Nghiên cứu điều chế và xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc kỳ phụ vương

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI




BÙI THỊ DUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾVÀ
XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN
CAO ĐẶC BÀI THUỐC
KỲ PHỤ VƢƠNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI 2013


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


BÙI THỊ DUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ VÀ
XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN
CAO ĐẶC BÀI THUỐC
KỲ PHỤ VƢƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Ngƣời hƣớng dẫn:
1. DS. Phạm Thái Hà Văn
2. TS. Trần Việt Hùng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền
2. Viện kiểm nghiệm



HÀ NỘI-2013


LỜI CẢM ƠN


Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
DS. Phạm Thái Hà Văn, người thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động
viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi, góp ý cho tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Bùi Hồng Cường, TS.
Trần Việt Hùng đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài.
Đồng thời, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn

Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Công nghiệp
dược, Khoa hóa lí Viện kiểm nghiệm đã tận tình giúp đỡ và tạo những điều
kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, nhưng rất quan trọng là lòng biết ơn chân tình được gửi tới
Gia đình, những người thân yêu gần gũi nhất đã cùng san sẻ và gánh vác công
việc để tôi yên tâm hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Bùi Thị Duyên


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Bài thuốc Kỳ phụ vƣơng 2
1.1.1. Hoàng kỳ 2
1.1.2. Phụ tử 5
1.2. Cao thuốc 7
1.2.1. Định nghĩa 7
1.2.2. Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng 7
1.3. Các phƣơng pháp xây dựng tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc 8
1.3.1. Tiêu chuẩn vật lí 8
1.3.2. Tiêu chuẩn định tính, định lượng 8
1.3.3. Tiêu chuẩn vi sinh 10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1. Đối tƣợng và phƣơng tiện nghiên cứu 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 11
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 11
2.2. Nội dung nghiên cứu 12
2.2.1. Bào chế cao đặc bài thuốc 12
2.2.2. Tiêu chuẩn hóa cao đặc bài thuốc Kỳ phụ 12
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 12
2.3.1. Xác định đặc điểm dược liệu nghiên cứu 12
2.3.2. Phương pháp định tính 13
2.3.3. Phương pháp định lượng 14
2.3.4. Phương pháp xây dựng các chỉ tiêu khác của cao đặc 16
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu 19
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1. Khảo sát nguyên liệu đầu vào 20
3.1.1. Hoàng kỳ 20
3.1.2. Phụ tử 21


3.2. Bào chế cao đặc 23
3.3. Định tính các thành phần hóa học 25
3.3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 25
3.3.2. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng 29
3.3.3. Định tính bằng quang phổ hấp thụ tử ngoại 30
3.4. Định lƣợng một số thành phần trong cao đặc 32
3.4.1. Định lượng alcaloid toàn phần 32
3.4.2. Định lượng saponin toàn phần 32
3.4.3. Định lượng flavonoid toàn phần 32
3.5. Khảo sát các chỉ tiêu khác của cao đặc 34
3.5.1. Tính chất 34
3.5.2. Hàm ẩm 34

3.5.3. Cắn, tro toàn phần, pH 35
3.5.4. Giới hạn nhiễm khuẩn 35
3.5.5. Giới hạn kim loại nặng 36
3.5.6. Xác định giới hạn aconitin trong cao 36
3.6. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc Kỳ Phụ 36
3.7. Bàn luận 37
3.7.1. Về nguyên liệu đầu vào 37
3.7.2. Về bào chế cao đặc 37
3.7.3. Về kết quả định tính 38
3.7.4. Về kết quả định lượng 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
KẾT LUẬN 40
KIẾN NGHỊ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CP Chinese Pharmacopoeia
DĐVN Dược điển Việt Nam
HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao
NXB Nhà xuất bản




DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thiết bị - máy móc nghiên cứu 11
Bảng 2.2. Hóa chất – dung môi sử dụng 11
Bảng 3.1. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử 23
Bảng 3.2. Kết quả hàm ẩm của dược liệu 23
Bảng 3.3. Hiệu suất bào chế cao đặc bài thuốc 24
Bảng 3.4. Kết quả định tính cao đặc bài thuốc 28
Bảng 3.5. Bảng giá trị Rf của aconitin, Phụ tử và cao đặc ở ánh sáng trắng 29
Bảng 3.6. Bảng giá trị Rf của Hoàng kỳ và cao đặc 30
Bảng 3.7. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong cao Kỳ phụ 32
Bảng 3.8. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong cao đặc 32
Bảng 3.9. Độ hấp thụ của các dung dịch rutin chuẩn 33
Bảng 3.10. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 33
Bảng 3.11. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong cao đặc 34
Bảng 3.12. Kết quả thử tính chất cảm quan 34
Bảng 3.13. Kết quả hàm ẩm của cao đặc 34
Bảng 3.14. Kết quả cắn, tro toàn phần và pH của cao đặc 35
Bảng 3.15. Kết quả giới hạn nhiễm khuẩn của cao đặc 35


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1. Đặc điểm hình thái và vi học vị thuốc Hoàng kỳ 21
Hình 3.2. Sắc kí đồ của Hoàng kỳ 21
Hình 3.3. Đặc điểm hình thái và vi học vị thuốc Phụ tử 22
Hình 3.4. Sắc kí đồ của aconitin và Phụ tử 22
Hình 3.5. Sơ đồ bào chế cao đặc 24
Hình 3.6. Sắc kí đồ của aconitin, Phụ tử và cao đặc Kỳ phụ 29
Hình 3.7. Sắc kí đồ của Hoàng kỳ và cao đặc Kỳ phụ 30
Hình 3.8. Phổ hấp thụ tử ngoại của Phụ tử và cao đặc Kỳ phụ 31

