, Quercetin (chất đối chiếu)
Hỗn hợp phản ứng:
90 μl DPPH 150 μM (pha trong methanol)
10 μl Mẫu thí nghiệm (pha trong methanol)
Để trong bóng tối 30 phút ở 30
o
C. Sau đó đo giá trị mật độ quang (OD) bằng
máy đọc ELISA của hãng Labsystems tại bước sóng 517nm.
Mẫu thử: Mẫu thí nghiệm pha trong methanol + DPPH.
Mẫu trắng: Mẫu thí nghiệm pha trong methanol.
Mẫu chứng DPPH : DPPH pha trong methanol.
 Tính kết quả
Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH.
HTDG (%)=


×100

Xử lý số liệu bằng phần mềm exel.
2.3.4.2. Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid
Phương pháp được thực hiện theo Nishimiki (1972) [29].
 Nguyên tắc
Superoxid anion được sinh ra từ hệ thống PMS-NADH bởi quá trình oxy hóa
NADH, sau đó nó bị khử bởi NBT thành formazan có màu tím. Những chất chống
oxy hóa có khả năng dọn gốc superoxid anion làm giảm độ hấp thụ quang của hỗn
hợp phản ứng, được xác định bằng cách đo ở bước sóng 560nm.
16

 Cơ chế phản ứng
Hỗn hợp phản ứng xảy ra theo cơ chế [35]
NADH + MP
+
→ NAD
+
+ MPH.
MPH +2O
2
→ MP
+
+ 2O
2
• -
+ H
+
.
2O
2
• -

+ H
+
+ T
+
→ 2O
2
+ FH.
Trong đó:
MP
+
: 5-methylphenazonium cation của PMS.
MPH: 5,10-dihydro-5-methylphenazine .
T
+
: tetrazolium ion.
FH: Dạng formazan tương ứng của tetrazolium cation.
 Tiến hành:
Mẫu thí nghiệm gồm: Cao hạt Vải, Superoxid dismutase (chất đối chiếu)
Hỗn hợp phản ứng:
1ml NBT 100 μM(pha trong đệm phosphat pH 7,4)
1ml NADH 468 μM (pha trong đệm phosphat pH 7,4)
1ml mẫu thí nghiệm
Phản ứng bắt đầu xảy ra khi cho 100 μl PMS 60 μM (pha trong đệm phosphat
pH 7,4).
Để yên 15 phút. Sau đó đem đo mật độ quang (OD) bằng máy đọc ELISA của
hãng Labsystems tại bước sóng 560nm.
Mẫu thử: mẫu thí nghiệm + hỗn hợp phản ứng chứa NBT, NADH, PMS.
Mẫu trắng: chỉ có mẫu thí nghiệm pha bằng methanol + hỗn hợp phản ứng
chứa NBT, NADH.
Mẫu chứng: methanol+ hỗn hợp phản ứng chứa NBT, NADH, PMS.

 Tính kết quả
Hoạt tính dọn gốc tự do superoxid.
HTDG (%)=


×100
Xử lý số liệu bằng phần mềm exel.