Hình 3.9. Phổ hấp thụ tử ngoại của Hoàng kỳ và cao đặc Kỳ phụ 31
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ và độ hấp thụ 33
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vấn đề kết hợp y học cổ truyền và y học hiện đại và hiện đại hóa y học cổ
truyền là xu hướng chung của thời đại.
Theo cách đánh giá của tổ chức y tế thế giới, Việt Nam không chỉ là nước có
bề dày lịch sử phát triển y học cổ truyền từ hàng nghìn năm nay, mà thực sự là nước
có tiềm năng phát triển y học cổ truyền và đã đạt được những thành tựu nhất định
trong việc kết hợp y học cổ truyền và y học hiện đại. Những thành tựu đó đã góp
phần tích cực trong việc giảm chi phí, nâng cao hiệu quả điều trị đối với một số
bệnh mạn tính.
Y học cổ truyền cần phải được hiện đại hóa để không có nguy cơ trở thành
một thứ đồ cổ trong chiều sâu của thời gian, mà sẽ là khoa học để phục vụ yêu cầu
của xã hội hiện đại.
Hiện đại hóa là cách dùng kiến thức, công cụ và các phương pháp nghiên
cứu khoa học – kĩ thuật hiện đại để hiểu và chứng minh cơ sở khoa học, nguyên lý,
lí thuyết và phương pháp chữa bệnh của y học cổ truyền, của bài thuốc và đặc biệt
là các chất có tác dụng dược lí trong cây thuốc.
Tuy nhiên hiện nay, chất lượng của những bài thuốc y học cổ truyền vẫn
chưa được kiểm soát chất lượng chặt chẽ. Việc xây dựng một tiêu chuẩn cho bài
thuốc là hết sức cần thiết, góp phần kiểm soát chất lượng, nâng cao hiệu quả điều trị
của bài thuốc y học cổ truyền dân tộc.
Hoàng kì và phụ tử là hai vị thuốc thường dùng trong y học cổ truyền
phương đông, kết hợp với nhau thành bài thuốc Kỳ phụ. Trong nghiên cứu bước
đầu đã xác định cao đặc bài thuốc có tác dụng bổ hỏa, ích khí, hỗ trợ trị hội chứng
thiểu năng tuần hoàn não, cải thiện các triệu chứng do huyết áp thấp gây ra, như:
đau đầu, chóng mặt, cơ thể luôn nhiễm lạnh, dễ nhiễm lạnh, suy giảm sức đề kháng
của cơ thể [24]. Đề tài «Nghiên cứu điều chế và xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao

đặc bài thuốc Kỳ phụ vương» được thực hiện với các mục tiêu:
1- Bào chế được cao đặc bài thuốc Kỳ phụ
2- Xây dựng được dự thảo tiêu chuẩn cao bài thuốc Kỳ phụ
2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Bài thuốc Kỳ phụ vƣơng
Bài thuốc xuất xứ từ bài Kỳ phụ thang: Hoàng kỳ, Phụ tử với lượng bằng
nhau, sắc nóng [11], [19]. Tác dụng trị chứng vong dương trụy mạch, ôn dương ích
khí cố biểu. Công dụng khí dương hư thì nhược, mồ hôi hư hãn không ngừng, chân
tay mỏi lười nhắc. Ngày nay, dùng bài thuốc này điều trị huyết áp thấp, tim đập quá
chậm [19], [23]. Bài thuốc Kỳ phụ gồm Hoàng kỳ 4 phần, Phụ tử 1 phần. Bài thuốc
có tác dụng cường tim, giãn mạch máu, bổ hỏa ích khí. Công dụng hỗ trợ hội chứng
thiểu năng tuần hoàn não, cải thiện các triệu chứng do huyết áp thấp gây ra như: đau
đầu, chóng mặt, cơ thể luôn lạnh, dễ nhiễm lạnh, suy giảm sức đề kháng của cơ thể.
Chống chỉ định: phụ nữ có thai, trẻ em dưới 15 tuổi, sốt, đang chảy máu, người có
cơ địa nóng trong (tăng chuyển hóa cơ sở, basedow) [38].
1.1.1. Hoàng kỳ
(Radix Astragali)
Là rễ phơi khô của cây Hoàng kỳ Mông cổ Astragalus membranaceus Fisch;
Bge. var. mongholicus (Bge) Hsiao; hoặc cây Hoàng kỳ Mạc giáp: Astragalus
membranaceus (Fisch) Bge. Họ Đậu Fabaceae [7], [32].
1.1.1.1. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chính trong Hoàng kỳ là flavonoid, saponin,
polysaccharid ngoài ra còn có một số chất thuộc nhóm amino acid, đường khử…
[1], [29].
 Polysacharid :
Ba astragalan I, II, III được phân lập từ dịch chiết nước rễ Hoàng kỳ Astragalus
membranaceus var. monghlicus [1], [14].

Thứ Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge var. monghlicus (Bge) Hsiao còn có
hai glucan (AG – 1 và AG – 2) và hai heterosaccharid (AH – 1 và AH – 2). AH – 1
là một polysacharid acid [1], [13].
 Saponin :
3

Trong những năm gần đây có khoảng 40 saponin được tách và xác định [29], gồm 9
astragalosid: astragalosid I - VII, isoastragalosid I, II và 2 saponin kiểu olean:
astragalosid VIII và soyasaponin I [1]. Ngoài ra, Hoàng kỳ còn có 3 saponin (trong
đó có cis – tramembranin I, astramembranin II) và nhiều chất khác (sucrose, β –
sitosterol, calycosin, formononetin …) [1].
 Isoflavonoid:
Có khoảng 30 flavonoid được phân lập từ Hoàng kỳ, thuộc các nhóm: flavon,
isoflavon, isoflavanon và pterocarpan [29].
1.1.1.3. Tác dụng dược lý :
 Tác dụng trên hệ miễn dịch :
Polysaccharid được chiết từ Hoàng kỳ làm tăng khả năng thực bào của các đại
thực bào và bạch cầu đa nhân, tăng hoạt tính miễn dịch, điều chỉnh chức năng của tế
bào T đã bị suy, tăng hoạt tính interleukin – 2 [1], [29]. Nước sắc Hoàng kỳ làm
tăng số lượng đại thực bào và kích thích hoạt tính của chúng [1], [29]. Dịch chiết
nước Hoàng kỳ bổ sung vào nước uống làm tăng khả năng miễn dịch cho gà. Đối
với những con gà khỏe mạnh được thêm dịch chiết nước Hoàng kỳ vào nước uống
bảo vệ chúng khỏi tác động của bệnh virus Newcastle và virus cúm gà H5 [29].
 Tác dụng kích thích phát triển cơ thể: Hoàng kỳ làm tế bào sinh trưởng nhanh
hơn, với lượng tế bào hoạt động tăng lên nhiều, tuổi thọ tế bào kéo dài [1].
 Tác dụng trên tim: Hoàng kỳ có tác dụng làm tăng co bóp tim bình thường. Nếu
tim suy thì tác dụng càng rõ. Dùng liều cao tiêm màng bụng cho chó, sau một thời
gian có thể làm sóng P đảo, khoảng ST kéo dài [1]. Saponin Hoàng kỳ làm tăng sức
co cơ tim cô lập của chuột cống trắng [1].
 Tác dụng chống oxy hóa: Các thành phần khác nhau của dịch chiết Hoàng kỳ có

tác dụng chống oxy hóa khác nhau, flavonoid toàn phần và saponin toàn phần có tác
dụng chống oxy hóa mạnh còn polysaccharid toàn phần lại có tác dụng chống oxy
hóa yếu [29].
 Tác dụng giãn mạch hạ huyết áp:
4

Tiêm dịch chiết Hoàng kỳ vào tĩnh mạch chó, mèo đã gây mê, hoặc thỏ không
gây mê, thấy giãn mạch và hạ huyết áp kéo dài. Hoàng kỳ làm giãn mạch nên làm
máu tới cơ quan nhiều hơn, sự dinh dưỡng tốt hơn, đồng thời làm huyết áp giảm.
Do giãn mạch tim và mạch thận nên máu qua thận nhiều hơn dẫn đến lợi tiểu [1].
Gần đây, Hoàng kỳ được nghiên cứu nhiều với thiểu năng tuần hoàn não và bệnh lí
tai biến mạch máu não. Hoàng kỳ có tác dụng gây giãn mạch và hiện tượng thẩm
thấu huyết tương qua mao mạch. Trong lâm sàng Hoàng kỳ được sử dụng điều trị
nhũn não [1].
 Tác dụng trên gan: Saponin astramembrannin I của Hoàng kỳ làm tăng sinh
tổng hợp AND của chuột nhắt trắng đã cắt một phần gan và trong quá trình tái sinh
gan, sự liên kết của [3H] thymidin tăng lên [1].
 Tác dụng chống viêm: Astramembramin I ức chế sự tăng tính thấm mạch do
serotonin hoặc histamin ở chuột cống trắng [1].
 Tác dụng trên hệ sinh dục: Hoàng kỳ gây hưng phấn co bóp tử cung cô lập của
chuột cống có thai nhưng lại ức chế co bóp của ruột thỏ cô lập [1].
 Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng kỳ có tác dụng kháng khuẩn với trực khuẩn lị
shigella, liên cầu khuẩn dung huyết, phế cầu, tụ cầu vàng [1]. Astragalosides và
polysaccharides có tác dụng ức chế virus viêm gan B (HBV), ức chế sự phát triển
của tế bào gan HepG 2.2.15. Một nghiên cứu khác cho thấy rằng Astragalosid I có
tác dụng ức chế HBV ở nồng độ 13,2 mg/l [29].
 Ngoài ra, Hoàng kỳ còn có các tác dụng khác như tác dụng trên bệnh đái tháo
đường do tác dụng của polysaccharid, bảo vệ tế bào thần kinh, bảo vệ tế bào gan do
flavonoid toàn phần có tác dụng trên cả in vitro và in vivo [29].
 Độc tính: Hoàng kỳ có độc tính cấp thấp. Cho chuột nhắt trắng uống liều

100g/kg, là liều gấp 500 lần liều bình thường dùng cho người, không thấy chuột
chết và không thấy có biểu hiện tác dụng phụ có hại [1].
 Tác dụng: Hoàng kỳ có vị ngọt tính ôn, đi vào 2 kinh phế và tỳ, có tác dụng bổ
phế, thăng dương, liễm hãn, lợi tiểu, giải độc [1], [3]. Công dụng: Hoàng kỳ được
dùng sống để chữa bệnh đái tháo đường, đái đục, đái buốt, phù thũng, viêm thận
5

mạn tính, albumin niệu, lở loét, phong thấp, đau xương. Dạng tẩm mật sao chữa suy
nhược lâu ngày, ra nhiều mồ hôi.
 Liều dùng: ngày dùng 6- 12g ở dạng sống, 3-9g ở dạng sao tẩm, sắc uống hoặc
chế thành cao hoặc viên [1].
1.1.2. Phụ tử
(Radix Aconiti lasteralis)
Là rễ củ con đã phơi hay sấy khô của cây Ô đầu (Aconitum fortunei Hemsl.
hoặc Aconitum carmichaeli Debx.) họ Hoàng liên (Ranunculaceae) [2], [7], [32].
1.1.2.1. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chính trong phụ tử là alcaloid, flavonoid, polysaccharid
ngoài ra còn có một số chất thuộc nhóm glycosid, sterol, acid hữu cơ… [2], [26].
- Alcaloid trong Phụ tử chia làm 2 nhóm chính :
+ alcaloid diterpenoid: bao gồm alcaloid diester , alcaloid monoester, alcamin.
+ alcaloid nhóm khác: nhóm higenamin (có tác dụng cường tim khá mạnh),
corydin, amin [26].
- Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester và các alcaloid khác khác nhau tùy loài,
tùy thời kì thu hái, bộ phận dùng cũng như địa phương trồng [9].
1.1.2.2. Tác dụng sinh học
 Tác dụng trên tim:
Nước sắc Phụ tử có tác dụng co cơ tim đối với tim cô lập bình thường [15], tác
dụng cường tim của Phụ tử do các nguyên nhân sau:
+ Higenamin là chất có trong Phụ tử có tác dụng cường tim do là chất chủ vận
đối với hệ β- adrenergic.

+ Nồng độ ion Ca
++

trong các chế phẩm của ô đầu và Phụ tử, thời gian sắc càng
lâu, nồng độ Ca
++
càng cao và tác dụng cường tim càng rõ rệt, đồng thời độc
tính càng giảm (làm mất tác dụng phụ gây loạn nhịp tim) [9], [15].
Trong quá trình chế biến, alcaloid toàn phần giảm và độc tính giảm rõ rệt [27]
6

 Tác dụng trên huyết áp: Aconitin có tác dụng làm hạ huyết áp. Nước sắc Phụ tử
có tác dụng hạ huyết áp trên chó trong thời gian ngắn, tác dụng này bị atropin đối
kháng [2], [15].
 Tác dụng giảm đau: Phụ tử sau chế biến thì độc tính và tác dụng giảm đau cũng
giảm đi đáng kể. Các tác dụng giảm đau do các chất như: aconitin, mesaconin,
benzoyl aconin, acetyl aconin, hoặc do phong tỏa dẫn truyền thần kinh, điều này
giải thích tại sao Phụ tử chế lại không hoặc ít có tác dụng giảm đau [2].
 Tác dụng khác: Ngoài các tác dụng nói trên, Phụ tử còn có các tác dụng khác
như:
- Tác dụng chống viêm: nước sắc Phụ tử có tác dụng chống viêm khớp cổ chân
chuột do formandehyd gây nên. Tác dụng chống viêm của Phụ tử sống mạnh hơn
nhiều so với Phụ tử chế [27].
- Tác dụng hạ huyết áp: nước sắc Phụ tử có tác dụng hạ áp khi tiêm tĩnh mạch chó
mèo đã gây mê. Tác dụng này nhanh và ngắn, thông qua cơ chế giãn mạch trong đó
có mạch vành [2].
- Tác dụng đối với hệ thần kinh, tác dụng tăng miễn dịch cơ thể, tác dụng chống
sốc và hạ thân nhiệt… [25].
 Độc tính: Độc tính của Phụ tử do alcaloid diester (aconitin, mesaconitin,
hypaconitin) gây ra, chúng tác động chủ yếu lên tim và hệ thần kinh trung ương [2],

[15], [25]. Do Phụ tử chế các thành phần trên giảm đáng kể, độc tính cũng giảm đi
nhiều lần [27], [31].
 Công dụng:
Hồi dương cứu nghịch: dùng trong trường hợp vong dương muốn thoát, sử
dụng trong trường hợp trụy tim mạch cấp, hạ huyết áp, mạch nhỏ muốn tuyệt, chân
tay quờ quạng. Tuy độc tính của Phụ tử đã giảm nhưng khi dùng vẫn phải hết sức
thận trọng. Một số lương y dùng với liều cao 100g nhưng kết hợp với Can khương,
Cam thảo (bài tứ nghịch thang), rồi sắc lâu [2], [17].
Bổ dương, bổ hỏa: điều trị chứng tâm thận dương hư, mệt mỏi choáng váng, sợ
lạnh [2], [14].
7

Khứ hàn, chỉ thống: dùng trong chứng phong hàn thấp tí, đau nhức xương
khớp, chân tay lạnh [14].
Ấm thận hành thủy: dùng trong trường hợp thủy thũng [2], [9].
Liều dùng: ngày dùng 4 – 12 g dạng thuốc sắc [7].
Kiêng kị: phụ nữ có thai, âm hư nội nhiệt, trẻ em dưới 15 tuổi không được
dùng. Không nên phối hợp với Bán hạ, Qua lâu, Bối mẫu, Bạch cập, Bạch liễm [7].
1.2. Cao thuốc
1.2.1. Định nghĩa
Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các
dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp.
Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng
trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai).
Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao
không quá 20%.
Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao khô không
được có độ ẩm lớn hơn 5% [7].
1.2.2. Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng
Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau

đây:
Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao.
Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả
trong chuyên luân riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng.
Định tính: phải có phản ứng định tính của các dược liệu bào chế cao thuốc.
Định lượng: tùy từng cao cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt chất trong cao.
Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác):
Cao đặc không quá 20%.
Cao khô không quá 5%
Ngoài các chỉ tiêu trên theo tiêu chuẩn DĐVN III, trong DĐVN IV còn thêm các
chỉ tiêu sau:
8

Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng.
Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 13.6 Thử giới hạn
nhiễm khuẩn [7].
1.3. Các phƣơng pháp xây dựng tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc
- Theo DĐVN IV, cao thuốc phải đạt một số chỉ tiêu nhất định. Căn cứ vào các tài
liệu tham khảo làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cho một cao thuốc cụ thể.
- Quy trình xây dựng tiêu chuẩn cao thuốc phải được thực hiện một cách logic, xây
dựng phải đi đôi với kiểm định.
1.3.1. Tiêu chuẩn vật lí
- Đặc điểm hình thái: quan sát, mô tả đặc điểm cảm quan cao thuốc về thể chất, màu
sắc, mùi vị, đưa ra tiêu chuẩn cảm quan cho cao thuốc [7].
- Hàm ẩm: mỗi cao thuốc phải đạt mức hàm ẩm theo quy định, cao đặc, cao khô có
mức hàm ẩm khác nhau [7]. Để xác định hàm ẩm của cao thuốc có nhiều cách:
phương pháp mất khối lượng do làm khô [7], phương pháp cất kéo với dung môi
hữu cơ [7], hoặc dùng thiết bị máy móc hiện đại (Máy xác định hàm ẩm Precisa XM
120).
- Cắn, tro toàn phần: lượng cắn xác định được trong dược liệu và tro toàn phần của

dược liệu đã được xây dựng thành tiêu chuẩn trong Dược điển, có thể dùng phương
pháp này xác định cắn và tro toàn phần của cao thuốc.
- Giới hạn kim loại nặng: dựa vào phương pháp xác định giới hạn kim loại nặng đã
được xây dựng trong DĐVN IV để xây dựng giới hạn kim loại nặng trong cao
thuốc.
1.3.2. Tiêu chuẩn định tính, định lượng
Phương pháp định tính
- Định tính sàng lọc bằng phản ứng hóa học [15], [20].
- Định tính bằng đo phổ hấp thụ tử ngoại: sử dụng phương pháp quét phổ UV để
xác định cực đại hấp thụ, so sánh phổ UV của cao đặc với phổ UV của các vị thuốc.
Mỗi vị thuốc có cực đại hấp thụ đặc trưng cho nó, đây là căn cứ để phân biệt các vị
thuốc với nhau cũng như giúp nhận biết sự có mặt của vị thuốc trong cao đặc: định
9

tính alcaloid bằng đo phổ hấp thụ tử ngoại [8], [23], [33]; định tính saponin bằng đo
phổ hấp thụ tử ngoại [23].
- Định tính bằng sắc kí lớp mỏng: phương pháp sắc kí lớp mỏng là phương pháp
đơn giản, tin cậy, chính xác, được sử dụng xây dựng tiêu chuẩn trong bất kì Dược
điển nào. Chiết xuất hoạt chất cần định tính và chọn hệ dung môi thích hợp, được
sắc kí đồ đặc trưng cho mỗi chất.
+ Phương pháp định tính alcaloid đã được thực hiện trên nhiều tài liệu như DĐVN
IV [7], CP (2010) [32], Dược điển Hồng Kông 2011 [34]. Các phương pháp khác
nhau sử dụng các cách chiết khác nhau và hệ dung môi khác nhau, tuy nhiên về
nguyên tắc chiết giống nhau. Dùng chất đối chiếu có ý nghĩa so sánh các kết quả
của các phương pháp này.
+ Phương pháp định tính saponin: qua tham khảo các tài liệu nhận thấy: quy trình
định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng trong DĐVN IV [7] giống CP (2010) [32].
Ngoài ra, trong một số tài liệu khác cũng xây dựng quy trình có một số điểm khác
như Dược điển Hồng Kông [34].
+ Phương pháp định tính flavonoid: trong Hoàng kỳ, ngoài saponin, lượng

flavonoid nhiều thứ hai, việc định tính flavonoid trong Hoàng kỳ so sánh với cao
đặc là lựa chọn thứ hai sau saponin. Phương pháp định tính flavonoid cũng được
xây dựng trong CP (2010) [32].
- Định tính bằng HPLC: đây là phương pháp ưu việt có thể dùng để định tính hay
định lượng cho kết quả đáng tin cậy. Chính vì thế có rất nhiều tài liệu dùng HPLC
để xây dựng tiêu chuẩn như: Dược điển Hồng Kông sử dụng HPLC xác định pic
của benzoylmesaconin trong Phụ tử. Huang W. và các cộng sự đã xác định được 17
pic của 17 flavonoid và 12 pic của 12 saponin [29]. Qi L – W. và các cộng sự đã sử
dụng HPLC để xác định 6 loại isoflavonoid chính và 4 loại saponin chính [29].
- Xác định giới hạn bằng sắc kí lớp mỏng: sử dụng một chất chuẩn làm đối chiếu,
so sánh sắc kí đồ của chất chuẩn và cao đặc. Trong thành phần của Phụ tử có chứa
aconitin rất độc, yêu cầu sau khi bào chế cao lượng aconitin phải đạt ở mức độ cho
phép. Chính vì vậy có thể xác định giới hạn aconitin bằng sắc kí lớp mỏng, yêu cầu
10

trên sắc kí đồ của cao không có vết trùng với vết của aconitin khi chuẩn bị trong
cùng điều kiện. Phương pháp được tiến hành chiết xuất giống cách định tính
alcaloid trong Phụ tử và cao đặc theo phương pháp của DĐVN IV [7], cũng như CP
(2010) [32].
Phương pháp định lượng
Định lượng các thành phần trong cao đặc có rất nhiều phương pháp khác nhau,
được chia thành các phương pháp chính sau:
- Định lượng bằng phương pháp cân: đây là phương pháp cổ điển, đơn giản nhất
tuy nhiên cũng là phương pháp cho kết quả không tin cậy nhất do phương pháp này
gây nhiều sai số nhất. Có thể dùng phương pháp cân để định lượng alcaloid toàn
phần, định lượng saponin toàn phần [7].
- Định lượng bằng phương pháp acid – base: phương pháp này đã được xây dựng
để định lượng alcaloid toàn phần trong tài liệu Phụ tử - vị thuốc quý [9], DĐVN IV
[7], CP (2005) [33].
- Định lượng bằng phương pháp đo độ hấp thụ: đo quang ở bước sóng 500 nm để

định lượng flavonoid toàn phần trong Hoàng kỳ [35]
- Định lượng bằng HPLC: phương pháp HPLC là phương pháp đáng tin cậy nhất.
Zhang W. và các cộng sự sử dụng phương pháp HPLC để định lượng Astragalosid
IV, được là 0,075% [35]; định lượng alcaloid diester [32].
1.3.3. Tiêu chuẩn vi sinh
Trong DĐVN III có yêu cầu cụ thể ở phụ lục 10.7 về giới hạn nhiễm khuẩn.
Trong DĐVN IV còn bổ sung thêm phương pháp Thử giới hạn nhiễm khuẩn phụ
lục 13.6 DĐVN IV [7]. Tùy vào cách dùng của cao thuốc (dùng ngoài, đường
uống, ) và căn cứ vào yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn của cao thuốc, thực hiện theo
phương pháp xác định giới hạn nhiễm khuẩn đã xây dựng trong Dược điển để tiêu
chuẩn hóa cao thuốc.
11

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phƣơng tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
+ Phụ tử và Hoàng kỳ được cung cấp bởi Công ty Phùng Gia Phương, Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương.
+ Cao đặc bài thuốc Kỳ phụ.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
Thiết bị, máy móc:
Bảng 2.1. Thiết bị - máy móc nghiên cứu
STT
Thiết bị, máy móc
Xuất sứ
1
Cân phân tích Sartorius BP 221S
Đức
2
Cân kĩ thuật Precisa

Thụy sĩ
3
Ấm sắc thuốc
Hàn Quốc
4
Tủ sấy Memmert
Đức
5
Máy xác định hàm ẩm Precisa XM 120
Thụy sĩ
6
Máy đo tử ngoại UV
Nhật
7
Máy siêu âm
Hàn Quốc
8
Bộ dụng cụ cất dung môi
Hàn Quốc
9
Máy ảnh Canon 16.0 mega pixels.
Trung Quốc
10
Hệ thống thiết bị sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao
Linomat 5
Thụy sĩ
Hóa chất - dung môi:
Bảng 2.2. Hóa chất – dung môi sử dụng
STT
Hóa chất

Tiêu chuẩn
Xuất sứ
1
Cloroform

AR
Trung Quốc
2
Methanol
AR
Trung Quốc
3
Ethyl acetat
AR
Trung Quốc
4
Diethyl ether
AR
Trung Quốc
5
Acid formic
AR
Trung Quốc
6
Aceton
AR
Trung Quốc
7
n-butanol
AR

Trung Quốc
8
Cồn tuyệt đối
AR
Trung Quốc
9
Nước cất 1 lần
DĐVN III
Việt Nam
10
Cồn 95
0

DĐVN III
Việt Nam
- Bản mỏng sắc kí Silica gel 60 F
254
(Merck).
12

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Bào chế cao đặc bài thuốc
- Khảo sát dược liệu đầu vào
- Chiết xuất bào chế dạng cao đặc
- Xác định hiệu suất bào chế cao
2.2.2. Tiêu chuẩn hóa cao đặc bài thuốc Kỳ phụ
- Khảo sát một số chỉ tiêu vật lý của cao đặc
- Khảo sát chỉ tiêu định tính: định tính các nhóm chất trong cao đặc bằng: phản ứng
hóa học, phương pháp sắc kí lớp mỏng, phương pháp đo quang phổ tử ngoại
- Khảo sát chỉ tiêu định lượng: Định lượng một số thành phần trong cao đặc:

alcaloid toàn phần, saponin toàn phần, flavonoid toàn phần
- Khảo sát chỉ tiêu vi sinh: xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao Kỳ phụ
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xác định đặc điểm dược liệu nghiên cứu
- Quan sát, mô tả hình thái các vị thuốc theo tiêu chuẩn DĐVN IV [7], [20].
- Quan sát mô tả đặc điểm dược liệu bằng kính hiển vi theo tiêu chuẩn DĐVN IV
[20], [21].
2.3.2. Phương pháp bào chế cao
- Từng vị dược liệu được thái mỏng kết hợp theo tỉ lệ:
Công thức: Hoàng kỳ 80 %
Phụ tử 20 %
- Sắc 3 lần, mỗi lần sôi 2h. Gộp dịch chiết, cô cách thủy tới thể chất cao đặc [24]
- Xác định độ ẩm của cao đặc
- Xác định hiệu suất chiết.
13

2.3.2. Phương pháp định tính
2.3.2.1. Chiết xuất, phân tích sơ bộ các nhóm chất theo phương pháp phân tích sàng
lọc các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng phản ứng hóa học [7].
2.3.2.2. Định tính alcaloid bằng sắc kí lớp mỏng
- Dung dịch thử: Lấy khoảng 5g bột Phụ tử hoặc lượng cao đặc tương đương, thêm
2 ml amoniac đậm đặc, để yên 20 phút, thêm 30 ml chloroform, lắc trong 30 phút.
Thu được dịch chiết, lọc qua giấy lọc, cất thu hồi dung môi. Cắn còn lại hòa trong
2ml methanol làm dung dịch chấm [7], [21], [33].
- Dung dịch đối chiếu: aconitin 1µg/ml
- Bản mỏng : silica gel G đã hoạt hoá ở 110
o
C trong 1 giờ
- Hệ dung môi khai triển: chloroform : acetone : acid formic ( 9: 2,75: 1,5 ).
- Thể tích chấm: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 4 l mỗi dung dịch trên.

- Phát hiện: ở bước sóng 254 nm và 366 nm. Hiện màu bằng TT Dragendoff, quan
sát ở ánh sáng thường.
2.3.2.3. Định tính flavonoid bằng sắc kí lớp mỏng
- Dung dịch thử: Lấy khoảng 2g bột dược liệu, lượng cao đặc tương đương, thêm 30
ml ethanol, đun sôi hồi lưu 20 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên các thủy tới khô. Cắn
được hòa tan trong 15 ml dd NaOH 0,3 %, lọc. Điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl
2N tới pH 5 – 6. Dịch này được lắc với 15 ml ethylacetat. Lọc dịch chiết qua giấy
lọc có sẵn 1 ít Na
2
SO
4
. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy tới khô. Cắn được hòa tan
trong 1 ml ethyl acetat làm dịch chấm sắc kí [32].
- Dược liệu đối chiếu: Hoàng kỳ 1 tiến hành xử lý như Hoàng kỳ 2
- Bản mỏng: Silica gel G hoạt hóa ở 110 C trong 1 giờ.
- Hệ dung môi khai triển: Cloroform : methanol (10 : 1)
- Thể tích chấm: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch.
- Phát hiện: ở bước sóng 254 nm và 366 nm.
2.3.2.4. Định tính alcaloid bằng đo phổ hấp thụ tử ngoại
- Lấy khoảng 5g Phụ tử sống, lượng cao đặc tương đương. Thêm 30 ml chloroform
và 5 ml amoniac, lắc trong 20 phút, lọc. Dịch lọc cho vào bình gạn, thêm 20 ml
14

dung dịch H
2
SO
4
0,5 N lắc mạnh, để yên cho tách lớp, gạn lấy lớp acid. Lấy chính
xác 1,00 ml đem pha loãng thành 10 ml đem đo quang. [9].
- Quét phổ hấp thụ tử ngoại của các dung dịch ở bước sóng từ 200 đến 400 nm.

2.3.2.5. Định tính Saponin bằng đo phổ hấp thụ tử ngoại
- Lấy 10 g bột Hoàng kỳ, lượng cao đặc tương đương, thêm 30 ml ethanol chiết siêu
âm ở 60
o
C trong 30 phút, thu dịch chiết, lọc. Thêm 20 ml dung dịch H
2
SO
4
0,5M
đun siêu âm trong 60 phút. Thu dịch chiết, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc lắc với
Cloroform 3 lần (mỗi lần 5 ml), cất thu hồi dung môi. Cắn còn lại hòa tan trong 2
ml ethanol. Lấy 5 l pha loãng bằng ethanol đến 10ml [24].
- Quét phổ hấp thụ tử ngoại các dung dịch ở các bước sóng từ 200 đến 400 nm.
2.3.3. Phương pháp định lượng
2.3.3.1. Định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp acid – base:
Cân chính xác khoảng 10g bột dược liệu, lượng cao đặc tương đương, vào
bình nón có nút mài dung tích 250ml. Thêm 50ml hỗn hợp ether – cloroform ( tỉ lệ
3:1 ) và 4ml dd amoniac đậm đặc. Đậy nắp, lắc kĩ, để qua đêm, gạn, lọc thu dịch.
Lắc bã với 50ml hỗn hợp ether – chloroform ( tỉ lệ 3:1 ), lọc, thu dịch lọc. Gộp dịch
lọc và dịch rửa. Bốc hơi trên cách thủy đến khô ở nhiệt độ thấp (khoảng 60 – 65
o
).
Hòa tan cắn bằng 5ml ethanol, thêm chính xác 15ml H
2
SO
4
0,02N và 15ml nước cất
mới đun sôi để nguội, 3 giọt chỉ thị đỏ methyl. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH
0,02 N đến khi xuất hiện màu vàng [7], [9].
Mỗi ml dung dịch H

2
SO
4
0,02 N tương đương với 12,9 mg aconitin.

Hàm lượng alcaloid toàn phần được tính theo công thức:
X % =
15 × K
1
- V
2
× K
2
P × (100 - H)
× 12,9 × 100 %

Trong đó:
- X %: hàm lượng alcaloid toàn phần tính trên mẫu khô tuyệt đối.
- P: khối lượng dược liệu (khối lượng cao) khô kiệt (g)
- V
2
: số ml dung dịch NaOH 0,02 N đã dùng (ml)
- K
2
: hệ số hiệu chỉnh của NaOH
15

- K
1
: hệ số hiệu chỉnh của H

2
SO
4

- H: độ ẩm dược liệu (%)
2.3.3.2. Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp cân
Cân chính xác khoảng 5g cao đặc, hòa tan trong 100 ml nước cất, lọc. Lắc loại
tạp với ether dầu hỏa (30ml × 3). Lớp nước đun nóng nhẹ để loại ether dư. Lắc
nhiều lần với n-buthanol đến kiệt saponin (lớp n-butanol nhạt màu và không còn
phản ứng tạo bọt). Gộp dịch chiết n-butanol, cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn trong
10ml ethanol 80
0
, tạo tủa với hỗn hợp aceton : ether (4:1) với thể tích gấp 3 lần thể
tích saponin trong ethanol. Ly tâm lấy tủa, dịch còn lại tiếp tục thêm hỗn hợp aceton
: ether (4:1) tới khi tủa hết saponin. Gộp tủa, sấy khô tới khối lượng không đổi ở
80
0
C, cân.
Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức:
X % =
a
m
× 100
Trong đó: X: Hàm lượng hoạt chất có trong cao đặc (%)
a: Khối lượng cắn (g)
m: Khối lượng cao đặc khô tuyệt đối (g)
2.3.3.3. Định lượng flavonoid toàn phần
Định lượng cắn EtOAc:
Cân chính xác khoảng 5g cao đặc bài thuốc, hòa tan trong 50 ml nước cất, lọc.
Lắc loại tạp với ether dầu hỏa (30 ml × 3). Lớp nước đun nóng nhẹ để đuổi hết ether

dư. Lắc nhiều lần với ethyl acetat đến khi kiệt flavonoid (lớp dung môi nhạt màu).
Gộp các dịch chiết lại, cô cách thủy tới cắn, sấy khô cắn tới khối lượng không đổi ở
80
0
C, cân [10].
Hàm lượng cắn EtOAc được tính theo công thức:
X % =
a
m
× 100
Trong đó: X: Hàm lượng hoạt chất có trong cao đặc (%)
a: Khối lượng cắn (g)
m: Khối lượng cao đặc khô tuyệt đối (g)
16

Phương pháp đường chuẩn:
- Pha dung dịch Rutin chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,2 g rutin cho vào bình định
mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ 100 ml, lắc kĩ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch
này vào bình định mức 100 khác. Thêm nước tới vạch, lắc kĩ.
- Xây dựng đường chuẩn:Lấy chính xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 ml dung dịch
chuẩn cho vào bình định mức 25 ml, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi bình rồi cho
thêm 1ml dung dịch NaNO
2
5% ở mỗi bình, lắc kĩ, để yên 6 phút. Thêm 1ml dung
dịch nhôm nitrat 10%, trộn kĩ, để yêu 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch NaOH 10%.
Thêm nước tới vạch, lắc kĩ, để yên 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm, vẽ
đường chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành.
- Dung dịch thử: Lấy cắn ethyl acetat ở trên tiếp tục định lượng bằng phương pháp
đo độ hấp thụ. Hòa tan cắn bằng MeOH, thêm MeOH vừa đủ 100. Lấy chính xác
2,0 ml dung dịch này hòa tan vào bình định mức 10, thêm nước vừa đủ, lắc kĩ. Lấy

chính xác 3,0 ml dd thử cho vào bình định mức 25, thêm 3,0 ml nước rồi cho thêm
1ml dung dịch NaNO
2
5% ở mỗi bình, lắc kĩ, để yên 6 phút. Thêm 1ml dung dịch
nhôm nitrat 10%, trộn kĩ, để yêu 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch NaOH 10%. Thêm
nước tới vạch, lắc kĩ, để yên 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm [35].
2.3.4. Phương pháp xây dựng các chỉ tiêu khác của cao đặc
2.3.4.1. Xác định tính chất vật lí: quan sát, mô tả tính chất cao đặc về cảm quan (thể
chất, mùi vị, màu sắc, độ đồng nhất….) [7].
2.3.4.2. Hàm ẩm:
- Xác định bằng máy đo độ ẩm Precisa XM 120 : cân khoảng 1 g cao, trải đều trên
đĩa bạc, đặt lên cân. Sấy 105
o
C. Sau khi máy đo xong, đọc kết quả hàm ẩm.
- Xác định theo phương pháp cất kéo với dung môi hữu cơ theo phụ lục 12.13
DĐVN IV.
2.3.4.3. Cắn: xác định theo phụ lục 12.15 DĐVN IV:
Lấy chính xác khoảng 2,00g hoặc 2,0 ml mẫu thử cho vào 1 cốc đáy bằng đường
kính khoảng 50 mm và chiều cao khoảng 30 mm. Cô đến khô cạn trên cách thủy và
17

sấy ở 100 - 105
o
C trong 3 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm. Tính kết quả theo
% khối lượng hoặc % khối lượng trên thể tích [7].
2.3.4.4. Tro toàn phần: xác định theo phụ lục 9.8 DĐVN IV:
Lấy chính xác 3g cao đặc hỗn hợp cho vào chén sứ đem đi nung nóng ở 450
o
C đến
tro hoàn toàn (tro màu trắng), lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, đem cân.

2.3.4.5. Xác định pH của dung dịch cao đặc pha loãng thành nồng độ 1% (g/ml):
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1g cao, hòa tan bằng nước cất cho vừa đủ 100ml.
Xác định giá trị pH của dung dịch này bằng máy đo pH Eutech Instruments pH 510.
2.3.4.6. Giới hạn nhiễm khuẩn: thử theo phụ lục 13.6 DĐVN IV
- Chuẩn bị thí nghiệm: Môi trường và dung dịch NaCl 0,9 % được hấp tiệt trùng ở
121
o
C trong 15 phút.
Môi trường và dung dịch dùng là môi trường thạch thường, môi trường thạch
Sabouraud, môi trường canh thang lactose, môi trường lỏng casein đậu tương và
môi trường lỏng lactose.
- Đếm số lượng vi khuẩn hiếu khí và vi nấm:
Cân 10,00 g mẫu thử nghiệm thêm 90 ml dung dịch NaCl 0,9%, lắc đều trong 45
phút, thu được dịch thử nghiệm có độ pha loãng 10
-1
(dung dịch X). Pha loãng dung
dịch X thành dung dịch có độ pha loãng 10
-2
, 10
-3
. Cấy 1,0 ml dịch thử nghiệm vào
các đĩa petri vô trùng. Mỗi độ pha loãng và mỗi loại môi trường tiến hành trên 2 đĩa
petri vô trùng. Thêm 15 – 20 ml môi trường thạch thường hoặc môi trường
Sabouraud, trộn đều, để môi trường đông khô ở nhiệt độ thường, lật úp đĩa. Ủ đĩa
phát hiện vi khuẩn ở 30–35
0
C/24 - 48h, vi nấm ở 20 – 25
0
C/5 ngày. Sau thời gian ủ,
kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số khuẩn lạc tạo thành.

- Tìm vi khuẩn gây bệnh:
+ Thử nghiệm được tiến hành trong buồng thổi khí sạch
+ Cấy 10,0 ml dung dịch X vào 100 ml môi trường Casein – đậu tương lỏng ủ ở 30-
35
0
C/24-48h để phát hiện sự có mặt của Staphylococcus aureus và Pseudomonas
aeruginosa. Kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường.